生物化學(xué)合工大第四章核酸化學(xué)課件

1、第四章核酸化學(xué)Nucleic Acid chemistry第一節(jié) 概述第二節(jié) 核酸的化學(xué)組成第三節(jié) 核酸的分子結(jié)構(gòu)第四節(jié) 核酸的性質(zhì)第五節(jié) 核酸的研究方法本章內(nèi)容第一節(jié)概 述 核酸（nucleic acidNA）是一類(lèi)重要的生物大分子，擔(dān)負(fù)著生命信息的儲(chǔ)存與傳遞。 核酸是現(xiàn)代生物化學(xué)、分子生物學(xué)的重要研究領(lǐng)域，是基因工程操作的核心分子。1868 F. Miescher從膿細(xì)胞的細(xì)胞核中分離出了一 種含磷酸的有機(jī)物，當(dāng)時(shí)稱(chēng)為核素（nuclein）,后稱(chēng)為核酸（nucleic acid）。1944 Avery 等通過(guò)肺炎球菌轉(zhuǎn)化試驗(yàn)證明DNA是遺傳物質(zhì)。1952 Hershey, Chase-噬菌

2、體標(biāo)記實(shí)驗(yàn)。1953 Watson和Crick提出DNA結(jié)構(gòu)的雙螺旋模型。1958 Crick提出遺傳信息傳遞的中心法則。1973 Boyer，Cohen-DNA Cloning(克?。?。1976 DNA Sequencing(序列分析）。1990 Human Genome Project（人類(lèi)基因組計(jì)劃）。一、核酸的研究歷史光滑型細(xì)胞（有毒）粗糙型細(xì)胞（無(wú)毒）破碎細(xì)胞DNAase降解后的DNA粗糙型細(xì)胞接受光滑型DNA只有粗糙型大多數(shù)仍為粗糙型少數(shù)光滑型細(xì)胞被轉(zhuǎn)化SSRRR+DNA1944年Avery細(xì)菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)肺炎球菌（pneumococcus） 1928年細(xì)菌學(xué)家Griffith 細(xì)菌毒

3、性實(shí)驗(yàn) 噬菌體感染實(shí)驗(yàn) 1952年美國(guó)Hershey 噬菌體感染實(shí)驗(yàn) 真核生物 原核生物 細(xì)胞核（98%） 擬核 線粒體mDNA （少量） 質(zhì)粒DNA（plasmid） 葉綠體ctDNA （少量）等 病毒DNA 細(xì)胞質(zhì)（90%） 細(xì)胞質(zhì) 核仁（少量） 病毒RNA 二、核酸的種類(lèi)和分布 DNA脫氧核糖核酸 RNA核糖核酸注：生物細(xì)胞都含有DNA 和 RNA； 病毒中只含 DNA 或 只含 RNA。第二節(jié)核酸的化學(xué)組成 核酸是由幾十個(gè)甚至幾千萬(wàn)個(gè)核苷酸聚合而成的具有一定空間結(jié)構(gòu)的生物大分子。 基本元素：C、H、O、N、P ；其中P 的含量比較穩(wěn)定，占9%-10%，通過(guò)測(cè)定P 的含量來(lái)推算核酸的含量

4、（定磷法）。磷酸 核苷 堿基 戊糖 核酸核苷酸 一、戊糖 組成核酸的戊糖有兩種。DNA所含的糖為-D-2-脫氧核糖；RNA所含的糖則為-D-核糖。二、堿基1. 嘌呤（Purine） 腺嘌呤AdenineA 鳥(niǎo)嘌呤guanineG2. 嘧啶（Pyrimidine）胸腺嘧啶T胞嘧啶C尿嘧啶U 核酸中也存在一些不常見(jiàn)的稀有堿基。稀有堿基的種類(lèi)很多，大部分是上述堿基的甲基化產(chǎn)物。二氫尿嘧啶 （DHU）修飾堿基的簡(jiǎn)寫(xiě)符號(hào) ( 為1時(shí)可以不寫(xiě) )三、核苷（nucleoside）核苷：戊糖+堿基 糖與堿基之間的C-N鍵，稱(chēng)為C-N糖苷鍵核苷中戊糖與堿基的連接方式：12345(OH)12345(OH)修飾核苷

5、/稀有核苷修飾核苷包括三種情況: （1）由修飾堿基和糖組成的核苷 （2）由非修飾堿基和2-O-甲基核糖組成的核苷 （3）由堿基與糖連接方式特殊的核苷 （1）（2）二氫尿嘧啶核苷 (Am)（3）()取代基用下列小寫(xiě)英文字母表示 :甲基m 乙酰基ac 氨基n 甲硫基ms 羥基o或h 硫基s 異戊烯基i 羧基c 例：四、核苷酸（nucleotide） 核苷酸： 核苷+磷酸 戊糖+堿基+磷酸H五、游離核苷酸及其衍生物的形式1. 繼續(xù)磷酸化2.環(huán)化磷酸化 cAMP cGMP3.輔酶 NAD、NADP、FAD、HSCoAFADNAD、NADPHSCoA4. GDP-半乳糖、GDP-葡萄糖等是糖蛋白 生物合

6、成和多糖生物合成的活性糖 基供體。 第三節(jié) 核酸的分子結(jié)構(gòu) 一、DNA的結(jié)構(gòu)一級(jí)結(jié)構(gòu): DNA核苷酸鏈中脫氧核苷 酸的組成和排列順序。二級(jí)結(jié)構(gòu)：DNA的兩條多聚鏈間通過(guò) 氫鍵形成的雙螺旋結(jié)構(gòu)。三級(jí)結(jié)構(gòu)：DNA雙鏈進(jìn)一步折疊卷曲 形成的構(gòu)象。（一）DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu) 由dAMP、dGMP、 dCMP、 dTMP核苷酸單體通過(guò)3,5-磷酸二酯鍵相連而成的鏈狀聚合物。5533結(jié)構(gòu)式5-磷酸端（常用5-P表示）；3-羥基端（常用3 -OH表示）核苷酸鏈具有方向性，當(dāng)表示一個(gè)核苷酸鏈時(shí)，必須注明它的方向是53或是35。字母式5PAPCPGPCPTPGPTPAOH 3 5 PACGCTGTAOH 3線條式O

7、HDNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)也可指DNA分子中堿基的順序。DNA的堿基順序本身就是遺傳信息存儲(chǔ)的分子形式。生物界物種的多樣性即寓于DNA分子中四種核苷酸千變?nèi)f化的不同排列組合之中。（二）DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)Watson 和 Crick 于1953年提出了DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，說(shuō)明了DNA 的二級(jí)結(jié)構(gòu)。（即B型DNA）（1）Chargaff定則 （1950s,E. Chargaff發(fā)現(xiàn)）DNA堿基組成符合： A=T；G=C； A+G=T+C。不對(duì)稱(chēng)比率：A+T/G+C； 物種不同，DNA堿基組成不同； 物種親緣愈接近，堿基組成也愈接近，該比 率越相近似。.具有種的特異性，沒(méi)有器官和組織的特異性，年齡、營(yíng)養(yǎng)狀

8、況、環(huán)境的改變不影響DNA的堿基組成。1提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型的根據(jù) （2）x-光衍射分析 20世紀(jì)40年代Astbury 1952年M.Wilkins 2DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型（double-helical structure） 1953年Watson和Crick提出了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)。 DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點(diǎn)（1）螺旋中的兩條鏈反向平行，即其中一條鏈的方向?yàn)?3，而另一條鏈的方向?yàn)?5，兩條鏈共同圍繞一個(gè)假想的中心軸呈右手雙螺旋結(jié)構(gòu)。 DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點(diǎn)（2）疏水的堿基位于雙螺旋的內(nèi)側(cè)，親水的磷酸和脫氧核糖基位于螺旋外側(cè)。堿基平面與螺旋軸垂直，脫氧核糖平面與中心軸平行。由于幾何形狀

9、的限制，堿基對(duì)只能由嘌呤和嘧啶配對(duì)，即A與T，G與C。這種配對(duì)關(guān)系，稱(chēng)為堿基互補(bǔ)。A和T之間形成兩個(gè)氫鍵， G與C之間形成三個(gè)氫鍵。T-A堿基對(duì)C-G堿基對(duì)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點(diǎn)（3）由于堿基對(duì)排列的方向性，使得堿基對(duì)占據(jù)的空間是不對(duì)稱(chēng)的，因此，在雙螺旋的表面形成大小兩個(gè)凹槽，分別稱(chēng)為大溝和小溝，二者交替出現(xiàn)。2.0 nm小溝大溝DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點(diǎn)（4）雙螺旋橫截面的直徑約為2 nm，相鄰兩個(gè)堿基平面之間的距離（軸距）為0.34 nm，每10個(gè)核苷酸形成一個(gè)螺旋，其螺距（即螺旋旋轉(zhuǎn)一圈）的高度）為3.4 nm。2.0 nm小溝大溝DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點(diǎn)（5）兩條鏈借堿基之間的氫鍵和堿

10、基堆積力（即堿基之間的范德華力）牢固的連接起來(lái)，維持DNA雙螺旋的三維結(jié)構(gòu)。兩條鏈?zhǔn)菈A基互補(bǔ)關(guān)系。3. DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定因素 氫鍵 堿基堆積力 磷酸基上負(fù)電荷被胞內(nèi)組蛋白或正離子中和堿基處于疏水環(huán)境中4. DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)的意義 該模型揭示了DNA作為遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性特征，最有價(jià)值的是確認(rèn)了堿基配對(duì)原則，這是DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和反轉(zhuǎn)錄的分子基礎(chǔ)，亦是遺傳信息傳遞和表達(dá)的分子基礎(chǔ)。該模型的提出是上個(gè)世紀(jì)生命科學(xué)的重大突破之一，它奠定了生物化學(xué)和分子生物學(xué)乃至整個(gè)生命科學(xué)飛速發(fā)展的基石。DNA雙螺旋構(gòu)象的類(lèi)型（三）DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)-超螺旋1）超螺旋是指雙螺旋進(jìn)一步扭曲或再螺旋的構(gòu)象。2）正超

11、螺旋（變緊，過(guò)旋）和負(fù)超螺旋（變松，欠旋）。3）人類(lèi)46條染色體的DNA總長(zhǎng)可達(dá)1.7m，經(jīng)過(guò)螺旋化壓縮，實(shí)際總長(zhǎng)只有200nm。負(fù)超螺旋核小體盤(pán)繞及染色質(zhì)示意圖DNA的存在形式-核小體真核生物中DNA雙螺旋沿著組蛋白八聚體核心的短軸繞1.75圈，形成左手超螺旋，稱(chēng)核小體。染色質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位是核小體。串珠狀結(jié)構(gòu)進(jìn)一步卷曲形成螺線管，后者再進(jìn)一步卷曲形成超螺旋管，形成染色單體?；蚝突蚪M基因即一段有功能的DNA片段，生物細(xì)胞中DNA分子的最小功能單位（交換單位）。一個(gè)細(xì)胞或生物體所含的全套基因稱(chēng)基因組。二、RNA的分子結(jié)構(gòu)（一） RNA的分類(lèi)及特點(diǎn)（二） RNA分子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn) （一）RNA的

12、特點(diǎn)及分類(lèi)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：1. 堿基組成：A、G、C、U （AU/GC）；2. 稀有堿基較多，穩(wěn)定性較差，易水解；3. 多為單鏈結(jié)構(gòu)，少數(shù)局部形成螺旋（發(fā)夾結(jié)構(gòu)）；4. 分子較小。分類(lèi)：1. 信使RNA（ mRNA）2. 轉(zhuǎn)運(yùn)RNA （ tRNA）3. 核糖體RNA （r RNA） Messenger RNA約占總RNA的3%-5%，含量最少，種類(lèi)最多。成熟mRNA不含內(nèi)含子，hnRNA含有。mRNA從DNA轉(zhuǎn)錄遺傳信息，并作為蛋白質(zhì)合成的模板，決定蛋白質(zhì)的氨基酸順序。Ribosome RNA 約占全部RNA的80%，含量最多。與多種蛋白質(zhì)結(jié)合成核糖體，后者是合成蛋白質(zhì)的場(chǎng)所。原核生物真核生物核糖體

13、rRNA核糖體rRNA 30s70s 50s16s5s 、23s 40s 80s 50s 18s5s、5.8s、28sTransfer RNA約占總RNA的10-15%，分子最小。它在蛋白質(zhì)生物合成中起翻譯mRNA信息，并將相應(yīng)的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)到核糖體，參與蛋白質(zhì)體的合成。已知每一個(gè)氨基酸至少有一個(gè)相應(yīng)的tRNA。（二）RNA分子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)tRNA 的結(jié)構(gòu)二級(jí)結(jié)構(gòu)特征： 單鏈 三葉草葉形 四臂四環(huán)三級(jí)結(jié)構(gòu) 特征： 在二級(jí)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上進(jìn)一步折疊扭曲形成倒L型酵母tRNA Ala 的二級(jí)結(jié)構(gòu)DHU環(huán)IGC反密碼子反密碼環(huán)氨基酸臂可變環(huán)TC環(huán)CCAAla352） rRNA的分子結(jié)構(gòu)特征： 單鏈，螺旋化程度

14、較tRNA低 與蛋白質(zhì)組成核糖體后方能發(fā)揮其功能5SRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu) 3）mRNA的分子結(jié)構(gòu)在轉(zhuǎn)錄一章講授第四節(jié) 核酸的性質(zhì)一、一般物理性質(zhì)二、核酸的水解三、兩性解離四、紫外吸收性質(zhì)五、穩(wěn)定性六、變性七、復(fù)性與雜交一、一般物理性質(zhì)1. DNA白色纖維狀固體，RNA白色粉末狀固體，都微溶于水，不溶于乙醇，因此常用乙醇來(lái)沉淀DNA ； DNA溶液黏度大于RNA 。2. DNA難溶于0.14mol/L的NaCl溶液，可溶于 12 mol/L的NaCl溶液，RNA則相反，可據(jù)此分離二者。3. 加熱條件下， D核糖濃鹽酸苔黑酚 綠色 D2脫氧核糖酸二苯胺 藍(lán)紫色二、核酸的水解核酸分子中的磷酸二酯鍵可在酸

15、或堿性條件下水解切斷。DNA和RNA對(duì)酸或堿的耐受程度有很大差別。室溫條件下，DNA在堿中變性，但不水解，RNA水解。在細(xì)胞內(nèi)核酸分子受DNA酶作用。三、兩性解離核酸含酸性的磷酸基團(tuán)，又含弱堿性的堿基，為兩性電解質(zhì)，可發(fā)生兩性解離；核酸相當(dāng)于多元酸，pH大于4時(shí)，呈陰離子狀態(tài)；等電點(diǎn)四、紫外吸收在核酸分子中嘌呤堿和嘧啶堿都含有共軛雙鍵體系，在260 nm有吸收；可以作為區(qū)別蛋白質(zhì)和對(duì)核酸及其組份定性和定量測(cè)定的依據(jù)，進(jìn)行核酸純度鑒定，也可作為核酸變性和復(fù)性的指標(biāo)。DNA的紫外吸收光譜天然DNA變性DNA核苷酸總吸收值1232202402602800.10.20.30.4波長(zhǎng)（nm）光吸收123

16、根據(jù)A260/A280的比值判斷核酸樣品的純度純DNA：A260/A280=1.8 純RNA：A260/A280=2.0（若樣品中含有雜蛋白或苯酚，則A260/A280比值明顯降低）純的核酸樣品可根據(jù)260nm的光吸收值算出其含量若260nm光吸收值為1相當(dāng)于50g/ml雙螺旋DNA或相當(dāng)于40g/ml單鏈DNA或RNA或相當(dāng)于20g/ml寡核苷酸。五、DNA的穩(wěn)定性1.DNA的溶液呈粘稠狀，但實(shí)際上DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)僵直而有剛性，易斷成碎片，這也是目前難以獲得完整大分子DNA的原因。2.溶液狀態(tài)的DNA易受DNA酶作用而降解，抽干水分的DNA性質(zhì)十分穩(wěn)定。六、DNA的變性1. 概念2. 變性

17、條件3. 變性的特征1. 概念是指核酸雙螺旋區(qū)的多聚核苷酸鏈間的氫鍵斷裂，變成單鏈結(jié)構(gòu)的過(guò)程。2.DNA的變性的條件能夠引起核酸變性的因素有：1）溫度升高；2）酸堿度改變、 pH（11.3或5.0）；3）有機(jī)溶劑如甲醛和尿素、甲酰胺等；4）低離子強(qiáng)度。3.DNA變性的特征變性核酸將失去其部分或全部的生物活性。變性改變了DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)。核酸的變性并不涉及磷酸二酯鍵的斷裂，所以它的一級(jí)結(jié)構(gòu)(堿基順序)保持不變。DNA的變性過(guò)程是突變性的，它在很窄的溫度區(qū)間內(nèi)完成。 DNA解鏈溫度紫外吸收值明顯增加，即增色效應(yīng)。粘度降低，沉降系數(shù)增加。DNA解鏈溫度（熔點(diǎn)，Tm ）當(dāng)50% 的DNA變性時(shí)的溫度稱(chēng)

18、為該DNA的解鏈溫度，即增色效應(yīng)達(dá)到一半時(shí)的溫度；一般DNA的Tm值在70-85C之間。均一DNA（如病毒）的Tm值范圍較小。分子中G和C的含量越高，越不易變性，Tm值越高。可通過(guò)經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算：（G+C)%=(Tm-69.3)X2.44Tm值隨溶液鹽濃度增加而增大， Tm值較低，易變性，不易保存。溶解曲線與Tm。影響Tm值的因素 DNA的均一性 DNA中G-C對(duì)的含量 經(jīng)驗(yàn)式: (G-C)%=(Tm-69.3)2.44 鹽離子強(qiáng)度 增色效應(yīng)與減色效應(yīng) 天然DNA分子在熱變性條件下，雙螺旋結(jié)構(gòu)破壞，堿基暴露，在紫外光260nm波長(zhǎng)處的吸收度明顯增加，此現(xiàn)象稱(chēng)為增色效應(yīng)。 變性DNA分子復(fù)性形成雙

19、螺旋結(jié)構(gòu)時(shí)其紫外吸收降低的現(xiàn)象稱(chēng)為減色效應(yīng)。七、DNA的復(fù)性概念復(fù)性的條件3. 影響復(fù)性的因素4. 復(fù)性動(dòng)力學(xué)5. 分子雜交1. 概念1.變性DNA在適當(dāng)?shù)臈l件下，兩條彼此分開(kāi)的單鏈可以重新締合成為雙螺旋結(jié)構(gòu)，其物理性質(zhì)和生物活性隨之恢復(fù)，這一過(guò)程稱(chēng)為復(fù)性；2.對(duì)于熱變性的DNA，在緩慢冷卻的條件下可重新結(jié)合恢復(fù)雙螺旋結(jié)構(gòu)，稱(chēng)為退火。3.DNA復(fù)性后，一系列性質(zhì)將得到恢復(fù)，但是生物活性一般只能得到部分的恢復(fù)。DNA的復(fù)性圖示2.DNA的復(fù)性條件1.將熱變性的DNA驟然冷卻至低溫時(shí)，DNA不可能復(fù)性。即淬火。2.將變性的DNA緩慢冷卻時(shí)，可以復(fù)性。退火溫度Tm253.分子量越大復(fù)性越難。濃度越大

20、，復(fù)性越容易。此外，DNA的復(fù)性需要一定的鹽濃度，也與它本身的組成和結(jié)構(gòu)有關(guān)。高于Tm值5 復(fù)性 也稱(chēng)退火 3. 影響復(fù)性的因素 樣品的性質(zhì) DNA的濃度 DNA片段的大小 溫度 離子強(qiáng)度 4.復(fù)性動(dòng)力學(xué) DNA的復(fù)性過(guò)程是一種雙分子反應(yīng) S：single strand DNA D：double strand DNA Cot : 時(shí)的Cot值，即指復(fù)性完成一半時(shí)的Cot值。 5.分子雜交1.在變性的DNA溶液中加入外源DNA單鏈分子或RNA單鏈分子（與原DNA具有同源性），去掉變性條件后復(fù)性形成雙螺旋結(jié)構(gòu)的過(guò)程。2.這樣形成的新分子稱(chēng)為雜交DNA分子。3.利用核酸雜交可檢測(cè)特定的核苷酸片段或研

21、究同源性等。分子雜交 探針：用于雜交的異源DNA或RNA序列，其核苷酸序列是人工特定的、已知的，經(jīng)放射性標(biāo)記的一條鏈。核酸的變性、復(fù)性和雜交變性（加熱）探針雜交（緩慢冷卻）復(fù)性（緩慢冷卻）分子雜交的種類(lèi)Southern Blot：DNA-DNA雜交Northern Blot：DNA-RNA雜交Western Blot：抗原-抗體進(jìn)行雜交原位雜交：活體組織上進(jìn)行雜交，顯出熒光Southern印跡法DNA分子限制片段限制性酶切割瓊脂糖電泳轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上與放射性標(biāo)記DNA探針雜交放射自顯影帶有DNA片段的凝膠凝膠濾膜用緩沖液轉(zhuǎn)移DNA吸附有DNA片段的膜第五節(jié) 核酸的研究方法 一、核酸的分離、提取通則 為了得到完整的大分子核酸，一般要注意3點(diǎn) ：1保持低溫（04）。2防止過(guò)酸、過(guò)堿，避免劇烈攪拌。3防止核酸酶的作用。 抑制DNase： 可加檸檬酸鈉、E