最常用的20個生物實驗技術及原理

1、最常用的20個生物實驗技術及原理一、mRNA的分離與純化（寡聚(dT)纖維素柱純化mRNA）真核細胞的mRNA分子最顯著的結構特征是具有5端帽子結構（m7G）和3端的Poly(A)尾巴。絕大多數(shù)哺乳類動物細胞mRNA的3端存在20-30個腺苷酸組成的Poly（A）尾，通常用Poly（A+）表示。這種結構為真核mRNA的提取，提供了極為方便的選擇性標志，寡聚（dT）纖維素或寡聚（U）瓊脂糖親合層析分離純化mRNA的理論基礎就在于此。mRNA的分離方法較多，其中以寡聚（dT）-纖維素柱層析法最為有效，已成為常規(guī)方法。此法利用mRNA3末端含有Poly（A+）的特點，在RNA流經(jīng)寡聚（dT）纖維素柱

2、時，在高鹽緩沖液的作用下，mRNA被特異地結合在柱上，當逐漸降低鹽的濃度時或在低鹽溶液和蒸餾水的情況下，mRNA被洗脫，經(jīng)過兩次寡聚（dT）纖維柱后，即可得到較高純度的mRNA。二、RNA酶保護試驗方法(RNaseProtectionAssay，RPA)RNA酶保護法是近十年發(fā)展起來的一種全新的mRNA定量分析方法?；驹恚簩擞浀奶禺怰NA探針（32P或生物素）與待測的RNA樣品液相雜交，標記的特異RNA探針按堿基互補的原則與目的基因特異性結合，形成雙鏈RNA；未結合的單鏈RNA經(jīng)RNA酶A或RNA酶T1消化形成寡核糖核酸，而待測目的基因與特異RNA探針結合后形成雙鏈RNA，免受RNA酶的

3、消化，故該方法命名為RNA酶保護實驗。與Northernblot和RT-PCR比較，RPA有以下幾個優(yōu)點：1.檢測靈敏度比Northern雜交高。由于Northern雜交步驟中轉膜和洗膜都將造成樣品和探針的損失，使靈敏度下降，而RPA將所有雜交體系進行電泳，故損失小，提高了靈敏度。2.由于PCR擴增過程中效率不均一和反應“平臺”問題，基于PCR產(chǎn)物量進行分析所得數(shù)據(jù)的可靠性將下降，而RPA沒有擴增過程，因此，分析的數(shù)據(jù)真實性較高。3.由于與反義RNA探針雜交的樣品RNA僅為該RNA分子的部分片段，因此，部分降解的RNA樣品仍可進行分析。4.步驟較少，耗時短。與Northern雜交相比，省去了轉

4、膜和洗膜的過程。5.RNA-RNA雜交體穩(wěn)定性高，無探針自身復性問題，無須封閉。6.一個雜交體系中可同時進行多個探針雜交，無競爭性問題。7.檢測分子長度可以任意設置，靈活性大。RPA的缺點是需要同位素標記探針。三、染色質免疫共沉淀技術（ChromatinImmunoprecipitation，ChIP）基本原理：在生理狀態(tài)下把細胞內的DNA與蛋白質交聯(lián)在一起，通過超聲或酶處理將染色質切為小片段后，利用抗原抗體的特異性識別反應，將與目的蛋白相結合的DNA片段沉淀下來。染色質免疫沉淀技術一般包括細胞固定，染色質斷裂，染色質免疫沉淀，交聯(lián)反應的逆轉，DNA的純化及鑒定。ChIP是研究體內蛋白質與DN

5、A相互作用的有力工具，利用該技術不僅可以檢測體內反式因子與DNA的動態(tài)作用，還可以用來研究組蛋白的各種共價修飾以及轉錄因子與基因表達的關系。四、基因芯片（又稱DNA芯片、生物芯片）技術基因芯片指將大量探針分子固定于支持物上后與標記的樣品分子進行雜交，通過檢測每個探針分子的雜交信號強度進而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息。通俗地說，就是通過微加工技術，將數(shù)以萬計、乃至百萬計的特定序列的DNA片段（基因探針），有規(guī)律地排列固定于2cm2的硅片、玻片等支持物上，構成的一個二維DNA探針陣列，被稱為基因芯片?；蛐酒饕糜诨驒z測工作?；驹恚弘s交測序方法，即通過與一組已知序列的核酸探針雜交進行核酸序

6、列測定的方法，在一塊基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探針。當溶液中帶有熒光標記的核酸序列TATGCAATCTAG，與基因芯片上對應位置的核酸探針產(chǎn)生互補匹配時，通過確定熒光強度最強的探針位置，獲得一組序列完全互補的探針序列。據(jù)此可重組出靶核酸的序列。五、高效液相色譜（HPLC）高效液相色譜法是在經(jīng)典色譜法的基礎上，引用了氣相色譜的理論，在技術上，流動相改為高壓輸送；色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成，從而使柱效大大高于經(jīng)典液相色譜（每米塔板數(shù)可達幾萬或幾十萬）；同時柱后連有高靈敏度的檢測器，可對流出物進行連續(xù)檢測。高壓泵將貯液罐的流動相經(jīng)進樣器送入色譜柱中，然后從檢測器的出口流出，這

7、時整個系統(tǒng)就被流動相充滿。當欲分離樣品從進樣器進入時，流經(jīng)進樣器的流動相將其帶入色譜柱中進行分離，分離后不同組分依先后順序進入檢測器。記錄儀記錄進入檢測器的信號，得到液相色譜圖。六、酵母雙雜交（Y2H）七、噬菌體展示技術噬菌體展示技術是將外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌體外殼蛋白結構基因的適當位置，在閱讀框正確且不影響其他外殼蛋白正常功能的情況下，使外源基因隨外殼蛋白的表達而表達，同時，外源蛋白隨噬菌體的重新組裝而展示到噬菌體表面的生物技術。被展示的多肽或蛋白可以保持相對獨立的空間結構和生物活性，利于靶分子的識別和結合。肽庫與固相上的靶蛋白分子經(jīng)過一定時間孵育后，洗去未結合的游離噬菌體，然

8、后以競爭受體或酸洗脫下與靶分子結合吸附的噬菌體，洗脫的噬菌體感染宿主細胞后經(jīng)繁殖擴增，進行下一輪洗脫，經(jīng)過3輪5輪的“吸附-洗脫-擴增”后，與靶分子特異結合的噬菌體得到高度富集。所得的噬菌體制劑可用來做進一步富集有期望結合特性的目標噬菌體。特點：建立了基因型與表現(xiàn)型之間的對應關系。八、RNA提取（Trizol法）Trizol試劑中的主要成分為異硫氰酸胍和苯酚，其中異硫氰酸胍可裂解細胞，促使核蛋白體的解離，使RNA與蛋白質分離，并將RNA釋放到溶液中。當加入氯仿時，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA進入水相，離心后可形成水相層和有機層，這樣RNA與仍留在有機相中的蛋白質和DNA分離開。水

9、相層（無色）主要為RNA，有機層（黃色）主要為DNA和蛋白質。九、RT-PCRRT-PCR是將RNA的反轉錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈式擴增（PCR）相結合的技術。首先經(jīng)反轉錄酶的作用從RNA合成cDNA，再以cDNA為模板，擴增合成目的片段。RT-PCR可以一步法或兩步法的形式進行。在兩步法RT-PCR中，每一步都在最佳條件下進行。實驗步驟：1、RNA的提取；2、反轉錄合成cDNA；3、PCR擴增；4、產(chǎn)物的電泳和結果的測定。十、實時熒光定量PCR（QPCR）（Real-timeQuantitativePCR）利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值

10、和標準曲線的關系對起始模板進行定量分析。閾值：是循環(huán)開始315個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍，設定在擴增曲線指數(shù)增長期。C(t)值：熒光信號（擴增產(chǎn)物）到達閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)次數(shù)。十一、BCA法測蛋白質濃度十二、大腸桿菌感受態(tài)細胞（E.coliDH5）制備1、前夜接種受體菌（DH5或DH10B），挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中37搖床培養(yǎng)過夜（約16小時）；2、取1ml過夜培養(yǎng)物轉接于100mlLB培養(yǎng)基中，在37搖床上劇烈振蕩培養(yǎng)約2.5-3小時（250-300rpm）；3、將0.1MCaCl2溶液置于冰上預冷；以下步驟需在超凈工作臺和冰上操作；4、吸取1.5ml培養(yǎng)好的菌液至1.5ml離

11、心管中，在冰上冷卻10分鐘；5、4下3000g冷凍離心5分鐘；6、棄去上清，加入100微升預冷0.1MCaCl2溶液，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細胞重新懸浮，在冰放置20分鐘；7、4下3000g冷凍離心5分鐘；8、棄去上清，加入100微升預冷0.1MCaCl2溶液，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細胞重新懸??；9、細胞懸浮液可立即用于轉化實驗或添加冷凍保護劑（15%-20%甘油）后超低溫冷凍貯存?zhèn)溆茫?0）。十三、堿變性提取質粒DNA堿變性提取質粒DNA是基于染色體DNA與質粒DNA的變性與復性的差異而達到分離目的。在pH=12.6的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結構解開而變性。質粒

12、DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價閉合環(huán)狀的兩條互補鏈不會完全分離，當用pH4.8的NaAc高鹽緩沖液去調節(jié)其pH至中性時，變性的質粒DNA又恢復原來的構型，保存在溶液中，而染色體DNA不能復性而形成纏連的網(wǎng)狀結構，通過離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質-SDS復合物等一起沉淀下來而被除去。十四、目的基因的連接、轉化及克隆篩選（1）總過程：分-PCR分離目的基因（PCR克隆、同源克隆、文庫篩選）切-限制性內切酶切割（粘性末端、平末端）接-目的基因與載體相連（限制性內切酶切割）轉-轉入宿主細胞篩-篩選陽性重組體原理：利用DNA聚合酶反應時都有在PCR產(chǎn)物的3末端添加一個或者幾個

13、A堿基的特性和利用T載體3末端的T堿基和PCR產(chǎn)物的A堿基互補配對，經(jīng)連接酶作用，完成與載體的連接。感受態(tài)細胞：經(jīng)過電擊、CaCl2、RuCl等化學試劑處理后，細胞膜的通透性發(fā)生變化，成為能容許外源DNA分子通過時細胞的狀態(tài)。十五、RNA干擾（RNAi）一些小的雙鏈RNA(siRNA)可以通過促使特定基因的mRNA降解來高效、特異的阻斷體內特定基因表達，誘使細胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型，稱為RNA干擾（RNAi）。十六、cDNA末端快速擴增技術（rapidamplificationofcDNAends,RACE）一種基于mRNA反轉錄和PCR技術建立起來的、以部分的已知區(qū)域序列為起點，擴增基因

14、轉錄本的未知區(qū)域，從而獲得mRNA(cDNA)完整序列的方法。簡單說就是一種從低豐度轉錄本中快速增長cDNA5和cDNA3末端，進而獲得獲得全長cDNA簡單而有效的方法。該方法具有快捷、方便、高效等優(yōu)點，可同時獲得多個轉錄本。近年來RACE技術已逐漸取代了經(jīng)典的cDNA文庫篩選技術，成為克隆全長cDNA序列的常用手段。十七、mRNA差異顯示技術（DD-PCR）mRNA差異顯示技術是將mRNA逆轉錄技術和PCR技術相結合的一種RNA指紋圖譜技術。每一種細胞（包括同一組織細胞經(jīng)過不同的處理）都有其特異表達的不同于其他組織細胞的基因譜（有差異基因表達），即特異的RNA指紋圖譜。差異基因表達是細胞分化的基礎，正是這些基因在細胞中的特異表達與否，決定了生命歷程中細胞的發(fā)育和分化、細胞周期調節(jié)、細胞衰老和凋亡等。mRNADDRTPCR技術是對組織特異性表達基因進行分離的一種快速而行之有效的方法。其基本原理是從基因背景相同的2個或幾個被比較的細胞系或組織中提取總RNA，