S9實(shí)驗(yàn)九植物單細(xì)胞分離技術(shù)理論上課講義

1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。S9實(shí)驗(yàn)九植物單細(xì)胞分離技術(shù)理論-實(shí)驗(yàn)九植物單細(xì)胞分離技術(shù)（理論）一、植物細(xì)胞培養(yǎng)概述指以單細(xì)胞（singlecell）或細(xì)胞團(tuán)（cellaggregate）為單位進(jìn)行的植物組織培養(yǎng)方式。1、技術(shù)特點(diǎn)：操作簡單試驗(yàn)重復(fù)性好單次實(shí)驗(yàn)群體大2、培養(yǎng)的植物細(xì)胞的特點(diǎn)A、培養(yǎng)時(shí)生長速度慢B、直徑為20150um，比細(xì)菌大C、纖維素細(xì)胞壁非常脆弱D、生理與代謝活性低E、需求營養(yǎng)成分復(fù)雜F、不易于保存G、次生物質(zhì)的合成與積累和細(xì)胞分化過程有關(guān)3、細(xì)胞培養(yǎng)液的性質(zhì)培養(yǎng)液具有一定的黏度提供細(xì)胞生長發(fā)育所需的營養(yǎng)黏度隨細(xì)

2、胞濃度的增加而增大需不停攪拌而進(jìn)行通氣二、植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)（一）懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)A、提供大量的均勻的植物細(xì)胞B、細(xì)胞增殖速度比愈傷組織快C、適宜大規(guī)模培養(yǎng)D、增加培養(yǎng)細(xì)胞與培養(yǎng)液的接觸面，改善營養(yǎng)供應(yīng)E、避免有害物質(zhì)的過分積累F、保證氧的充分供給（二）懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的建立與測(cè)定1、誘導(dǎo)建立誘導(dǎo)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的方法A、選擇一塊易破碎的愈傷組織，轉(zhuǎn)移到適合的培養(yǎng)液中，經(jīng)12個(gè)周期振蕩培養(yǎng)，得到呈分散狀的細(xì)胞培養(yǎng)物。B、選擇有用的培養(yǎng)材料，進(jìn)行勻漿處理，過濾，轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。C、選擇有用的材料多次轉(zhuǎn)移與液體振蕩培養(yǎng)，得到分散程度高的細(xì)胞。懸浮培養(yǎng)的材料：愈傷組織的疏松程度、分散效果的好壞。2、生

3、長與增殖擴(kuò)增曲線：S形延遲期、對(duì)數(shù)生長期、平臺(tái)期、衰減期懸浮培養(yǎng)細(xì)胞起始濃度：一般在0.51052.5105個(gè)/ml懸浮培養(yǎng)的單個(gè)細(xì)胞，35d可見分裂狀況3、懸浮培養(yǎng)物的保持A、培養(yǎng)瓶100ml或250ml的三角瓶作容器裝20ml或50ml的培養(yǎng)液B、振蕩培養(yǎng)裝置旋轉(zhuǎn)式搖床轉(zhuǎn)速控制在120r/min以下體積不宜過大，溫度可調(diào)C、繼代培養(yǎng)定期繼代培養(yǎng)，最適周期為12周繼代時(shí)間為1周的可用1：4的接種量繼代時(shí)間為2周的可用1：10的接種量移液管口徑可稍大，易吸取細(xì)胞接種前后要用酒精燈灼燒瓶口定期檢查是否有微生物污染4、生長測(cè)定對(duì)任何一建立細(xì)胞系都應(yīng)進(jìn)行生長動(dòng)態(tài)測(cè)定不同培養(yǎng)基及不同條件，細(xì)胞的最大生

4、長速率可由細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞干重或細(xì)胞蛋白的對(duì)數(shù)對(duì)培養(yǎng)時(shí)間作坐標(biāo)而測(cè)定臨界起始濃度：低于此值，細(xì)胞無法生長，略高于此值，則延遲期伸長常用的生長測(cè)定方法A、細(xì)胞計(jì)數(shù)血球計(jì)數(shù)板：計(jì)算公式：細(xì)胞數(shù)/ml=5大格內(nèi)細(xì)胞總數(shù)5104稀釋倍數(shù)B、細(xì)胞體積一定量的細(xì)胞懸浮液放入15ml刻度的離心管中離心以每毫升培養(yǎng)液中細(xì)胞體積的毫升數(shù)來表示細(xì)胞體積C、細(xì)胞的鮮重與干重將一定量的細(xì)胞懸浮液加到預(yù)先稱重的尼龍布上，用水沖洗并抽濾，然后稱重測(cè)干重時(shí)，將離心收集的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到預(yù)先稱重的定量濾紙上，然后80烘箱內(nèi)1012h，在干燥器中冷卻稱重細(xì)胞鮮重與干重一般以每毫升懸浮培養(yǎng)物的重量表示（三）懸浮培養(yǎng)工藝1、成批培養(yǎng)把細(xì)胞接

5、種到一個(gè)與外界隔絕的只允許氣體和揮發(fā)性的代謝物質(zhì)交換的、營養(yǎng)液體積保持不變的密閉系統(tǒng)中培養(yǎng)。特點(diǎn)a、培養(yǎng)系統(tǒng)密閉b、培養(yǎng)基體積固定c、培養(yǎng)數(shù)目、總重量、DNA含量變化，呈一個(gè)“S”曲線d、使細(xì)胞保持對(duì)數(shù)生長e、細(xì)胞在培養(yǎng)液中分布均勻。2、連續(xù)培養(yǎng)用一定容積但非密閉的特別容器進(jìn)行大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)的方法。特點(diǎn)a、使細(xì)胞保持在增殖最快的對(duì)數(shù)生長期b、具有穩(wěn)定的培養(yǎng)狀態(tài)c、適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)3、分批培養(yǎng)與連續(xù)培養(yǎng)比較（四）懸浮植物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器1、類型：機(jī)械攪拌式、氣動(dòng)式、混合式A、機(jī)械攪拌式特點(diǎn)：剪切力大，對(duì)細(xì)胞易傷害消耗功率大易形成供氧不足易產(chǎn)生死角解決途徑：建立抗剪切力的細(xì)胞株系改造反應(yīng)容器結(jié)構(gòu)

6、B、氣動(dòng)式攪拌反應(yīng)器類型：鼓泡式和氣升式特點(diǎn)：剪切力小傳質(zhì)效果好運(yùn)行成本和造價(jià)低結(jié)構(gòu)簡單易保持無菌三、固相化培養(yǎng)（一）固相化細(xì)胞把細(xì)胞固定在一種惰性基質(zhì)，如瓊脂、藻酸鹽、纖維膜等上面或里面，細(xì)胞不能運(yùn)動(dòng)，而營養(yǎng)液可在細(xì)胞間流動(dòng)，供應(yīng)其營養(yǎng)。特點(diǎn)：A、可消除或極大減弱流質(zhì)引起的切變力B、細(xì)胞緩慢生長，次生代謝物占優(yōu)勢(shì)C、細(xì)胞之間緊密接觸，利于次生代謝D、便于操作E、便于次生代謝物的收集F、可連續(xù)地對(duì)細(xì)胞作各種化學(xué)處理G、可向反應(yīng)器中提供大量的、濃度極低的毒性代謝物，從培養(yǎng)基獲得代謝物（二）固相化方法A、褐藻酸和藻酸鹽褐藻酸：海草灰分離產(chǎn)物，多聚體藻酸鹽：葡糖醛酸和甘露糖醛酸組成的多糖，在Ca+存

7、在下，形成鹽膠B、甲叉藻聚糖K+存在下，形成強(qiáng)力膠，需先加熱熔化常選用低熔點(diǎn)（5%濃度時(shí)，3035）C、瓊脂糖與瓊脂凝固劑、無毒、很好的固相化材料、現(xiàn)在常選用（三）固相化細(xì)胞活力檢測(cè)A、成活力染色熒光素二醋酸（FDA）、苯番紅染色觀察B、質(zhì)壁分離測(cè)定質(zhì)膜完整性；質(zhì)壁分離劑：甘油、山梨醇C、呼吸作用懸浮培養(yǎng)，測(cè)定培養(yǎng)時(shí)間與耗氧量關(guān)系D、細(xì)胞生長以相對(duì)干重表示E、32P核磁共振（四）固相化細(xì)胞生物反應(yīng)器1、特點(diǎn)：消除或極大地減弱流質(zhì)引起的切變力有利于次級(jí)代謝物的積累有利于產(chǎn)物的合成與分泌有利于連續(xù)培養(yǎng)和生物轉(zhuǎn)化2、固相化方法：凝膠包埋、表面吸附、膜固定、網(wǎng)格固定等A、填充床反應(yīng)器B、流化床反應(yīng)器C

8、、膜生物反應(yīng)器主要適應(yīng)于分泌產(chǎn)物到體外的細(xì)胞培養(yǎng)體系（五）影響因素1、遺傳特性2、環(huán)境條件：光、溫、pH、培養(yǎng)基成分等四、單細(xì)胞培養(yǎng)（一）單細(xì)胞分離方法1、機(jī)械法利用葉肉組織排列疏松、細(xì)胞間接觸較少的特點(diǎn)，將葉片輕輕研碎，經(jīng)過濾和離心，收集和凈化細(xì)胞。優(yōu)點(diǎn)a、細(xì)胞未受酶傷害b、有利于細(xì)胞的生理和生化研究c、無須質(zhì)壁分離2、酶法利用果膠酶、纖維素酶處理植物葉片或其他外植體，使細(xì)胞分離。優(yōu)點(diǎn)：是可以得到較多的游離細(xì)胞3、化學(xué)法利用一些化學(xué)藥劑游離細(xì)胞。如秋水仙堿等特點(diǎn)：分離細(xì)胞數(shù)量大、易引起細(xì)胞改變（二）單細(xì)胞培養(yǎng)植物單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)，最終目的是長成一株完整的植株。培養(yǎng)方法：平板培養(yǎng)、條件培養(yǎng)、看護(hù)培

9、養(yǎng)、微室培養(yǎng)、微滴培養(yǎng)、液體淺層培養(yǎng)1、平板培養(yǎng)按一定細(xì)胞密度制備好單細(xì)胞懸浮液，再將含0.6%瓊脂的培養(yǎng)基加熱熔化后冷卻至35左右，尚未凝固時(shí)與細(xì)胞懸浮液混合迅速倒入培養(yǎng)皿中形成一平板進(jìn)行培養(yǎng)。特點(diǎn)：單細(xì)胞在培養(yǎng)基分布均勻便于定點(diǎn)觀察篩選效率高、量大操作簡便通氣狀況不佳排泄物質(zhì)易積累造成毒害或影響組織吸收植板率計(jì)算公式：植板率高低隨細(xì)胞種類、接種密度及培養(yǎng)基成分不同而異細(xì)胞接種密度，一般不低于103104個(gè)/L2、條件培養(yǎng)選用的培養(yǎng)基中，加入一定量已生長過組織或細(xì)胞的條件培養(yǎng)液，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的方法。起始細(xì)胞密度高時(shí)，成分可簡單些；相反，成分就復(fù)雜些。高密度細(xì)胞群體，在分裂臨界度以上的細(xì)胞，能

10、較快地分裂。3、看護(hù)培養(yǎng)是用一塊活躍生長的愈傷組織來促進(jìn)培養(yǎng)細(xì)胞持續(xù)分裂和增殖的方法。特點(diǎn)是簡便易行，效果好，但顯微鏡下難以追蹤細(xì)胞分裂、生長過程。4、微室培養(yǎng)是在人工制造的無菌小室中，將一滴懸浮細(xì)胞液培養(yǎng)在少量培養(yǎng)基上，使其分裂增殖形成細(xì)胞團(tuán)的方法。特點(diǎn)是能連續(xù)進(jìn)行顯微觀察，但培養(yǎng)基量少，培養(yǎng)時(shí)間短。5、液體淺層培養(yǎng)先在培養(yǎng)皿中注入淺層液體培養(yǎng)基，再接種已分散的單細(xì)胞的培養(yǎng)方法。6、其他培養(yǎng)方式膜室培養(yǎng)、雙層濾紙培養(yǎng)（三）單細(xì)胞培養(yǎng)程序建立細(xì)胞株、高產(chǎn)細(xì)胞株的選擇、分化培養(yǎng)或擴(kuò)大培養(yǎng)、鑒定和提取1、建立細(xì)胞株A、確定材料選擇易于分散的花粉為材料分散性好的愈傷組織材料直接從葉肉、根尖、髓組織取材B、懸浮細(xì)胞液的制備振蕩培養(yǎng)分散性好的材料，提取用孔徑為200300目的網(wǎng)過濾收集2、起始濃度控制細(xì)胞密度起始細(xì)胞密度：臨界密度3、高產(chǎn)細(xì)胞株的選擇細(xì)胞株：在培養(yǎng)基上生長出的每個(gè)細(xì)胞團(tuán)都來自一個(gè)細(xì)胞的分裂。初步鑒定和測(cè)定高抗、高品質(zhì)、高產(chǎn)4、分化培養(yǎng)與擴(kuò)大培養(yǎng)5、鑒定與提取（四）影響因素營養(yǎng)條件：要求更高環(huán)境條件：要求更高初始細(xì)胞密度條件培養(yǎng)基生長調(diào)節(jié)劑pH值五、植物