生物化學合工大第四章核酸化學課件

1、第四章核酸化學Nucleic Acid chemistry第一節(jié) 概述第二節(jié) 核酸的化學組成第三節(jié) 核酸的分子結構第四節(jié) 核酸的性質第五節(jié) 核酸的研究方法本章內(nèi)容第一節(jié)概 述 核酸（nucleic acidNA）是一類重要的生物大分子，擔負著生命信息的儲存與傳遞。 核酸是現(xiàn)代生物化學、分子生物學的重要研究領域，是基因工程操作的核心分子。1868 F. Miescher從膿細胞的細胞核中分離出了一 種含磷酸的有機物，當時稱為核素（nuclein）,后稱為核酸（nucleic acid）。1944 Avery 等通過肺炎球菌轉化試驗證明DNA是遺傳物質。1952 Hershey, Chase-噬菌

2、體標記實驗。1953 Watson和Crick提出DNA結構的雙螺旋模型。1958 Crick提出遺傳信息傳遞的中心法則。1973 Boyer，Cohen-DNA Cloning(克?。?。1976 DNA Sequencing(序列分析）。1990 Human Genome Project（人類基因組計劃）。一、核酸的研究歷史光滑型細胞（有毒）粗糙型細胞（無毒）破碎細胞DNAase降解后的DNA粗糙型細胞接受光滑型DNA只有粗糙型大多數(shù)仍為粗糙型少數(shù)光滑型細胞被轉化SSRRR+DNA1944年Avery細菌轉化實驗肺炎球菌（pneumococcus） 1928年細菌學家Griffith 細菌毒

3、性實驗 噬菌體感染實驗 1952年美國Hershey 噬菌體感染實驗 真核生物 原核生物 細胞核（98%） 擬核 線粒體mDNA （少量） 質粒DNA（plasmid） 葉綠體ctDNA （少量）等 病毒DNA 細胞質（90%） 細胞質 核仁（少量） 病毒RNA 二、核酸的種類和分布 DNA脫氧核糖核酸 RNA核糖核酸注：生物細胞都含有DNA 和 RNA； 病毒中只含 DNA 或 只含 RNA。第二節(jié)核酸的化學組成 核酸是由幾十個甚至幾千萬個核苷酸聚合而成的具有一定空間結構的生物大分子。 基本元素：C、H、O、N、P ；其中P 的含量比較穩(wěn)定，占9%-10%，通過測定P 的含量來推算核酸的含量

4、（定磷法）。磷酸 核苷 堿基 戊糖 核酸核苷酸 一、戊糖 組成核酸的戊糖有兩種。DNA所含的糖為-D-2-脫氧核糖；RNA所含的糖則為-D-核糖。二、堿基1. 嘌呤（Purine） 腺嘌呤AdenineA 鳥嘌呤guanineG2. 嘧啶（Pyrimidine）胸腺嘧啶T胞嘧啶C尿嘧啶U 核酸中也存在一些不常見的稀有堿基。稀有堿基的種類很多，大部分是上述堿基的甲基化產(chǎn)物。二氫尿嘧啶 （DHU）修飾堿基的簡寫符號 ( 為1時可以不寫 )三、核苷（nucleoside）核苷：戊糖+堿基 糖與堿基之間的C-N鍵，稱為C-N糖苷鍵核苷中戊糖與堿基的連接方式：12345(OH)12345(OH)修飾核苷

5、/稀有核苷修飾核苷包括三種情況: （1）由修飾堿基和糖組成的核苷 （2）由非修飾堿基和2-O-甲基核糖組成的核苷 （3）由堿基與糖連接方式特殊的核苷 （1）（2）二氫尿嘧啶核苷 (Am)（3）()取代基用下列小寫英文字母表示 :甲基m 乙酰基ac 氨基n 甲硫基ms 羥基o或h 硫基s 異戊烯基i 羧基c 例：四、核苷酸（nucleotide） 核苷酸： 核苷+磷酸 戊糖+堿基+磷酸H五、游離核苷酸及其衍生物的形式1. 繼續(xù)磷酸化2.環(huán)化磷酸化 cAMP cGMP3.輔酶 NAD、NADP、FAD、HSCoAFADNAD、NADPHSCoA4. GDP-半乳糖、GDP-葡萄糖等是糖蛋白 生物合

6、成和多糖生物合成的活性糖 基供體。 第三節(jié) 核酸的分子結構 一、DNA的結構一級結構: DNA核苷酸鏈中脫氧核苷 酸的組成和排列順序。二級結構：DNA的兩條多聚鏈間通過 氫鍵形成的雙螺旋結構。三級結構：DNA雙鏈進一步折疊卷曲 形成的構象。（一）DNA的一級結構 由dAMP、dGMP、 dCMP、 dTMP核苷酸單體通過3,5-磷酸二酯鍵相連而成的鏈狀聚合物。5533結構式5-磷酸端（常用5-P表示）；3-羥基端（常用3 -OH表示）核苷酸鏈具有方向性，當表示一個核苷酸鏈時，必須注明它的方向是53或是35。字母式5PAPCPGPCPTPGPTPAOH 3 5 PACGCTGTAOH 3線條式O

7、HDNA的一級結構也可指DNA分子中堿基的順序。DNA的堿基順序本身就是遺傳信息存儲的分子形式。生物界物種的多樣性即寓于DNA分子中四種核苷酸千變?nèi)f化的不同排列組合之中。（二）DNA的二級結構Watson 和 Crick 于1953年提出了DNA 雙螺旋結構模型，說明了DNA 的二級結構。（即B型DNA）（1）Chargaff定則 （1950s,E. Chargaff發(fā)現(xiàn)）DNA堿基組成符合： A=T；G=C； A+G=T+C。不對稱比率：A+T/G+C； 物種不同，DNA堿基組成不同； 物種親緣愈接近，堿基組成也愈接近，該比 率越相近似。.具有種的特異性，沒有器官和組織的特異性，年齡、營養(yǎng)狀

8、況、環(huán)境的改變不影響DNA的堿基組成。1提出DNA雙螺旋結構模型的根據(jù) （2）x-光衍射分析 20世紀40年代Astbury 1952年M.Wilkins 2DNA雙螺旋結構模型（double-helical structure） 1953年Watson和Crick提出了DNA雙螺旋結構。 DNA雙螺旋結構模型要點（1）螺旋中的兩條鏈反向平行，即其中一條鏈的方向為53，而另一條鏈的方向為35，兩條鏈共同圍繞一個假想的中心軸呈右手雙螺旋結構。 DNA雙螺旋結構模型要點（2）疏水的堿基位于雙螺旋的內(nèi)側，親水的磷酸和脫氧核糖基位于螺旋外側。堿基平面與螺旋軸垂直，脫氧核糖平面與中心軸平行。由于幾何形狀

9、的限制，堿基對只能由嘌呤和嘧啶配對，即A與T，G與C。這種配對關系，稱為堿基互補。A和T之間形成兩個氫鍵， G與C之間形成三個氫鍵。T-A堿基對C-G堿基對DNA雙螺旋結構模型要點（3）由于堿基對排列的方向性，使得堿基對占據(jù)的空間是不對稱的，因此，在雙螺旋的表面形成大小兩個凹槽，分別稱為大溝和小溝，二者交替出現(xiàn)。2.0 nm小溝大溝DNA雙螺旋結構模型要點（4）雙螺旋橫截面的直徑約為2 nm，相鄰兩個堿基平面之間的距離（軸距）為0.34 nm，每10個核苷酸形成一個螺旋，其螺距（即螺旋旋轉一圈）的高度）為3.4 nm。2.0 nm小溝大溝DNA雙螺旋結構模型要點（5）兩條鏈借堿基之間的氫鍵和堿

10、基堆積力（即堿基之間的范德華力）牢固的連接起來，維持DNA雙螺旋的三維結構。兩條鏈是堿基互補關系。3. DNA的雙螺旋結構穩(wěn)定因素 氫鍵 堿基堆積力 磷酸基上負電荷被胞內(nèi)組蛋白或正離子中和堿基處于疏水環(huán)境中4. DNA的雙螺旋結構的意義 該模型揭示了DNA作為遺傳物質的穩(wěn)定性特征，最有價值的是確認了堿基配對原則，這是DNA復制、轉錄和反轉錄的分子基礎，亦是遺傳信息傳遞和表達的分子基礎。該模型的提出是上個世紀生命科學的重大突破之一，它奠定了生物化學和分子生物學乃至整個生命科學飛速發(fā)展的基石。DNA雙螺旋構象的類型（三）DNA的三級結構-超螺旋1）超螺旋是指雙螺旋進一步扭曲或再螺旋的構象。2）正超

11、螺旋（變緊，過旋）和負超螺旋（變松，欠旋）。3）人類46條染色體的DNA總長可達1.7m，經(jīng)過螺旋化壓縮，實際總長只有200nm。負超螺旋核小體盤繞及染色質示意圖DNA的存在形式-核小體真核生物中DNA雙螺旋沿著組蛋白八聚體核心的短軸繞1.75圈，形成左手超螺旋，稱核小體。染色質的基本結構單位是核小體。串珠狀結構進一步卷曲形成螺線管，后者再進一步卷曲形成超螺旋管，形成染色單體?；蚝突蚪M基因即一段有功能的DNA片段，生物細胞中DNA分子的最小功能單位（交換單位）。一個細胞或生物體所含的全套基因稱基因組。二、RNA的分子結構（一） RNA的分類及特點（二） RNA分子的結構特點 （一）RNA的

12、特點及分類結構特點：1. 堿基組成：A、G、C、U （AU/GC）；2. 稀有堿基較多，穩(wěn)定性較差，易水解；3. 多為單鏈結構，少數(shù)局部形成螺旋（發(fā)夾結構）；4. 分子較小。分類：1. 信使RNA（ mRNA）2. 轉運RNA （ tRNA）3. 核糖體RNA （r RNA） Messenger RNA約占總RNA的3%-5%，含量最少，種類最多。成熟mRNA不含內(nèi)含子，hnRNA含有。mRNA從DNA轉錄遺傳信息，并作為蛋白質合成的模板，決定蛋白質的氨基酸順序。Ribosome RNA 約占全部RNA的80%，含量最多。與多種蛋白質結合成核糖體，后者是合成蛋白質的場所。原核生物真核生物核糖體

13、rRNA核糖體rRNA 30s70s 50s16s5s 、23s 40s 80s 50s 18s5s、5.8s、28sTransfer RNA約占總RNA的10-15%，分子最小。它在蛋白質生物合成中起翻譯mRNA信息，并將相應的氨基酸轉運到核糖體，參與蛋白質體的合成。已知每一個氨基酸至少有一個相應的tRNA。（二）RNA分子的結構特點tRNA 的結構二級結構特征： 單鏈 三葉草葉形 四臂四環(huán)三級結構 特征： 在二級結構基礎上進一步折疊扭曲形成倒L型酵母tRNA Ala 的二級結構DHU環(huán)IGC反密碼子反密碼環(huán)氨基酸臂可變環(huán)TC環(huán)CCAAla352） rRNA的分子結構特征： 單鏈，螺旋化程度

14、較tRNA低 與蛋白質組成核糖體后方能發(fā)揮其功能5SRNA的二級結構 3）mRNA的分子結構在轉錄一章講授第四節(jié) 核酸的性質一、一般物理性質二、核酸的水解三、兩性解離四、紫外吸收性質五、穩(wěn)定性六、變性七、復性與雜交一、一般物理性質1. DNA白色纖維狀固體，RNA白色粉末狀固體，都微溶于水，不溶于乙醇，因此常用乙醇來沉淀DNA ； DNA溶液黏度大于RNA 。2. DNA難溶于0.14mol/L的NaCl溶液，可溶于 12 mol/L的NaCl溶液，RNA則相反，可據(jù)此分離二者。3. 加熱條件下， D核糖濃鹽酸苔黑酚 綠色 D2脫氧核糖酸二苯胺 藍紫色二、核酸的水解核酸分子中的磷酸二酯鍵可在酸

15、或堿性條件下水解切斷。DNA和RNA對酸或堿的耐受程度有很大差別。室溫條件下，DNA在堿中變性，但不水解，RNA水解。在細胞內(nèi)核酸分子受DNA酶作用。三、兩性解離核酸含酸性的磷酸基團，又含弱堿性的堿基，為兩性電解質，可發(fā)生兩性解離；核酸相當于多元酸，pH大于4時，呈陰離子狀態(tài)；等電點四、紫外吸收在核酸分子中嘌呤堿和嘧啶堿都含有共軛雙鍵體系，在260 nm有吸收；可以作為區(qū)別蛋白質和對核酸及其組份定性和定量測定的依據(jù)，進行核酸純度鑒定，也可作為核酸變性和復性的指標。DNA的紫外吸收光譜天然DNA變性DNA核苷酸總吸收值1232202402602800.10.20.30.4波長（nm）光吸收123

16、根據(jù)A260/A280的比值判斷核酸樣品的純度純DNA：A260/A280=1.8 純RNA：A260/A280=2.0（若樣品中含有雜蛋白或苯酚，則A260/A280比值明顯降低）純的核酸樣品可根據(jù)260nm的光吸收值算出其含量若260nm光吸收值為1相當于50g/ml雙螺旋DNA或相當于40g/ml單鏈DNA或RNA或相當于20g/ml寡核苷酸。五、DNA的穩(wěn)定性1.DNA的溶液呈粘稠狀，但實際上DNA的雙螺旋結構僵直而有剛性，易斷成碎片，這也是目前難以獲得完整大分子DNA的原因。2.溶液狀態(tài)的DNA易受DNA酶作用而降解，抽干水分的DNA性質十分穩(wěn)定。六、DNA的變性1. 概念2. 變性

17、條件3. 變性的特征1. 概念是指核酸雙螺旋區(qū)的多聚核苷酸鏈間的氫鍵斷裂，變成單鏈結構的過程。2.DNA的變性的條件能夠引起核酸變性的因素有：1）溫度升高；2）酸堿度改變、 pH（11.3或5.0）；3）有機溶劑如甲醛和尿素、甲酰胺等；4）低離子強度。3.DNA變性的特征變性核酸將失去其部分或全部的生物活性。變性改變了DNA的二級結構。核酸的變性并不涉及磷酸二酯鍵的斷裂，所以它的一級結構(堿基順序)保持不變。DNA的變性過程是突變性的，它在很窄的溫度區(qū)間內(nèi)完成。 DNA解鏈溫度紫外吸收值明顯增加，即增色效應。粘度降低，沉降系數(shù)增加。DNA解鏈溫度（熔點，Tm ）當50% 的DNA變性時的溫度稱

18、為該DNA的解鏈溫度，即增色效應達到一半時的溫度；一般DNA的Tm值在70-85C之間。均一DNA（如病毒）的Tm值范圍較小。分子中G和C的含量越高，越不易變性，Tm值越高。可通過經(jīng)驗公式計算：（G+C)%=(Tm-69.3)X2.44Tm值隨溶液鹽濃度增加而增大， Tm值較低，易變性，不易保存。溶解曲線與Tm。影響Tm值的因素 DNA的均一性 DNA中G-C對的含量 經(jīng)驗式: (G-C)%=(Tm-69.3)2.44 鹽離子強度 增色效應與減色效應 天然DNA分子在熱變性條件下，雙螺旋結構破壞，堿基暴露，在紫外光260nm波長處的吸收度明顯增加，此現(xiàn)象稱為增色效應。 變性DNA分子復性形成雙

19、螺旋結構時其紫外吸收降低的現(xiàn)象稱為減色效應。七、DNA的復性概念復性的條件3. 影響復性的因素4. 復性動力學5. 分子雜交1. 概念1.變性DNA在適當?shù)臈l件下，兩條彼此分開的單鏈可以重新締合成為雙螺旋結構，其物理性質和生物活性隨之恢復，這一過程稱為復性；2.對于熱變性的DNA，在緩慢冷卻的條件下可重新結合恢復雙螺旋結構，稱為退火。3.DNA復性后，一系列性質將得到恢復，但是生物活性一般只能得到部分的恢復。DNA的復性圖示2.DNA的復性條件1.將熱變性的DNA驟然冷卻至低溫時，DNA不可能復性。即淬火。2.將變性的DNA緩慢冷卻時，可以復性。退火溫度Tm253.分子量越大復性越難。濃度越大

20、，復性越容易。此外，DNA的復性需要一定的鹽濃度，也與它本身的組成和結構有關。高于Tm值5 復性 也稱退火 3. 影響復性的因素 樣品的性質 DNA的濃度 DNA片段的大小 溫度 離子強度 4.復性動力學 DNA的復性過程是一種雙分子反應 S：single strand DNA D：double strand DNA Cot : 時的Cot值，即指復性完成一半時的Cot值。 5.分子雜交1.在變性的DNA溶液中加入外源DNA單鏈分子或RNA單鏈分子（與原DNA具有同源性），去掉變性條件后復性形成雙螺旋結構的過程。2.這樣形成的新分子稱為雜交DNA分子。3.利用核酸雜交可檢測特定的核苷酸片段或研

21、究同源性等。分子雜交 探針：用于雜交的異源DNA或RNA序列，其核苷酸序列是人工特定的、已知的，經(jīng)放射性標記的一條鏈。核酸的變性、復性和雜交變性（加熱）探針雜交（緩慢冷卻）復性（緩慢冷卻）分子雜交的種類Southern Blot：DNA-DNA雜交Northern Blot：DNA-RNA雜交Western Blot：抗原-抗體進行雜交原位雜交：活體組織上進行雜交，顯出熒光Southern印跡法DNA分子限制片段限制性酶切割瓊脂糖電泳轉移至硝酸纖維素膜上與放射性標記DNA探針雜交放射自顯影帶有DNA片段的凝膠凝膠濾膜用緩沖液轉移DNA吸附有DNA片段的膜第五節(jié) 核酸的研究方法 一、核酸的分離、提取通則 為了得到完整的大分子核酸，一般要注意3點 ：1保持低溫（04）。2防止過酸、過堿，避免劇烈攪拌。3防止核酸酶的作用。 抑制DNase： 可加檸檬酸鈉、E