《衛(wèi)生化學》課件11.色譜分析導論

1、第15章 色譜分析方法導論15.1 概述歷史、色譜分離過程、分類15.2 色譜流出曲線色譜圖及相關(guān)術(shù)語15.3 色譜法基本原理描述分配過程參數(shù)、峰間距、峰形狀和峰寬的理論描述(塔板理論及速率理論)15.4 分離度及色譜分離方程分離度及色譜分離方程、影響分離的因素15.1 概述 化學分析方法的基本要求是其選擇性要高。即，在分析過程中，待測物與潛在的干擾物的分離是最為重要的步驟！20 世紀中期，大量采用一些經(jīng)典的分離方法：沉淀、蒸餾和萃取 現(xiàn)代分析中，大量采用色譜和電泳分離方法。迄今為止，色譜方法是最為有效的分離手段！其應用涉及每個科學領域。歷史：1903年，俄國植物學家Mikhail Tswet

2、t 最先發(fā)明。他采用填充有固 體CaCO3細粒子的玻璃柱，將植物色素的混合物(葉綠素和葉黃素 chlorophylls & xanthophylls)加于柱頂端，然后以溶劑淋洗，被分 離的組份在柱中顯示了不同的色帶，他稱之為色譜 (希臘語中 “chroma”=color; “graphein”=write) 。 50年代，色譜發(fā)展最快（一些新型色譜技術(shù)的發(fā)展；復雜組分分析發(fā)展的要求。 1937-1972年，15年中有12個Nobel獎是有關(guān)色譜研究的！色譜分離基本原理： 使用外力使含有樣品的流動相（氣體、液體或超臨界流體）通過一固定于柱或平板上、與流動相互不相溶的固定相表面。樣品中各組份在兩相

3、中進行不同程度的作用。與固定相作用強的組份隨流動相流出的速度慢，反之，與固定相作用弱的組份隨流動相流出的速度快。由于流出的速度的差異，使得混合組份最終形成各個單組份的“帶(band)”或“區(qū)(zone)”，對依次流出的各個單組份物質(zhì)可分別進行定性、定量分析。色譜分類方法：1. 按固定相外形分： 柱色譜（填充柱、空心柱）、平板色譜（薄層色譜和紙色譜。2. 按組份在固定相上的分離機理分： 吸附色譜：不同組份在固定相的吸附作用不同； 分配色譜：不同組份在固定相上的溶解能力不同； 離子交換色譜：不同組份在固定相（離子交換劑）上的親和力不同； 凝膠色譜（尺寸排阻色譜）不同尺寸分子在固定相上的滲透作用。3

4、. 按兩相狀態(tài)分15.2 色譜流出曲線（色譜圖） 混合組分的分離過程及檢測器對各組份在不同階段的響應色譜術(shù)語：1）基線：在實驗條件下，色譜柱后僅有純流動相進入檢測器時的流出曲線稱為基線，S/N大的、穩(wěn)定的基線為水平直線。2）峰高：色譜峰頂點與基線的距離。3）保留值(Retention value, R) a. 死時間(Dead time, t0) ：不與固定相作用的物質(zhì)從進樣到出現(xiàn)峰極大值時的時間，它與色譜柱的空隙體積成正比。由于該物質(zhì)不與固定相作用，因此，其流速與流動相的流速相近。據(jù) t0 可求出流動相平均流速 b. 保留時間tr：試樣從進樣到出現(xiàn)峰極大值時的時間。它包括組份隨流動相通過柱子

5、的時間t0和組份在固定相中滯留的時間。 c. 調(diào)整保留時間 ：某組份的保留時間扣除死時間后的保留時間，它是組份在固定相中的滯留時間。即 由于時間為色譜定性依據(jù)。但同一組份的保留時間與流速有關(guān)，因此有時需用保留體積來表示保留值。 d. 死體積V0：色譜柱管內(nèi)固定相顆粒間空隙、色譜儀管路和連接頭間空隙和檢測器間隙的總和。勿略后兩項可得到：其中，F(xiàn)co為柱出口的載氣流速（mL/min)，其值為：F0-檢測器出口流速；Tr-室溫；Tc-柱溫；p0-大氣壓；pw-室溫時水蒸汽壓。 e. 保留體積Vr：指從進樣到待測物在柱后出現(xiàn)濃度極大點時所通過的流動相的體積。 f. 調(diào)整保留體積 ：某組份的保留體積扣除

6、死體積后的體積。 g. 相對保留值r2,1：組份2的調(diào)整保留值與組份1的調(diào)整保留值之比。注意： r2,1只與柱溫和固定相性質(zhì)有關(guān)，而與柱內(nèi)徑、柱長L、填充情況及流動相流速無關(guān)，因此，在色譜分析中，尤其是GC中廣泛用于定性的依據(jù)！具體做法：固定一個色譜峰為標準s，然后再求其它峰 i 對標準峰的相對保留值，此時以 表示： 1, 又稱選擇因子(Selectivity factor)。 h. 區(qū)域?qū)挾龋河糜诤饬恐Ъ胺从成V操作條件下的動力學因素。通常有三種表示方法：標準偏差：0.607倍峰寬處的一半。半峰寬W1/2：峰高一半處的峰寬。W1/2=2.354 峰底寬W：色譜峰兩側(cè)拐點上切線與基線的交點間

7、的距離。W= 4色譜流出曲線的意義： 色譜峰數(shù)=樣品中單組份的最少個數(shù)； 色譜保留值定性依據(jù)； 色譜峰高或面積定量依據(jù)； 色譜保留值或區(qū)域?qū)挾壬V柱分離效能評價指標； 色譜峰間距固定相或流動相選擇是否合適的依據(jù)。15.3 色譜法基本原理兩組份峰間距足夠遠：由各組份在兩相間的分配系數(shù)決定，即由色譜過程的 熱力學性質(zhì)決定。每個組份峰寬足夠?。河山M份在色譜柱中的傳質(zhì)和擴散決定，即由色譜過程 動力學性質(zhì)決定。 因此，研究、解釋色譜分離行為應從熱力學和動力學兩方面進行。一、描述分配過程的參數(shù) 分配系數(shù)(Distribution constant, K)： 描述組份在固定相和流動相間的分配過程或吸附-脫附

8、過程的參數(shù)，稱為分配系數(shù)。K 只與固定相和溫度有關(guān)，與兩相體積、柱管特性和所用儀器無關(guān)。2. 分配比(Retention factor or capacity factor, k)： 在一定溫度和壓力下，組份在兩相間的分配達平衡時，分配在固定相和流動相中的質(zhì)量比，稱為分配比它反映了組分在柱中的遷移速率。又稱保留因子。其中VmV0，Vs為固定相體積。分配比 k 的求算：1）組分滯留因子：2）又，3）因此，3. K 與 k 的關(guān)系： 稱為相比率，它也是反映色譜柱柱型特點的參數(shù)。對填充柱，=635；對毛細管柱， =60600。4. 選擇因子 ：色譜柱對A、B兩組分的選擇因子 定義如下：A為先流出的組

9、分，B為后流出的組分。注意：K 或 k 反映的是某一組分在兩相間的分配；而 是反映兩組分間的分離情況！當兩組分 K 或 k 相同時， =1 時，兩組分不能分開；當兩組分 K 或 k 相差越大時， 越大，分離得越好。也就是說，兩組分在兩相間的分配系數(shù)不同，是色譜分離的先決條件。 和 k 是計算色譜柱分離效能的重要參數(shù)！二、峰間距、峰形狀和峰寬的理論描述1. 塔板理論（Plate theory) 1952年，Martin等人提出的塔板理論將一根色譜柱當作一個由許多塔板組成的精餾塔，用塔板概念來描述組分在柱中的分配行為。塔板是從精餾中借用的，是一種半經(jīng)驗理論，但它成功地解釋了色譜流出曲線呈正態(tài)分布。

10、 塔板理論假定：1）塔板之間不連續(xù)；2）塔板之間無分子擴散；3）組分在各塔板內(nèi)兩相間的分配瞬間達至平衡，達一次平衡所需柱長為理論 塔板高度H；4）某組分在所有塔板上的分配系數(shù)相同；5）流動相以不連續(xù)方式加入，即以一個一個的塔板體積加入。 當塔板數(shù)n較少時，組分在柱內(nèi)達分配平衡的次數(shù)較少，流出曲線呈峰形，但不對稱；當塔板數(shù)n50時，峰形接近正態(tài)分布。2 氣相色譜基本理論一、塔板理論 根據(jù)呈正態(tài)分布的色譜流出曲線可以導出計算塔板數(shù)n的公式，用以評價一根柱子的柱效。由于色譜柱并無真正的塔板，故塔板數(shù)又稱理論塔板數(shù)：可見理論塔板數(shù)由組分保留值和峰寬決定。 若柱長為L，則每塊理論塔板高度H為 由上述兩式

11、知道，理論塔板數(shù)n越多、理論塔板高度H越小、色譜峰越窄，則柱效越高。 但上述兩式包含死時間t0，它與組分在柱內(nèi)的分配無關(guān)，因此不能真正反映色譜柱的柱效。通常以有效塔板數(shù)neff 和有效塔板高度Heff 表示：有關(guān)塔板理論的說明：1）說明柱效時，必須注明該柱效是針對何種物質(zhì)、固定液種類及其含量、流動相種類及流速、操作條件等；2）應定期對柱效進行評價，以防柱效下降、延長柱壽命。3）塔板理論描述了組分在柱內(nèi)的分配平衡和分離過程、導出流出曲線的數(shù)學模型、解釋了流出曲線形狀和位置、提出了計算和評價柱效的參數(shù)。 但該理論是在理想情況下導出的，未考慮分子擴散因素、其它動力學因素對柱內(nèi)傳質(zhì)的影響。因此它不能解

12、釋： 峰形為什么會擴張？ 影響柱效的動力學因素是什么？2. 速率理論（Rate theory） 1956年，荷蘭化學工程師van Deemter提出了色譜過程動力學速率理論：吸收了塔板理論中的板高H概念，考慮了組分在兩相間的擴散和傳質(zhì)過程，從而給出了van Deemter方程： u 為流動相線速度； A，B，C為常數(shù)，其中 A分別表示渦流擴散系數(shù)； B分子擴散系數(shù)； C傳質(zhì)阻力系數(shù)（包括液相和固相傳質(zhì)阻力系數(shù)）。 該式從動力學角度很好地解釋了影響板高（柱效）的各種因素！任何減少方程右邊三項數(shù)值的方法，都可降低H，從而提高柱效。1）渦流擴散項(Multipath term, A) 在填充柱中，由

13、于受到固定相顆粒的阻礙，組份在遷移過程中隨流動相不斷改變方向，形成紊亂的“渦流”：從圖中可見，因填充物顆粒大小及填充的不均勻性同一組分運行路線長短不同流出時間不同峰形展寬。展寬程度以A表示：A=2dp其中dp填充物平均直徑；填充不規(guī)則因子。 可見，使用細粒的固定相并填充均勻可減小A，提高柱效。對于空心毛細管柱，無渦流擴散，即A=0。流動方向2）分子擴散項(Longitudinal diffusion term, B/u) 縱向分子擴散是由于濃度梯度引起的。當樣品被注入色譜柱時，它呈“塞子”狀分布。隨著流動相的推進， “塞子”因濃度梯度而向前后自發(fā)地擴散，使譜峰展寬。其大小為B=2D 稱為彎曲因

14、子，它表示固定相幾何形狀對自由分子擴散的阻礙情況；D組分在流動相中的擴散系數(shù)。組份為氣體或液體時，分別以Dg或Dm表示；討論： 分子量大的組分，Dg小，即B小 Dg 隨柱溫升高而增加，隨柱壓降低而減小； 流動相分子量大，Dg 小，即 B 小； u 增加，組份停留時間短，縱向擴散?。唬˙/u） 對于液相色譜，因Dm 較小，B 項可勿略。球狀顆粒；大分子量流動相；適當增加流速；短柱；低溫。3）傳質(zhì)阻力項(Mass-transfer term, Cu) 因傳質(zhì)阻力的存在，使分配不能“瞬間”達至平衡，因此產(chǎn)生峰形展寬。氣相色譜以氣體為流動相，液相色譜以液體為流動相，二者傳質(zhì)過程不完全相同。下面分別作討

15、論。a）氣液色譜：傳質(zhì)阻力項C包括氣相傳質(zhì)阻力系數(shù)Cs和液相傳質(zhì)阻力系數(shù)Cl。流動相固液界面固定液組分分子ClCg討論： 減小填充顆粒直徑dp； 采用分子量小的流動相，使Dg增加； 減小液膜厚度df，Cl下降。但此時k又減小。 因此，當保持固定液含量不變時，可通過 增加固定液載體的比表面來降低df。但比 表面過大又會因吸附過強使峰拖尾。 增加柱溫，可增加Dl，但k值也減小，為保 持合適Cl值，應控制柱溫。b）液液色譜：傳質(zhì)阻力項C包括流動相傳質(zhì)阻力系數(shù)Cm和固定相傳質(zhì)阻力系數(shù)Cs。討論： 流動相傳質(zhì)阻力包括兩方面：流動相中的傳質(zhì)阻力Cm、滯留的流動相傳 質(zhì)阻Cs力。分別與填充物大小 dp、擴散

16、系數(shù)(Dm)、微孔大小及其數(shù)量等有 關(guān)。 因此，降低流動相傳質(zhì)阻力的方法有：細顆粒固定相、增加組分在 固定相和流動相中的擴散系數(shù)D、適當降低線速度、短柱。 固定相傳質(zhì)阻力與液膜厚度df、保留因子 k 和擴散系數(shù)Ds等有關(guān)。 因此，降低固定相傳質(zhì)阻力的方法有：與氣液色譜中的表述相同。sm4）流速u 由van Deemter方程 H = A + B/u + Cu知道： 當u一定時，僅在A、B、C較小時，H較小，柱效較高；反之則柱效較低，色譜峰將展寬。 以u對H作圖，可得H-u曲線（如圖），從該曲線得到：渦流擴散項A與流速u無關(guān)；低流速區(qū)(u小)，B/u大，分子擴散項占主導， 此時選擇分子量大的氣體

17、如N2和Ar為載氣，可 減小擴散，提高柱效； 高流速區(qū)(u大)，Cu大，傳質(zhì)阻力項占主導， 此時選擇分子量小的氣體如H2和He為載氣， 可增加擴散系數(shù)，提高柱效； 曲線的最低點對應最佳線速uopt( ) 下的 最小板高Hmin( )； LC的Hmin和uopt均比GC的小一個數(shù)量級，即在 LC中，較低流速可獲得較大的柱效。板高，H(cm)HminA+B/u+CuCmuCsuAB/u5）固定相顆粒大小對板高的影響 實驗表明，顆粒越細，板高越小，受線速影響越小。即，在HPLC分析中采用細粒作固定相的理論根據(jù)！ 但顆粒細導致柱流速慢，當采用高壓技術(shù)，才能實現(xiàn)HPLC的分析要求。 上面分別介紹了影響色

18、譜分離的基本原理以及影響柱效的各種因素，但是如何從總體上定量描述色譜分離效能？如何將各種影響因素對分離的影響定量地表述出來呢？板高, H(cm)15.4 分離度及色譜分離方程一、分離度(Resolution, R) 同時反映色譜柱效能和選擇性的一個綜合指標。也稱總分離效能指標或分辨率。其定義為： 利用此式，可直接從色譜流出曲線上求出分離度R。 R 越大，相鄰組分分離越好。當R=1.5時，分離程度可達99.7%，因此R=1.5通常用作是否分開的判據(jù)。R=1.5R=0.75R=1.0響應信號保留時間 t, min二、色譜分離方程 R 的定義并未反映影響分離度的各種因素。也就是說，R 未與影響其大小的因素：柱效n、選擇因子 和保留因子 k 聯(lián)系起來。 對于相鄰的難分離組分，由于它們的分配系數(shù) K 相差小，可合理假設k1k2=k，W1 W2=W。因此可導出R與n（neff）、 和 k 的關(guān)系：附：具體推導過程如下：有關(guān)色譜方程的討論：1）分離度R與柱效的關(guān)系 分離度R與理論塔板數(shù)n有關(guān)，即R受熱力學性質(zhì)的影響。 對具一定相對保留值的物質(zhì)對，R與有效塔板數(shù)neff有關(guān)，說明neff可正確代表柱效能。 由色譜方程可得： 因此可通過增加柱長提高分離度。然而，分析時間也相應增加，且峰寬