2018級(jí)天然實(shí)驗(yàn)

1、實(shí)驗(yàn)一(1)葉綠體色素的提取一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆沼袡C(jī)溶劑提取葉綠體色素等天然化合物的原理和實(shí)驗(yàn)方法。二、實(shí)驗(yàn)原理植物光合作用是自然界最重要的現(xiàn)象，它是人類所利用能量的主要來(lái)源。在把光能轉(zhuǎn) 化為化學(xué)能的光合作用過(guò)程中，葉綠體色素起著重要的作用。高等植物體內(nèi)的葉綠體色素有 葉綠素和類胡蘿卜素兩類，主要包括葉綠素1、葉綠素b、。-胡蘿卜素和葉黃素四種。它們所 呈現(xiàn)的顏色和在葉綠體中含量大約比例見(jiàn)表1。表1高等植物體內(nèi)葉綠體色素的種類、顏色及含量色素名稱項(xiàng)目J、-、葉綠素類胡蘿卜素葉綠素a葉綠素bP-胡蘿卜素葉黃素顏色藍(lán)綠色黃綠色橙黃色黃色在葉綠體內(nèi)各色素含量比例312131葉綠素(chlorophyll

2、s)是葉綠酸的酯，它在植物進(jìn)行光合作用中吸收可見(jiàn)光，并將光能轉(zhuǎn) 變?yōu)榛瘜W(xué)能。葉綠素是植物進(jìn)行光合作用所必需的催化劑。在綠色植物中葉綠素主要以葉綠 素a(C H ON Mg)和葉綠素b(C H O N Mg)兩種結(jié)構(gòu)相似的形式存在，其差別僅是 55 72 5 455 70 6 4葉綠素a中一個(gè)甲基被葉綠素b中的甲酰基所取代。葉綠素的基本結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。在葉綠素分子 結(jié)構(gòu)中含有四個(gè)毗咯環(huán)，它們由四個(gè)甲烯基聯(lián)結(jié)成卟琳環(huán)，在卟琳環(huán)中央有一個(gè)鎂原子，它 以兩個(gè)共價(jià)鍵和兩個(gè)配位鍵與四個(gè)毗咯環(huán)的氮原子結(jié)合成內(nèi)配鹽，形成鎂卟琳。在葉綠素分 子中還有兩個(gè)羧基，其中一個(gè)與甲醇酯化成COOCH3，另一個(gè)與葉綠醇酯化阪0

3、 OC20H39長(zhǎng) 鏈。類胡蘿卜素(carotenoids)是一類不飽和的四萜類碳?xì)浠衔?例如胡蘿卜素，carotenes)， 或它們的氧化衍生物(例如葉黃素類，xanthophylls)o所有的類胡蘿卜素均源于非環(huán)狀的 c40h56結(jié)構(gòu)。類胡蘿卜素在強(qiáng)光下可防止葉綠素的光氧化；在弱光下，可作為輔助色素吸收 光能并傳遞給葉綠素分子。胡蘿卜素有三種異構(gòu)體，即a-、P-和Y-胡蘿卜素，其中。-胡 蘿卜素含量最多，也最為重要。-胡蘿卜素還具有維生素A的生理活性，其結(jié)構(gòu)是由兩分 子維生素A在端鏈?zhǔn)煞肿铀Y(jié)合而成。在生物體內(nèi)，。-胡蘿卜素受酶催化氧化即形成維生素A。葉黃素（3, 3-二羥基-a-胡

4、蘿卜素，lutein, C40H56O2）是一種常見(jiàn)的氧化型的類胡 蘿卜素。P-胡蘿卜素和葉黃素均屬于脂溶性化合物。植物葉綠體色素的提取、分離、表征及含量測(cè)定在植物生理學(xué)和農(nóng)業(yè)科學(xué)研究中具有重 要意義。同時(shí)，葉綠素和胡蘿卜素等天然色素在食品工業(yè)和醫(yī)藥工業(yè)中也有廣泛的用途。ChlarR=CHnChib葉螺素質(zhì)R-胡簍卜素、葉黃素 和維上素&的結(jié)購(gòu)式葉綠素a和b都是毗咯衍生物與金屬鎂的配合物，盡管它們分子中含有一些極性基團(tuán)， 但大的烷基結(jié)構(gòu)使它們易溶于丙酮、乙醇、乙醚、石油醚等有機(jī)溶劑。-胡蘿卜素和葉黃 素是脂溶性的四萜化合物。與胡蘿卜素相比，葉黃素易溶于醇而在石油醚中的溶解度較小。 根據(jù)它們?cè)谟?/p>

5、機(jī)溶劑中的溶解特性，可將它們從植物葉片中提取出來(lái)。植物葉綠體色素通常 可用丙酮、乙醇、乙醚、丙酮-乙醚、甲醇-石油醚等有機(jī)溶劑提取。由于粗提取液中還可 能包括殘余植物組織和其它可溶性雜質(zhì)，實(shí)驗(yàn)中應(yīng)對(duì)粗提液進(jìn)一步純化。三、實(shí)驗(yàn)儀器與試劑1.儀器研缽、量筒、分液漏斗等常用玻璃儀器一套。2.試劑丙酮、乙醇、乙醚、石油醚等有機(jī)溶劑。飽和氯化鈉水溶液。碳酸鎂和無(wú)水硫酸鈉。四、實(shí)驗(yàn)步驟1 .葉綠體色素的提取方法一：采集新鮮樹(shù)葉，洗凈后棄除葉柄和中脈，然后用紗布或吸水紙將樹(shù)葉表面的 水分吸干。稱取處理過(guò)的樹(shù)葉3 g,剪碎后放在干凈的研缽內(nèi)，加入0.1 g碳酸鎂，先將樹(shù)葉 粗搗爛，然后加入10 mL乙醇-石油

6、醚（2:3），迅速研磨5 min。過(guò)濾去樹(shù)葉殘?jiān)?，再研?提取一次。最后再用10 mL乙醇-石油醚（2:3）洗滌研缽等容器，一并過(guò)濾。方法二：類似于方法一，采用丙酮提取，但在純化時(shí)應(yīng)事先在分液漏斗中加入15 mL 石油醚。粗提取液的純化純化色素時(shí)，將合并的濾液轉(zhuǎn)入分液漏斗，加X(jué)mL飽和的NaC l溶液和45 mL蒸餾水， 輕輕振蕩，放置分層。小心地把下層的含乙醇水溶液放掉，用洗瓶沿分液漏斗內(nèi)壁加入50 mL 蒸餾水洗滌石油醚層23次，以徹底洗去乙醇或丙酮。每次都要輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)分液漏斗，使葉綠 體色素保留在上層的石油醚層中，靜置，待分層清楚后，去掉下面的水溶液。再往石油醚色 素提取液加入少量無(wú)水Na

7、2SO4除去殘余水分，然后轉(zhuǎn)入具塞的棕色瓶中置于暗處保存。五、注意事項(xiàng)葉綠體色素對(duì)光、溫度、氧氣環(huán)境、酸堿及其它氧化劑都非常敏感。色素的提取和分析一 般都要在避光、低溫及無(wú)酸堿等干擾的情況下進(jìn)行。乙醚使用前應(yīng)重蒸除去過(guò)氧化物。使用低沸點(diǎn)易揮發(fā)有機(jī)溶劑要注意實(shí)驗(yàn)室安全。實(shí)驗(yàn)室要保持良好的通風(fēng)條件，不得靠近 明火操作。提取液不宜長(zhǎng)期存放，必要時(shí)應(yīng)抽干充氮避光低溫保存。六、思考題綠色植物葉片的主要成分是什么？提取液可能含有哪些化合物？一般天然產(chǎn)物的提取方式有哪些？殘余的植物組織應(yīng)如何除去？用乙醇-石油醚提取和用丙酮提取可能對(duì)結(jié)果產(chǎn)生什么影響？實(shí)驗(yàn)一（2）葉綠體色素的色譜分離一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? .掌握薄層

8、色譜分離原理和實(shí)驗(yàn)技術(shù)。2.掌握快速柱色譜分離原理和實(shí)驗(yàn)技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理色譜法是與植物天然色素的分離提取同時(shí)發(fā)展起來(lái)的。色譜法（紙色譜、薄層色譜和柱 色譜）至今仍然是分離葉綠素等天然色素最有效的方法。色譜法分離葉綠體色素的基本原理是利用不同色素在各種有機(jī)溶劑中的分配系數(shù)，或在 吸附劑上的吸附能力的不同，當(dāng)它們通過(guò)色譜柱/床時(shí)，這種分配或吸附過(guò)程反復(fù)多次地進(jìn) 行，最后將它們一一分離開(kāi)來(lái)。通常認(rèn)為，紙色譜屬于分配色譜。它是以濾紙為惰性支持物，濾紙纖維一般能吸收約20 %的水分，其中有67 %以氫鍵形式與纖維素上的羥基結(jié)合，構(gòu)成紙色譜的固定相。在 展開(kāi)過(guò)程中，被分離組分在展開(kāi)劑和固定相之間不斷進(jìn)行

9、分配，達(dá)到相互分離。薄層色譜和 柱色譜的吸附劑（固定相）有硅膠、氧化鋁、硅藻土等無(wú)機(jī)物，也有糖類、纖維素、聚酰胺、 ci8和離子交換樹(shù)脂等有機(jī)物。它們的分離機(jī)理也各不相同，如吸附、分配，氫鍵、正相和 反相色譜等。對(duì)于紙色譜或薄層色譜，毛細(xì)管作用是推動(dòng)溶劑展開(kāi)的動(dòng)力。被分離物質(zhì)在圖譜上的 位置，可用比移值R表示。f比移值的大小與被分離物質(zhì)的分配系數(shù)大小有關(guān)，它是紙色譜法和薄層色譜法實(shí)驗(yàn)中 唯一可用數(shù)值表示的重要參數(shù)。在一定的色譜系統(tǒng)中，在確定的溫度下，R是被分離物質(zhì)的 f特征常數(shù)。R值差別越大，則分離越完全。f對(duì)于相同的色譜體系，薄層色譜的R值與液相色譜的容量因子1值之間有一定的關(guān)系 f即在薄層

10、色譜中展開(kāi)快的組分，在柱色譜中先出峰。通過(guò)薄層色譜實(shí)驗(yàn)可以探索高效液相色 譜合適的流動(dòng)相組成。值得一提的是快速柱色譜（Flash Chromatography），它是介于經(jīng)典柱色譜和高效制備 型液相色譜之間的一種實(shí)驗(yàn)室分離技術(shù)，主要用于天然產(chǎn)物和化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)物的快速分離和純 化工作。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)紙色譜、薄層色譜和快速柱色譜方式，對(duì)植物色素的提取液進(jìn)一步分離成 葉綠素a、葉綠素3、8胡蘿卜素和葉黃素幾個(gè)組分，并進(jìn)行光譜表征和鑒定其純度。通過(guò)多 次紙制備色譜也可以得到少量葉綠素a和葉綠素b純品。三、實(shí)驗(yàn)儀器與試劑儀器層析缸、大量筒、表面皿、帶有加壓裝置的玻璃層析柱等常規(guī)層析裝置。2 .試劑乙酸乙酯、石

11、油醚、乙醚、乙醇等有機(jī)溶劑。硅膠H。四、實(shí)驗(yàn)步驟薄層色譜薄層色譜是一種較新的分離物質(zhì)的方法，具有快速、微量、靈敏度高、分離效率好等優(yōu) 點(diǎn)。薄層色譜對(duì)天然產(chǎn)物的分離、鑒定更有獨(dú)到之處，在中草藥有效成分的純化鑒定中廣泛 應(yīng)用。分離葉綠體色素的薄層色譜吸附劑有硅膠、纖維素、聚酰胺、C等。下面僅介紹常 用的硅膠薄層色譜法。薄層板的制備取若干塊洗凈的載玻片，采用用羧甲基纖維素鈉作粘合劑，取硅膠H(200250目)1份， 加入0.5 %羧甲基纖維素鈉溶液2份，充分調(diào)勻后，即可涂鋪，晾干后在105C活化0.5 h， 放在干燥器內(nèi)備用。點(diǎn)樣取制備好的薄層板一塊，在板兩側(cè)距底邊1cm處各做一記號(hào)，用玻璃毛細(xì)管吸

12、取濃縮的 色素石油醚提取液，點(diǎn)樣，斑點(diǎn)不應(yīng)超過(guò)5 mm，晾干。展開(kāi)分離葉綠體色素的展開(kāi)劑有：石油醚(6090C)-丙酮-乙醚(3:1:1)；石油醚-丙酮(8：2)；石油醚-乙酸乙酯(6:4)；苯-丙酮(7:3)和石油醚(3060C)-丙酮-正丁醇(90:10:4.5) 等。本實(shí)驗(yàn)將150 mL石油醚(6090C)-丙酮-乙醚(3:1:1)展開(kāi)劑倒入層析缸中，并在層 析缸的內(nèi)壁四周貼一張5 cm高的濾紙，濾紙下部浸在展開(kāi)劑中，蓋好蓋子平衡1015 min。將點(diǎn)好樣的硅膠板放入展開(kāi)缸里，液面不能超過(guò)點(diǎn)樣線，蓋好蓋子進(jìn)行上行層析。待展開(kāi)劑 前沿上升到距硅膠板上端1.52 cm時(shí)，取出硅膠板置于通風(fēng)櫥

13、里晾干，可看到層析板上出現(xiàn) 若干色素帶，其排列順序一般是3-胡蘿卜素、去鎂葉綠素、葉綠素!、葉綠素13和葉黃素等多 條色帶。用鉛筆標(biāo)記出樣品斑點(diǎn)，計(jì)算各色素的比移值Rf。(4 )樣品收集將層析板上分開(kāi)的P-胡蘿卜素、葉綠素a、葉綠素b的色帶分別用干凈的刮刀刮入試管 中，加A5mL丙酮提取，低溫避光保存。樣品純度的鑒定色譜法分離得到的樣品組分，可用吸收光譜(400700 nm)和熒光光譜進(jìn)行表征和鑒 定。其純度也可通過(guò)薄層色譜點(diǎn)板實(shí)驗(yàn)和后面介紹的三種測(cè)定技術(shù)進(jìn)行測(cè)定。五、注意事項(xiàng)強(qiáng)光會(huì)破壞色素，提取過(guò)程應(yīng)盡可能在弱光或暗室中進(jìn)行。使用低沸點(diǎn)易揮發(fā)有機(jī)溶劑要注意實(shí)驗(yàn)室安全。實(shí)驗(yàn)室要保持良好的通風(fēng)條件，使用有 機(jī)溶劑不得靠近明火操作。分離后的單一色素提取液不