3730測序流程課件

1、3730XL測序基本流程汪大海深圳華大基因研究院 散樣組準(zhǔn)備模板：質(zhì)粒、PCR產(chǎn)物電泳鑒定DNA濃度和質(zhì)量測序PCR反應(yīng)純化測序產(chǎn)物（上機(jī)前純化）上機(jī) 分析數(shù)據(jù)測序基本流程： 一 質(zhì)粒DNA的提取堿裂解法基本原理： 當(dāng)菌體在NaOH和SDS溶液中裂解時(shí)，蛋白質(zhì)與DNA發(fā)生變性，當(dāng)加入中和液后，質(zhì)粒DNA分子能夠迅速復(fù)性，呈溶解狀態(tài)，離心時(shí)留在上清中；蛋白質(zhì)與染色體DNA不復(fù)性而呈絮狀，通過離心可沉淀下來堿裂法提取質(zhì)粒操作步驟菌體的培養(yǎng)（挑單克隆或加少量菌液在含抗生素的培養(yǎng)基中，37震蕩過夜培養(yǎng)菌體的收集（13000rpm離心1min，使菌體充分沉淀，棄上清）溶液I的組分：1.0M Tris-H

2、Cl / 0.5M EDTA，pH8.0，用前按比例加入RNase酶溶液I的作用：菌體懸浮EDTA是在溶液I中主要起抑制DNase的作用 。如果缺了溶液I，我們也可以用等體積的水或LB培養(yǎng)基來懸浮菌體。特別注意：菌體一定要懸浮均勻，不能有結(jié)塊。質(zhì)粒提取步驟一：加入200ul I液 ，充分振蕩,直到管底無沉菌為止 RNase酶未加或失活溶液II的組分： 0.4 N NaOH / 2% SDS； 兩種溶液等體積混合后使用 ，必須現(xiàn)用現(xiàn)配溶液II的作用：裂解作用溶液II在天氣冷時(shí)會(huì)產(chǎn)生絮狀沉淀，可溫水預(yù)熱至沉淀消除。SDS是離子型表面活性劑。它主要作用是： a.溶解細(xì)胞膜上的脂質(zhì)與蛋 白，從而破壞細(xì)

3、胞膜。 b.解聚細(xì)胞中的核蛋白。 c.能使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來。質(zhì)粒提取步驟二：加入300ul II液， 輕柔顛倒510次。這一步要注意兩點(diǎn)： 第一，時(shí)間不能過長，盡量不要超過5min。因?yàn)樵谶@樣的堿性條件下基因組DNA片斷會(huì)慢慢斷裂； 第二，必須溫柔混合，不然基因組DNA也會(huì)斷裂。超螺旋結(jié)構(gòu)復(fù)制中間體開環(huán)溶液III的組分：3 M 乙酸鉀 ， 冰乙酸調(diào)PH值至4.85.2。溶液III的作用: 中和作用3mol/L pH4.85.2的乙酸鉀溶液是為了把抽提液的pH調(diào)至中性，從而使變性的質(zhì)粒DNA復(fù)性，且穩(wěn)定存在。溶液III加入后的沉淀實(shí)際上是K+置換了SDS中的Na+形成了不溶性的PDS(十二烷

4、基硫酸鉀potassium dodecylsulfate)質(zhì)粒提取步驟三：每孔加入300 ul 4預(yù)冷的III液，立即上下翻轉(zhuǎn)1520次13000rpm 4離心10min，沉淀蛋白棄上清，加入600ul 預(yù)冷的70%乙醇 ， 13000rpm 離心5min轉(zhuǎn)移600ul上清至濾膜上， 13000rpm 離心1min，盡量不要吸入蛋白放置冰上10min 加入600ul異丙醇，上下翻轉(zhuǎn)1015次， 13000rpm 20離心20min棄上清，放通風(fēng)處晾置2030分鐘加3040ul millipore純水，室溫放置35min，電泳鑒定ase質(zhì)粒加樣孔溴芬蘭帶二 電泳鑒定目的：檢測質(zhì)粒抽提的質(zhì)量好圖對

5、DNA的純度要求 盡量去凈： 殘留的鹽分和SDS 蛋白質(zhì) 殘留的RNARNA 1ugPEG 0.3%NaAc 0.5 mMEthanol 1.25%Phenol/CHCl3 0%CsCl 5 mM測序可以容忍的雜質(zhì)濃度雜質(zhì)上限三 測序的PCR反應(yīng) 測序反應(yīng)DNA1 LBigDye4 L引物 (3.2 pmol / l)1 L去離子滅菌水 4 L 總體積 10 L 測序PCR循環(huán)條件96 C 1 min (96 C 10 sec 50 C 5 sec 60 C 4 min) x 25個(gè)循環(huán) 4 C保溫ABI BigDye 3.1的組成成分測序酶脫氧的dNTP雙脫氧的dNTP(熒光標(biāo)記)Mg2+d

6、dH2O buffter DNA測序模板用量 PCR產(chǎn)物100-200 bp 1- 3 ng200-500 bp 3-10 ng500-1000 bp 5-20 ng1000-2000 bp 10-40 ng2000 bp20-50 ng 質(zhì)粒150-300 ng 大分子量模板(Cosmid、BAC)0.5-1 g 細(xì)菌基因組DNA2-3 g引物與模板的平衡最關(guān)鍵 質(zhì) 粒 200 ng : 3.2 pmol PCR產(chǎn)物 100-200 bp1-3 ng : 3.2 pmol 200-500 bp3-10 ng : 3.2 pmol 500-1000 bp5-20 ng : 3.2 pmol 為

7、什么要定量濃度太低：會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)不充分，測序信號(hào)較弱。濃度太高：1.會(huì)導(dǎo)致小片段進(jìn)樣過多，信號(hào)迅速衰減（見下圖）。2.DNA中包含較多雜質(zhì)，會(huì)對后續(xù)測序反應(yīng)產(chǎn)生影響。PCR與測序反應(yīng)的比較 PCR測序反應(yīng)DNA 聚合酶Taq酶測序酶引物一對單向 底物dNTPdNTP+ddNTP*質(zhì)量要求量少高產(chǎn)物等長的DNA片段長短不一的片段熒光標(biāo)記無3端帶熒光標(biāo)記四 測序產(chǎn)物純化（上機(jī)前純化）目的： 去除未結(jié)合的熒光染料終止物 去除殘余的引物、鹽離子、酶等電進(jìn)樣對DNA純度的要求毛細(xì)管和電極置于樣品溶液中，加電壓后，荷負(fù)電的DNA進(jìn)入毛細(xì)管，向正極泳動(dòng)。信號(hào)強(qiáng)度(進(jìn)樣量)取決于DNA片段的荷電量、片段大小及與

8、雜質(zhì)的競爭。分子越小，上樣越快鹽離子、RNA、蛋白質(zhì)等與DNA片段競爭舉例 酒精/EDTA/NaAc法 每管加入1 L 125 mM EDTA，1 L 3 M NaAc，到管底； 每管加入25 L 無水乙醇，用膠墊封嚴(yán)密，震蕩23min，室溫放置15 min； 4300 rpm離心30 min，立即倒置384孔板離心，至300rpm停止，去除酒精； 每管加入35 L 70% 酒精， 4300 rpm 4 C離心15 min，立即倒置384孔板離心，至300 rpm停止，去除酒精； 重復(fù)70% 酒精洗滌1次； 讓殘余的酒精在室溫?fù)]發(fā)干，加入10 L Hi-Di甲酰胺， 95 C變性4 min，迅速冰冷4 min ，上樣電泳。ABI 3730 xl 自