基因工程原理-第二章DNA重組ppt課件

1、基因工程原理Principle of Gene Engineering 第一章第一節(jié)基因工程原理第二章 第二章 DNA重組第一部分 DNA的組成和構(gòu)造1.1 DNA的組成1.2 DNA的空間構(gòu)造線形DNA：環(huán)形DNA：1.3 DNA復(fù)制半保管復(fù)制方式復(fù)制起始位點(diǎn)replication origin sitebiobar.hbhcgz/Article/ShowArticle.asp?ArticleID=20877 原核生物DNA的復(fù)制 解旋酶單鏈結(jié)合蛋白DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶引物酶DNA聚合酶DNA銜接酶biobar.hbhcgz/Article/ShowArticle.asp?ArticleID=2

2、0876 真核生物DNA的復(fù)制 復(fù)制子從復(fù)制起始點(diǎn)開場(chǎng)復(fù)制出的一個(gè)DNA分子或一個(gè)DNA片段的核苷酸序列。復(fù)制子的數(shù)量原核生物的染色體DNA：?jiǎn)蝹€(gè)真核生物染色體DNA：多個(gè)質(zhì)粒DNA：?jiǎn)蝹€(gè)、多個(gè)1.4 DNA轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄區(qū)的構(gòu)造啟動(dòng)子：Promotor，DNA分子上能與RNA聚合酶結(jié)合并構(gòu)成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合體的區(qū)域，在許多情況下，還包括促進(jìn)這一過程的調(diào)理蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。 Pribnow box5-AGGAGG-3SD序列Shine-Dalgarno sequence; SD sequence 1974年，由J.Shine和L.Dalgarno發(fā)現(xiàn)SD序列：在細(xì)菌mRNA起始密碼子AUG上游10

3、個(gè)堿基左右處，有一段富含嘌呤的堿基序列，能與細(xì)菌16SrRNA3端識(shí)別，協(xié)助從起始AUG處開場(chǎng)翻譯。Pribnow box5-AGGAGG-3SD序列1.5 DNA轉(zhuǎn)錄終止子transcription terminator終止子Terminator是一段位于基因或支配組末端的DNA片段，可中斷轉(zhuǎn)錄作用。原核生物擁有兩種類型的終止子，包括：本體轉(zhuǎn)錄終止子Intrinsic transcription terminators：-依賴轉(zhuǎn)錄終止子Rho-dependent transcription terminators：不依賴于蛋白質(zhì)輔因子就能實(shí)現(xiàn)終止作用。依賴蛋白輔因子才干實(shí)現(xiàn)終止作用。這種蛋白

4、質(zhì)輔因子稱為釋放因子，通常又稱因子，與RNA螺旋酶蛋白復(fù)合物。兩類終止子有共同的序列特征：在轉(zhuǎn)錄終止點(diǎn)前有一段回文序列。富含GC回文序列：雙鏈DNA中含有的兩個(gè)構(gòu)造一樣、方向相反的序列稱為反向反復(fù)序列，當(dāng)該序列的雙鏈被翻開后，可構(gòu)成部分“十字形構(gòu)造。這段序列被稱為回文序列。1.6天然DNA的來源和用途染色體DNA：分別目的基因的主要資料，1000106kb病毒DNA：用于構(gòu)建基因克隆載體,T4、質(zhì)粒DNA：用于構(gòu)建基因克隆載體線粒體DNA：呼吸作用的基因葉綠體DNA：光協(xié)作用的基因存在與生物體內(nèi)的DNA1大腸桿菌源質(zhì)粒DNA的提取2噬菌體DNA的提取3氯化銫法制備植物基因組DNA1.7 天然D

5、NA的的提取 適宜的生物資料裂解細(xì)胞分別DNA純化核檢測(cè)1大腸桿菌源質(zhì)粒DNA的提取松弛型質(zhì)粒：加氯霉素嚴(yán)緊型質(zhì)粒：不加氯霉素2噬菌體DNA的提取1.8 DNA的純化氯化銫-溴化乙錠延續(xù)梯度離心法離子交換層析法瓊脂糖凝膠電泳洗脫法“基因純?cè)噭┘兓瘡腄NA樣品中去掉EB2.2.4 DNA濃縮2.2.5 DNA純度檢測(cè)第三次課終了！第二部分 基因工程工具酶基因工程工具酶限制性核酸內(nèi)切酶DNA銜接酶和激酶DNA聚合酶和RNA聚合酶DNA和RNA修飾酶。一、序列特異的DNA限制性內(nèi)切核酸酶 (Restriction endonuclease, RE 指可以識(shí)別雙鏈DNA分子中特殊核苷酸序列，并使每條鏈

6、的一個(gè)磷酸二酯鍵斷開的核酸內(nèi)切酶。來源：原核生物種類：500多種作用：把外源DNA切割成片段。第一型Type I：能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解第二型Type II：只催化非甲基化的DNA的水解第三型Type III同時(shí)具有修飾及認(rèn)知切割的作用限制性內(nèi)切酶的命名和書寫：Hind III細(xì)菌屬名細(xì)菌種名菌株酶編號(hào)Haemophilus influenzae dRE的功能:防御外源DNA感染,利于遺傳的穩(wěn)定性RE抑制了細(xì)菌種屬間的交叉繁衍,但甲基化酶的某些誤差,又使得不同菌株間DNA的重組成為能夠,利于生物的進(jìn)化.1968年,從大腸桿菌中分別到了I型RE,1970年,從大腸

7、桿菌中分別到了II型RERE的發(fā)現(xiàn)：3.1.1限制性核酸內(nèi)切酶作用機(jī)制OH3P-55P3HO1在DNA分子雙鏈的特異性識(shí)別序列部位,切割DNA分子,構(gòu)成鏈的斷裂.識(shí)別序列:又叫靶子序列,是由4-8個(gè)核苷酸組成的特定核苷酸序列. 3.1.2限制性核酸內(nèi)切酶的識(shí)別序列旋轉(zhuǎn)對(duì)稱或二重互補(bǔ)對(duì)稱延續(xù)的:例如：5A B C C B A33A B C C B A5延續(xù)的:5A B N B A33 A B N B A5EcoR IBamH IGAATTCCTTAAGGGATCCCCTAGG2識(shí)別序列在DNA分子上出現(xiàn)的頻率例如：識(shí)別序列核苷酸個(gè)數(shù)出現(xiàn)識(shí)別序列的幾率41/44 （1/256）61/46 (1/4

8、096)DNA長(zhǎng)49000bp，Bgl II的識(shí)別序列為AGATCT所以實(shí)際上在DNA中， Bgl II識(shí)別序列應(yīng)該出現(xiàn)： 49000/4096=12次。 實(shí)踐上，僅出現(xiàn)6次。同裂酶(isoschizomer)-來源不同,但識(shí)別同樣的核苷酸靶子序列. 例如:Hpa II和Msp I的識(shí)別序列都為5.CC GG.33.GG CC.5 BamH I：5 GGATCC 3Bcl I： 5 TGATCA 3Bgl II ： 5 AGATCT 3 同尾酶(isocaudamer)-來源不同,識(shí)別的核苷酸靶子序列不同,但產(chǎn)生一樣的粘性末端. 例如:Bam HI, Bcl I, Bgl II是一組同尾酶切割

9、后的末端是GATC.3.1.3 限制性核酸內(nèi)切酶切割DNA的位點(diǎn)多數(shù)在識(shí)別序列內(nèi)部。環(huán)形DNA切割后的片段數(shù)：N 線形DNA切割后的片段數(shù)：N+1DNA片段末端種類：粘性末端：磷酸二酯鍵斷裂位置是交錯(cuò)的平末端：斷裂位置在對(duì)稱軸切割位點(diǎn)表示方法5-CTGCAG-33-GACGTC-5Pst I可以表示為：5-CTGCA G-3反響總體積：20微升酶的用量緩沖液的組成與酶的種類有關(guān)反響時(shí)間1-3小時(shí)。3.1.4限制性核酸內(nèi)切酶反響系統(tǒng)例： Bgl 對(duì)DNA的消化13 mL蒸餾水 2 mL 10 x緩沖液4 mL 底物DNA1 mL RE37，1-3小時(shí)依次參與：混勻離心升溫，使酶失活6510-15

10、min 除去酶蛋白限制性酶切反響普通流程底物DNA：DNA純度DNA分子構(gòu)型識(shí)別位點(diǎn)側(cè)面序列位點(diǎn)偏愛DNA甲基化酶的用量酶的活性底物DNA：位點(diǎn)數(shù)量規(guī)范緩沖液的組成：緩沖液系統(tǒng)MgCl2或醋酸鎂NaCl或KClTris-HCl-巰基乙醇或二硫蘇糖醇DTT反響溫度：大多數(shù)是37，少數(shù)或高或低Star活性：某些限制性核酸內(nèi)切酶在特定條件下，可以在不是原來的識(shí)別序列處切割DNA。3.1.5 限制性核酸內(nèi)切酶的Star活性4二、DNA銜接酶DNA銜接酶能催化雙鏈DNA片段緊靠在一同的3-OH和5-P基團(tuán)末端之間構(gòu)成磷酸二酯鍵，使兩末端銜接。假設(shè)是兩個(gè)或兩個(gè)以上不同雙鏈DNA片段末端銜接，那么產(chǎn)生重組D

11、NA分子。3.2 DNA銜接酶缺口nick55335533DNA銜接酶5533DNA銜接酶裂口gap5533nick2酶-AMP復(fù)合物中的AMP與DNA鏈上的5P結(jié)合，構(gòu)成DNA-腺苷酸復(fù)合物，P活潑起來33OH對(duì)活潑的P作親核攻擊，結(jié)果構(gòu)成磷酸二酯鍵。1DNA銜接酶與輔助因子ATP或NAD+反響,生成酶-腺苷酸復(fù)合物.3.2.1 DNA銜接酶的作用機(jī)理E.coli DNA 銜接酶 T4 DNA 銜接酶但效率較低3.2.2 目前常用的DNA銜接酶1條DNA鏈具有3-OH,另1條DNA鏈具有5-P,而且3-OH 與5-P是相鄰的.3-OH 與5-P位于與互補(bǔ)鏈上的互補(bǔ)堿基配對(duì)的兩個(gè)脫氧核苷酸的末

12、端.吸能反響: E.coli DNA 銜接酶需求NAD+，T4 DNA 銜接酶需求ATP.3.2.3 DNA銜接酶作用條件缺口nick55335533DNA銜接酶5533DNA銜接酶裂口gap5533反響溫度：37酶用量：平末端1-2unit 粘性末端0.1unitATP：10mol/L1mmol/Lbuffer：Tris-HCl，KCl，DTT，BSADNA銜接酶反響條件具互補(bǔ)粘性末端片段之間的銜接具平末端DNA片段之間的銜接DNA片段末端修飾后進(jìn)展銜接3.2.4 DNA片段之間的銜接方式具互補(bǔ)粘性末端片段之間的銜接具平末端DNA片段之間的銜接DNA片段末端修飾后進(jìn)展銜接DNA片段末端同聚物

13、加尾后進(jìn)展銜接粘性末端修飾成平末端后銜接DNA片段5段磷酸化作用后銜接DNA片段末端同聚物加尾后進(jìn)展銜接粘性末端修飾成平末端后銜接DNA片段5端脫磷酸化作用后銜接5 催化以DNA單鏈為模板，以4種脫氧核糖核苷酸為底物，合成一條與模板序列互補(bǔ)的DNA新鏈的酶。三、DNA聚合酶DNA聚合酶包括：大腸桿菌DNA聚合酶I大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow大片段酶T4 DNA聚合酶T7 DNA聚合酶修飾的T4 DNA聚合酶逆轉(zhuǎn)錄酶耐熱性DNA聚合酶一耐熱性DNA聚合酶1956年，美國(guó)Kornberg從大腸桿菌中分別出來。由大腸桿菌基因polA編碼，單鏈多肽蛋白質(zhì)。分子量：109 kD球形，65埃二大腸

14、桿菌DNA聚合酶IE.coli DNA pol I1. DNA聚合酶I反響需求的條件:全部4種脫氧核苷三磷酸,和Mg+. dATP dCTP dTTP dGTP帶有3-OH游離基團(tuán)的引物鏈. 2. DNA聚合酶I催化的反響(1)聚合反響:53方向DNA聚合酶I催化的聚合反響是在引物鏈3-OH與dNTP分子的-P-基團(tuán)間.dNTP接上后,又提供了1個(gè)3-OH末端,繼續(xù)銜接dNTP分子.合成方向是5 3DNA聚合酶I的聚合反響機(jī)理引物模板PPi(2) 5 3核酸外切酶活性:pol Ipol I(3) 3 5核酸外切酶活性:polI3、DNA聚合酶I在基因工程中的運(yùn)用DNA缺口轉(zhuǎn)移nick tran

15、slation反響用于分子克隆。制備高比活的DNA探針。DNA聚合酶I的5-3核酸外切酶活性3355nick3-OH 5-P缺口雙鏈DNA聚合酶I 的聚合活性3355nick3-OH 5-P切去1個(gè)5核苷酸在3-OH上加上新的核苷酸3355nick3-OH 5-P32P標(biāo)志的核苷酸DNA缺口轉(zhuǎn)移線狀分子DNaseI切斷DNA鏈DNA聚合酶I 5-3核酸外切酶活性DNA聚合酶I 的聚合活性構(gòu)成1條具有32P標(biāo)志的合成DNA鏈標(biāo)志探針在5端切去1個(gè)核苷酸切出1個(gè)缺口在3-OH加上1個(gè)32P標(biāo)志的核苷酸32P標(biāo)志的核苷酸制備高比活的DNA探針25l1 g純化的目的基因DNA片段；適量的DNaseI；

16、DNA聚合酶；32P-dNTPs；dNTPs；典型的反響體系：二大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段與DNA末端標(biāo)志Klenow聚合酶的特點(diǎn)：分子量：76103dal具有聚合酶的活性具有3-5的核酸外切酶的活性。DNA聚合酶IMW：34103 dal： 53核酸外切酶活性。MW：76103 dal：Klenow片段酶，保管DNA聚合酶活性和35核酸外切酶活性?？莶輻U菌蛋白酶Klenow聚合酶的運(yùn)用：cDNA克隆中第二鏈合成的催化補(bǔ)平雙鏈DNA的3凹端。標(biāo)志DNA片段的末端：帶標(biāo)志的dNTPDNA序列測(cè)定：Sanger末端終止法cDNA的合成第二鏈DNA的合成加SalI銜接物加EcoRI銜接

17、物與pUC重組cDNA克隆中第二鏈合成的催化5GATCT 33 A 55GATCT 33 32P-GA 55GATCT 3332P-AGA 5具有3隱蔽末端的DNA片段Klenow酶， 32P-GTP 參與的種類根據(jù)5末端決議Klenow酶， 32P-GTP， 32P-ATP補(bǔ)平雙鏈DNA的3凹端。標(biāo)志DNA片段的末端：帶標(biāo)志的dNTPDNA序列測(cè)定：Sanger末端終止法CGTACCTCGTTCATGACAAGCGTCTCAddGAGTddCGCAGAGTddTGTTCGCAGAGTddACTGTTCGCAGAGT*Klenow片段三T4 DNA聚合酶從T4噬菌體中分別的噬菌體基因43編碼具

18、有53聚合酶活性具有35核酸外切酶活性，是Klenow片段的200倍左右。取代反響。取代反響特點(diǎn)：當(dāng)反響混合物中沒有dNTP時(shí)，T4DNA聚合酶只需3-5核酸外切酶活性，從3-OH端降解DNA。當(dāng)反響混合物中僅有1種dNTP時(shí)，3端降解在暴顯露互補(bǔ)的核苷酸時(shí)停頓。32P標(biāo)志的核苷酸5533A T C G T A C A GT A G C A T G T C5533A T C G T A C C A T G T C5533A T C G T A C A GT A G C A T G T GT4 DNA聚合酶，dGTP具有3-OH末端的DNA片段參與32P dNTPs32P標(biāo)志的核苷酸逐漸取代了外切酶刪掉的原有核苷酸取代反響。四反轉(zhuǎn)錄酶把RNA轉(zhuǎn)錄成DNA的酶。又叫依賴RNA的DNA聚合酶，或RNA指點(diǎn)的DNA聚合酶。1970年發(fā)現(xiàn)，在多種腫瘤病毒中發(fā)現(xiàn)，常見的AMV鳥類骨髓母細(xì)胞瘤病毒的反轉(zhuǎn)錄酶。包括： 鏈：65 103dal 鏈：95 103dalDNAmRNAprotein轉(zhuǎn)錄翻譯反轉(zhuǎn)錄自我復(fù)制酶活性：RNA指點(diǎn)的DNA聚合酶活性DNA指點(diǎn)的DNA聚合酶活性RNase H活性： RNase H是一種專門切割DNA與RNA雜交鏈上RNA分子的酶RNA模板DNA引物AMVDNARNAAMVAMV 催化以DNA和RNA為模板，以4種三磷酸核苷ATP、UTP、CTP、