藥物分析第4章藥物定量分析與分析方法驗證

1、 第四章 藥物定量分析與分析方法驗證 第一節(jié) 定量分析樣品的前處理方法 第二節(jié) 定量分析方法特點第三節(jié) 藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證第四節(jié) 生物樣品分析方法的基本要求返回主目錄基本要求練習(xí)與思考精選ppt基本要求 一、掌握定量分析方法驗證的效能指標(biāo)。 二、熟悉定量分析樣品的前處理方法。 三、了解定量分析樣品的前處理方法的進展 及在藥物分中的應(yīng)用。返 回精選ppt 第一節(jié) 定量分析樣品的前處理方法 一、概述 1.為什么要對定量分析的樣品進行前處理？ 含鹵素有機藥物 R-X （F，Cl, Br, I ） 金屬有機藥物 R-O-Me（有機酸或酚的 含金屬有機藥物 金屬鹽；結(jié)合不牢固） 有機金屬藥物 R-

2、Me （結(jié)合牢固） 2. 常用的處理方法 不經(jīng)有機破壞的分析方法 藥物分析中常用的分析方法 經(jīng)有機破壞的分析方法精選ppt二、不經(jīng)有機破壞的分析方法（一）直接測定法 例如：富馬酸亞鐵 溶于熱稀礦酸，采用鈰量法 ，鄰二氮菲作指示劑 精選ppt（二）經(jīng)水解后測定法 1. 直接回流后測定法 例如：三氯叔丁醇的含量測定 CCl3-C(CH3)2-OH + 4NaOH (CH3)2CO +3NaCl + HCOONa +2H2O NaCl + AgNO3 AgCl + NaNO3 AgNO3 + NH4SCN AgSCN + NH4NO3 2. 用硫酸水解后測定法 例如：硬脂酸鎂的含量測定 Mg(C17

3、H35COO)2 + H2SO4 MgSO4 + 2C17H35COOH H2SO4 + 2NaOH Na2SO4 + 2H2O 精選ppt（三）經(jīng)氧化還原后測定法 1. 堿性還原后測定 例如：泛影酸的含量測定 2. 酸性還原后測定 例如：碘番酸的含量測定 Zn還原 后銀量法 精選ppt 3. 利用藥物中可游離的金屬離子的氧化性測定含量 （1）含銻藥物 例如：葡萄糖酸銻的含量測定 Sb5+ + 2KI Sb3+ + 2K+ + I2 I2 + 2Na2S2O3 2NaI + Na2S4O6 （2）含鐵藥物 2Fe3+ + 2KI 2Fe2+ + 2K+ + I2 I2 + 2Na2S2O3 2

4、NaI + Na2S4O6H+精選ppt 三、經(jīng)有機破壞的分析方法 濕法破壞 藥物分析中常用的有機破壞的方法有 干法破壞 HNO3-HClO4法 氧瓶燃燒法(一)濕法破壞 HNO3-H2SO4法 H2SO4-硫酸鹽法 HNO3- H2SO4-HClO4法； H2SO4-H2O2； H2SO4-KMnO4(二)干法破壞 加Na2CO3或MgO以助灰化；溫度控制在420 精選ppt (三)氧燃瓶燃燒法(oxygen flask combustion method) 1. 儀器裝置 500ml, 1000ml, 2000ml, 磨口、硬質(zhì)玻璃錐形瓶 2. 稱樣 固體樣；液體樣要求詳見P68 3. 燃

5、燒分解操作法 4. 吸收液的選擇 用于X、S、Se等的鑒別、檢查、含量測定時 多數(shù)是H2O或H2O-NaOH；少數(shù)為H2O-NaOH-H2O2.精選ppt應(yīng)用示例：碘苯酯的測定返 回精選ppt第二節(jié) 定量分析方法特點 一、容量分析法 （一）容量分析法的特點 操作簡單、快速； 比較準(zhǔn)確（RSD0.2%）； 儀器普通易得。精選ppt（二）容量分析法的計算問題 1. 滴定度（T）的概念 每1mlmol溶液相當(dāng)于被測物質(zhì)的量(mg) 2. 滴定度的計算 aA + bB cC + dD T = Mb/aB 3. 百分含量的計算 （1）直接滴定法 D% = V F T/W 100% F = 實際標(biāo)定的濃度

6、/規(guī)定的濃度 （2）間接滴定法（回滴定法；剩余滴定法） D% = （VO VB) F T/W 100%精選ppt 二、光譜分析法 （一）紫外-可見分光光度法（200nm760nm) 靈敏度高，可達10-4g/ml 10-7g/ml 1. 特點 準(zhǔn)確度高，SRD（%）為2% 5% 儀器價格低廉，操作簡單，易普及，應(yīng)用 范圍廣。 2. 朗伯-比耳定律 A = ECL E1%1cm = 10/M精選ppt 3. 儀器校正和檢定 波長校正用汞燈中較強譜線237.38,253.65,275.28,296.73, 313.16,334.15,365.02,404.66,425.83,546.07nm與57

7、6.96nm 或用儀器中氘燈的486.02nm與656.10nm進行校正。 吸收度的檢定：用K2CrO7(60mg)+0.005mol/LH2SO4液至1000ml 波長(nm) 235(最小) 257(最大) 313(最小) 350(最大) E1%1cm 124.5 144.0 48.62 106.6 雜散光檢查： 試劑 濃度(g/ml) 測定波長 透光率(%) NaI 1.00 220nm 0.8 NaNO2 5.00 340nm 0.8精選ppt 4. 對溶劑的要求: 220240nm 241250nm 251300nm 300nm以上 溶劑+吸收池A 0.41 0.20 0.10 0.

8、05 5. 測定方法 要求供試品溶液的A應(yīng)在0.3 0.7 對照品比較法：Cx=(Ax/Ar)Cr; 含量%=CxD/W100 % 常用方法 吸收系數(shù)法： 含量%= (E1%1cm )x/(E1%1cm )r 100 % 計算分光光度法：VA的三點校正法精選ppt （二）熒光分光光度法 靈敏度高，可達10-10g/ml 10-12g/ml 在低濃度進行測定，防止F與C不成正比及自熄滅作用 1. 特點 用基準(zhǔn)物溶液校正儀器靈敏度，防止樣品液熒光衰減 靈敏度高，但干擾因素多。 制備熒光衍生物，可提高其靈敏度和選擇性。 用樣品量少，操作簡單，方法快速，應(yīng)用范圍較廣。 精選ppt2. 熒光分析儀 有二

9、個單色光器激發(fā)單色光器與發(fā)射單色光 器；且激發(fā)光源、樣品池和檢測器成直角。3. 含量測定 常用的方法對照品比較法:Ci = (Ri-Rib)/(Rr-Rrb) Cr Ch.P收載地高辛片、利血平片、洋地黃毒苷片。精選ppt 三、色譜分析法 按分離原理分為：吸附；分配；離子交換；排阻色譜 方法分類 按分離方法分為：PC；TLC；柱色譜；GC；HPLC。 （一）HPLC法 1. 對HPLC儀器一般要求 色譜柱、流動相按品種項下要求。 色譜柱的理論板數(shù)：n = 5.54(tR /Wh/2)2 2. 系統(tǒng)性試驗 分離度：R = 2（tR1 tR2)/(W1 + W2); 要大于1.5 拖尾因子：T =

10、 W0.05h/2d1 應(yīng)在0.9 1.05 精選ppt 內(nèi)標(biāo)法加校正因子測定供試品中主成分含量3. 測定方法 標(biāo)準(zhǔn)曲線法 外標(biāo)法測定供試品中主成分含量 外標(biāo)一點法 應(yīng)用示例： RP-HPLC法測定鹽酸黃酮哌酯片含量，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法 如頭孢拉??；頭孢羥氨芐；頭孢唑啉鈉用外標(biāo)一點法精選ppt （二）GC法 1. 對GC儀器一般要求 載氣為氮氣；色譜柱為填充或毛細管柱 色譜柱的理論板數(shù)：n = 5.54(tR /Wh/2)2 2. 系統(tǒng)性試驗 分離度：R = 2（tR1 tR2)/(W1 + W2); 要大于1.5 拖尾因子：T = W0.05h/2d1 應(yīng)在0.9 1.05 精選ppt 內(nèi)標(biāo)法加校

11、正因子測定供試品中主成分含量 3. 測定方法 標(biāo)準(zhǔn)曲線法 外標(biāo)法測定供試品中主成分含量 外標(biāo)一點法 應(yīng)用示例： Ch.P(2000)收載的月桂卓酮、維生素E及其片劑、注 射劑、甲酚皂溶液等均采用GC法中的內(nèi)標(biāo)法加校正 因子測定含量。返 回精選ppt 第三節(jié) 藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證 一、準(zhǔn)確度 是指用該方法測定結(jié)果與真實值接近的程度，用回收率表示（一）含量測定方法的準(zhǔn)確度 1. 原料藥 可用已知純度對照品或樣品進行測定；或與已建準(zhǔn)確 度的另一方法測定的結(jié)果進行比較。 2. 制劑 要考察輔料對回收率的影響。采用在空白輔料中加入原 料對照品的方法作回收率試驗，然后計算RSD。 具體做法：測定高、中

12、、低三個濃度，n=3, 共9個數(shù)據(jù)來評價 回收率的RSD2%；用UV和HPLC發(fā)時，一般回 收率可達98%102%；容量法可達99.7%100.3% 精選ppt（二）數(shù)據(jù)要求 回收率% = （測定平均值 空白值）/加入量100% 要求制備高、中、低三濃度的樣品，各測定3次。應(yīng)報告已知加入量的回收率，或測定結(jié)果平均值與真實值之差及其可信限。精選ppt 二、精密度 是指在規(guī)定的測試條件下，同一個均勻樣品，經(jīng)多次測定結(jié)果 之間的接近程度。 （一）精密度表示方法 1. 偏差(deviation , d) d = 測得值-平均值=Xi-X 2. 標(biāo)準(zhǔn)偏差（standard deviation, SD或S

13、） S =(Xi X)2/(n-1)1/2 3. 相對標(biāo)準(zhǔn)差(relative standard deviation, RSD)也稱變異系數(shù) (coefficient of variation, CV) RSD=標(biāo)準(zhǔn)偏差/平均值100%=S/X 100%精選ppt（二）重復(fù)性、中間精密度及重現(xiàn)性 1. 重復(fù)性 在相同條件下,由一個分析人員測定所得結(jié)果的精密度. 2. 中間精密度 在同一個實驗室，不同時間由不同分析人員用不 同設(shè)備測定結(jié)果的精密度。 3. 重現(xiàn)性 在不同實驗室由不同分析人員測定結(jié)果的精密度。精選ppt（三）數(shù)據(jù)要求 應(yīng)報告S或SD、RSD和可信限。用統(tǒng)計學(xué)的可信性分析(t或f）。

14、精選ppt 三、專屬性 是指在其他成分(如雜質(zhì)、降解產(chǎn)物、輔料等)可能存在下， 采用的方法能準(zhǔn)確測定出被測物的特性。鑒別反應(yīng)、雜質(zhì)檢 查、含量測定方法，均應(yīng)考察其專屬性。 （一）鑒別反應(yīng) 應(yīng)能與其它共存的物質(zhì)或相似化合物區(qū)分，不含被測組分 的樣品均應(yīng)呈現(xiàn)負反應(yīng)。精選ppt （二）含量測定和雜質(zhì)測定 色譜法和其他分離法，應(yīng)附代表性的圖譜，以說明專屬性。 圖中應(yīng)注明各組分的位置，色譜法中分離度應(yīng)符合要求。在能 獲得雜質(zhì)的情況下，可加到試樣中，考察對結(jié)果的干擾。在雜 質(zhì)和降解物不能獲得的情況下，可用以驗證方法和藥典方法進 行對照；也可用對試樣加速破壞的方法，比較兩種方法。精選ppt 四、檢測限（li

15、mit of detection, LOD) 是指試樣中被測物能被檢測出的最低濃度或量，是限度檢驗 指標(biāo)。它無需測定，只要指出高于或低于該規(guī)定的濃度或量即可。 （一）常用的方法 1.非儀器分析目視法 用已知濃度被測物，試驗出能被可靠地 檢測出的最低濃度或量。 2.儀器分析方法 UV法：LOD = f.3S空 = C樣/A樣 3S空 Flu法：LOD = f.3S空 = C樣/(F樣-F空) 3S空 GC和HPLC法： LOD = S/N = 2或3 精選ppt（二）數(shù)據(jù)要求 應(yīng)附測試圖，說明測試過程和檢測限結(jié)果。 精選ppt 五、定量限（limit of quantitation, LOQ)

16、是指樣品中被測物能被定量測定的最低量，其測定結(jié)果應(yīng) 具一定準(zhǔn)確度和精密度。雜質(zhì)和降解產(chǎn)物進行定量測定時，要求 LOQ.常用信噪比法確定定量限，一般以S/N=10時相應(yīng)的濃度進行 測定。精選ppt 六、線性 是指在設(shè)定的范圍內(nèi)，測試結(jié)果與試樣中被測物濃度直接 呈正比關(guān)系的程度。 UV法：首先制備一個標(biāo)準(zhǔn)系列，濃度點n =5; A = 0.3.0.7 建立回歸方程C = aA + b ;r 0.9999。 HPLC法：制備一個標(biāo)準(zhǔn)系列，濃度點n =5 7; 以C對h或A或與 內(nèi)標(biāo)物的峰面積之比，建立回歸方程r 0.9999。精選ppt七、范圍 是指達到一定精密度、準(zhǔn)確度和線性、測試方法適用的高低限

17、度或量的區(qū)間。 原料藥和制劑含量測定：范圍應(yīng)為測試濃度的80%- 120%。 制劑含量均勻度檢查：范圍應(yīng)為測試濃度的70%- 130%。 溶出度或釋放度中的溶出量測定：范圍應(yīng)為限度的20%。精選ppt 八、耐用性 是指在測定條件下有效的變動時，測定結(jié)果不受影響的承受 程度。典型的變動因素有：被溶液的穩(wěn)定性、樣品提取次數(shù)、時 間等。 HPLC法變動因素有：流動相組成與pH，色譜柱，柱溫，流速等。 GC法變動因素有：色譜柱，固定相，擔(dān)體、柱溫、進樣口和檢 測器溫度等。精選ppt 分析方法效能指標(biāo)的具體應(yīng)用： 1. 用于鑒別試驗的方法：只要求專屬性、耐用性，其余不要求。 2. 用于原料藥中雜質(zhì)測定和

18、制劑中降解產(chǎn)物測定的方法： 用于定量：除了檢測限不要求外，其余七項指標(biāo)均要求。 限度檢查：除檢測限、專屬性、耐用性要求外，其余不要求。 3. 原料、制劑及溶出度測定：不要求檢測和定量限，其余均要求。返 回精選ppt 第四節(jié) 生物樣品分析方法的基本要求 一、常用樣品的種類、采集和貯張 二、生物樣品分析前處理技術(shù) 三、定量分析方法驗證 返 回精選ppt練習(xí)與思考A型題 1 藥品的鑒別是證明 A未知藥物的真?zhèn)?B已知藥物的真?zhèn)?C已知藥物的療效 D藥物的純度 E藥物的穩(wěn)定性2相對標(biāo)準(zhǔn)差表示的應(yīng)是A準(zhǔn)確度 B回收率 C精密度 D純凈度 E限度精選ppt3用移液管量取的25ml溶液，應(yīng)記成A25ml B25.0ml C25.00ml D25.000ml E251ml4以下三個數(shù)字0.5362、0.0014、0.25之和應(yīng)為A0.79 B0.788 C0.787 D0.7876 E0.8精選ppt5表示兩變量指標(biāo)A與C之間線性相關(guān)程度常用A相關(guān)規(guī)律 B比例常數(shù) C相關(guān)常數(shù) D相關(guān)系數(shù) E精密度6減小偶然誤差的方法是A做空白試驗 B做對照實驗 C做回收試驗 D增加平行測定次數(shù) E選用多種測定方法精選pptB型題 14A1.23 B1.22 C2.54 D2.53 E2.5111.225222.535132.534842.5068ACDE精選p