上課用2.1微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)課件

1、微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)了解有關(guān)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)知識(shí)，進(jìn)行無(wú)菌技術(shù)的操作，進(jìn)行微生物的培養(yǎng)。 一、課題目標(biāo)：掌握培養(yǎng)基的制備、高壓蒸汽滅菌和平板劃線法、稀釋涂布法等基本操作技術(shù)，熟練、規(guī)范地進(jìn)行無(wú)菌操作，成功地培養(yǎng)微生物。無(wú)菌技術(shù)的操作。二、課題重點(diǎn)和難點(diǎn)：三、技能目標(biāo)：一、基礎(chǔ)知識(shí)：（一）培養(yǎng)基 1.培養(yǎng)基種類及用途培養(yǎng)基是由人們按照微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配制出供微生物生長(zhǎng)繁殖的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)。按物理狀態(tài)不同劃分固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基中加入一定量凝固劑，使其成為固體狀態(tài)，瓊脂含量一般為1.5%-2.0%瓊脂含量一般為0.2%-0.7%不加任何凝固劑半固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基常用來(lái)進(jìn)行微生物的分離

2、、鑒定、活菌計(jì)數(shù)及菌種保藏 觀察微生物的運(yùn)動(dòng)特征、分類鑒定及噬菌體效價(jià)滴定 大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)及在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行微生物的基礎(chǔ)理論和應(yīng)用方面的研究 液體培養(yǎng)基：表面生長(zhǎng)均勻混濁生長(zhǎng)沉淀生長(zhǎng)液體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基：微生物的分離、鑒定、活菌計(jì)數(shù)及菌種保藏菌落菌落：?jiǎn)蝹€(gè)或少數(shù)細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上大量繁殖時(shí)，就會(huì)形成一個(gè)肉眼可見(jiàn)的，具有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞群體，叫做菌落。菌落是鑒定菌種的重要依據(jù)。細(xì)菌的菌落特征因種而異 菌落：霉菌的菌落特征因種而異無(wú)動(dòng)力 有動(dòng)力(彌散)(是否運(yùn)動(dòng)) 半固體培養(yǎng)基：觀察微生物的運(yùn)動(dòng)特征、分類鑒定按用途不同劃分基礎(chǔ)培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基含有一般微生物生長(zhǎng)繁殖所需的基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基（牛肉膏

3、蛋白胨培養(yǎng)基）用來(lái)將某種或某類微生物從混雜的微生物群體中分離出來(lái)的培養(yǎng)基用于鑒別不同類型微生物的培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基微生物產(chǎn)生某種代謝產(chǎn)物，與培養(yǎng)基中的特殊化學(xué)物質(zhì)發(fā)生特定的化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生明顯的特征變化在培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或化學(xué)物質(zhì)，抑制不需要的微生物的生長(zhǎng)，有利于所需微生物的生長(zhǎng)選擇培養(yǎng)基加入青霉素的培養(yǎng)基:分離酵母菌、霉菌等真菌加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基: 分離金黃色葡萄球菌不加氮源的無(wú)氮培養(yǎng)基: 分離固氮菌不加含碳有機(jī)物的無(wú)碳培養(yǎng)基: 分離自養(yǎng)型微生物加入青霉素等抗生素的培養(yǎng)基: 分離導(dǎo)入了目的基因的受體細(xì)胞加入氨基喋呤、次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基:分離雜交瘤細(xì)胞選擇培養(yǎng)基（耐高

4、濃度食鹽的金黃色葡萄球菌）大腸桿菌呈 黑色中心 ,有金屬光澤大腸桿菌在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上典型特征深紫色，并帶有金屬光澤 鑒別培養(yǎng)基：鑒定所培養(yǎng)生物的類型按成分不同劃分天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基化學(xué)成分不恒定的天然有機(jī)物牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基。用于工業(yè)生產(chǎn)化學(xué)成分完全了解的物質(zhì)配制而成的培養(yǎng)基高氏1號(hào)培養(yǎng)基、查氏培養(yǎng)基。用于分類和鑒定分類根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無(wú)機(jī)鹽和其它一些輔助物質(zhì)。優(yōu)點(diǎn)：標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對(duì)固定;成本低 缺點(diǎn)： 缺少某些成分，不能完全滿足體外細(xì)胞生長(zhǎng)需要。 合成培養(yǎng)基:天然培養(yǎng)基有血

5、清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。優(yōu)點(diǎn)：營(yíng)養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好缺點(diǎn)：來(lái)源受限;成分復(fù)雜，影響對(duì)某些實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物的提取和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的 分析;易發(fā)生支原體污染;天然培養(yǎng)基：血清中含有：多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）多種金屬離子； 激素；促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等。各種生長(zhǎng)因子轉(zhuǎn)移蛋白不明成分人工合成培養(yǎng)基只能維持細(xì)胞生存，要想使細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖，還需補(bǔ)充一定量的天然培養(yǎng)基（如血清）。標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基類型配制特點(diǎn)主要應(yīng)用物理性質(zhì)固體培養(yǎng)基加入瓊脂較多菌種分離,鑒定,計(jì)數(shù)半固體培養(yǎng)基加入瓊脂較少菌種保存液體培養(yǎng)基不加入瓊脂工業(yè)生產(chǎn)，連續(xù)培養(yǎng)化學(xué)組成合成培養(yǎng)基由已知成分配制而成，培

6、養(yǎng)基成分明確菌種分類、鑒定天然培養(yǎng)基由天然成分配制而成，培養(yǎng)基成分不明確工業(yè)生產(chǎn)，降低成本目的用途鑒別培養(yǎng)基添加某種指示劑或化學(xué)藥劑菌種的鑒別選擇培養(yǎng)基添加（或缺少）某種化學(xué)成分菌種的分離2、培養(yǎng)基配制原則：（1）目的要明確：根據(jù)微生物的種類、培養(yǎng)目的等確定配制培養(yǎng)基的種類，因?yàn)椴煌奈⑸飳?duì)培養(yǎng)物質(zhì)的需求不同。（2）營(yíng)養(yǎng)要協(xié)調(diào)：注意各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度和比例。（3）pH要適宜：各種微生物適宜生長(zhǎng)的pH范圍不同。 細(xì)菌pH為：6.5-7.5； 放線菌pH為：7.5-8.5； 真菌pH為：5.0-6.0。3、培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)構(gòu)成不管哪種培養(yǎng)基，一般都含有水、碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，另外還需要滿足

7、微生物生長(zhǎng)對(duì)pH、特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及氧氣、二氧化碳、滲透壓等的要求。,例如:生長(zhǎng)因子(即細(xì)菌生長(zhǎng)必需，而自身不能合成的化合物,如培養(yǎng)乳酸桿菌需要在培養(yǎng)基中添加維生素) 碳源、氮源、生長(zhǎng)因子的比較來(lái) 源常用原料功 能碳源CO2、NaHCO3、糖類、脂肪酸、花生粉餅、石油等糖類構(gòu)成細(xì)胞物質(zhì)和一些代謝產(chǎn)物，有些還是異養(yǎng)生物的主要能源物質(zhì)氮源N2、NH3、銨鹽、硝酸鹽、尿素、核酸、牛肉膏和蛋白胨等銨鹽、硝酸鹽等合成蛋白質(zhì)、核酸以及含氮的代謝產(chǎn)物生長(zhǎng)因子維生素、氨基酸、堿基酶、核酸等的組成成分。參與酶促反應(yīng)細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)類型 根據(jù)細(xì)菌所利用的能源和碳源的不同，將細(xì)菌分為兩大營(yíng)養(yǎng)類型。自養(yǎng)菌（autotroph

8、）異養(yǎng)菌（heterotroph）腐生菌、 寄生菌（大部分病原菌） 獲得純凈培養(yǎng)物的關(guān)鍵是什么？不是。比如病毒只能寄生在活細(xì)胞內(nèi)，目前常用于培養(yǎng)動(dòng)物病毒的是活雞胚。 所有微生物都可以用培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)嗎？防止外來(lái)雜菌的入侵。無(wú)菌技術(shù)（二）無(wú)菌技術(shù)1.無(wú)菌技術(shù)的概念 無(wú)菌操作泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法。成功地培養(yǎng)微生物的關(guān)鍵。 無(wú)菌技術(shù)包括：（1）對(duì)實(shí)驗(yàn)操作空間、操作者的衣著和手進(jìn)行清潔和消毒 ；（2）將培養(yǎng)器皿、接種用具和培養(yǎng)基等器具進(jìn)行滅菌 ；（3）為避免周圍微生物污染，實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在 酒精燈火焰附近旁進(jìn)行；（4）避免已滅菌處理的材料用具與周圍物品相接觸。 （二） 無(wú)菌技術(shù)

9、避免雜菌污染的四個(gè)方面：01實(shí)驗(yàn)操作的空間、操作者的衣著和手超凈工作臺(tái)清潔消毒 無(wú)菌操作泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法。成功培養(yǎng)微生物的關(guān)鍵。 02微生物培養(yǎng)的器皿、接種用具和培養(yǎng)基等滅菌接種環(huán)接種針涂布器03實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在酒精燈火焰附近進(jìn)行04避免已經(jīng)滅菌處理的材料用具與周圍的物品接觸消毒指使用較為溫和的物理或化學(xué)方法僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分對(duì)人體有害的微生物（不包括芽孢和孢子）。某種細(xì)菌的芽孢毛霉的孢子休眠體繁殖體芽孢 有些細(xì)菌在一定的條件下，細(xì)胞里面形成一個(gè)橢圓形的休眠體，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，對(duì)干旱、低溫、高溫等惡劣的環(huán)境有很強(qiáng)的抵抗力。例如，有的細(xì)菌的芽孢，煮沸3

10、小時(shí)以后才死亡。芽孢又小又輕，可以隨風(fēng)飄散。當(dāng)環(huán)境適宜（如溫度、水分適宜）的時(shí)候，芽孢又可以萌發(fā)，形成一個(gè)細(xì)菌。消毒煮沸消毒法在100，煮沸56min巴氏消毒法7075煮30min或80煮15min化學(xué)藥劑消毒法紫外線消毒法滅菌指使用強(qiáng)烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽孢和孢子。灼燒滅菌接種工具（接種環(huán)、接種針或其他金屬工具）160170加熱1-2h干熱滅菌玻璃器皿（吸管、培養(yǎng)皿）和金屬用具等高壓蒸汽滅菌100kPa,溫度為121，維持1530min培養(yǎng)皿及容器的滅菌1、煮沸消毒法:100煮沸5-6min2、巴氏消毒法：70-75 下煮30min或 80 下煮15min3、化學(xué)藥劑消

11、毒法:用75%酒精、新潔爾滅等進(jìn)行皮膚消毒; 氯氣消毒水源4、紫外線消毒：P16附錄五(1)消毒的方法：3.常用的消毒與滅菌的方法1、灼燒滅菌2、干熱滅菌： 160-170 下加熱1-2h。3、高壓蒸氣滅菌： 100kPa、121 下維持 15-30min.(2)滅菌的方法：3.常用的消毒與滅菌的方法 最常用的滅菌方法是高壓蒸汽滅菌，它可以殺滅所有的生物，包括最耐熱的某些微生物的休眠體，同時(shí)可以基本保持培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分不被破壞。 有些玻璃器皿也可采用高溫干熱滅菌。為了防止雜菌，特別是空氣中的雜菌污染，試管及玻璃燒瓶都需采用適宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用各種金屬、塑料及硅膠帽，它們只可

12、讓空氣通過(guò)，而空氣中的其他微生物不能通過(guò)。 而平皿是由正反兩平面板互扣而成，這種器具是專為防止空氣中微生物的污染而設(shè)計(jì)的。 消毒滅菌概念指使用較為溫和的物理或化學(xué)方法僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分對(duì)人體有害的微生物(不包括芽孢和孢子)指使用強(qiáng)烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽孢和孢子常用方法煮沸消毒法、巴氏消毒法、化學(xué)藥劑消毒法、紫外線消毒法灼燒消毒法、干熱滅菌、高壓蒸汽滅菌適用對(duì)象操作空間、液體、雙手等接種環(huán)、接種針、玻璃器皿，培養(yǎng)基等微生物實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的基本操作程序1、器具的滅菌2、培養(yǎng)基的配制3、培養(yǎng)基的滅菌4、倒平板5、微生物接種6、恒溫箱中培養(yǎng)7、菌種的保存1.無(wú)菌技術(shù)除了用來(lái)防

13、止實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)物被其他外來(lái)微生物污染外， 還有什么目的？2.請(qǐng)你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請(qǐng)選擇 合適的方法。（1） 培養(yǎng)細(xì)菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿（2） 玻棒、試管、燒瓶和吸管（3） 實(shí)驗(yàn)操作者的雙手答：無(wú)菌技術(shù)還能有效避免操作者自身被微生物感染。答：（1）、（2）需要滅菌；（3）需要消毒。旁欄思考3、為什么消毒牛奶要用巴氏消毒法?營(yíng)養(yǎng)成分不被破壞（一）制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（用于培養(yǎng)細(xì)菌）二、實(shí)驗(yàn)操作1計(jì)算、稱量2溶化3調(diào)pH：pH7.64過(guò)濾：這一步可以省去。5分裝：分裝過(guò)程中注意不要使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。分裝三角燒瓶的量以不超過(guò)三角燒瓶容積

14、的一半為宜。6加塞7包扎8滅菌: 將50ml培養(yǎng)基用玻棒轉(zhuǎn)移至三角錐瓶中，塞上棉花塞，包上牛皮紙， 再放入高壓蒸氣滅菌鍋，在壓力為100kPa、溫度為121，滅菌 1530min。將培養(yǎng)皿用舊報(bào)紙包裹，放入干熱滅菌箱內(nèi)，在160 170 下滅菌2h。9倒平板: 待培養(yǎng)基冷卻到50 左右時(shí)，在酒精燈附近倒平板。（倒平板操作 見(jiàn)課本）2d后觀察平板，無(wú)雜菌污染才可用來(lái)接種.10無(wú)菌檢查： 將滅菌的培養(yǎng)基放入37的溫室中培養(yǎng)2448小時(shí)，以檢查滅菌 是否徹底。倒平板技術(shù)3.倒平板操作右手火焰大于瓶口的縫隙倒過(guò)來(lái)右手火焰大大于瓶口的縫隙倒過(guò)來(lái)培養(yǎng)基組分提供的主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)牛肉膏5.0 g 源、 源、磷酸

15、鹽和維生素蛋白胨10.0 g 源、 源和維生素NaCl 5.0 g_瓊脂20.0 g/蒸餾水定容至1 000 mL氫元素、氧元素1.牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的成分及各成分提供的營(yíng)養(yǎng)碳氮碳氮基礎(chǔ)梳理 夯實(shí)教材基礎(chǔ)無(wú)機(jī)鹽2.制備步驟計(jì)算依據(jù)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 的比例，計(jì)算配制100 mL的培養(yǎng)基時(shí)，各種成分的_稱量可用稱量紙稱取，牛肉膏和蛋白胨都容易吸潮，稱取時(shí)動(dòng)作要 ，稱后及時(shí) 瓶蓋溶化牛肉膏和稱量紙水 取出稱量紙加 和 加 至完全熔化(注意：不斷用玻棒攪拌，防止瓊脂糊底而導(dǎo)致燒杯破裂)補(bǔ)加蒸餾水至_配方用量迅速蓋上蛋白胨氯化鈉瓊脂100 mL滅菌培養(yǎng)基用 法滅菌(壓力100 kPa、溫度121 、時(shí)

16、間1530 min)；培養(yǎng)皿用 法滅菌(溫度160170 ，時(shí)間2 h)倒平板待培養(yǎng)基冷卻至 左右時(shí)，在 附近倒平板高壓蒸汽滅菌干熱滅菌50酒精燈火焰制備固體培養(yǎng)基的一般步驟可簡(jiǎn)記為：算、稱、溶、滅、倒， 即計(jì)算、稱量、溶化、滅菌、倒平板。特別提醒溶化時(shí)為什么要將牛肉膏連同稱量紙一起加熱?可保證粘附在稱量紙上的牛肉膏也能溶于水中，減少誤差。制備固體培養(yǎng)基的一般步驟可簡(jiǎn)記為：算、稱、溶、滅、倒， 即計(jì)算、稱量、溶化、滅菌、倒平板。特別提醒加瓊脂的目的是什么?作為凝固劑制備固體培養(yǎng)基的一般步驟可簡(jiǎn)記為：算、稱、溶、滅、倒， 即計(jì)算、稱量、溶化、滅菌、倒平板。特別提醒在滅菌前, 用牛皮紙、舊報(bào)紙包緊

17、盛有培養(yǎng)基的錐形瓶的目的是什么？在滅菌時(shí)能避免水蒸汽凝結(jié)時(shí)浸濕棉塞， 在取出培養(yǎng)基錐形瓶時(shí)也起到隔絕空氣中 雜菌污染的作用。制備固體培養(yǎng)基的一般步驟可簡(jiǎn)記為：算、稱、溶、滅、倒， 即計(jì)算、稱量、溶化、滅菌、倒平板。特別提醒培養(yǎng)皿能否用高壓蒸汽滅菌？不能，因?yàn)榕囵B(yǎng)皿要保持干燥，應(yīng)該用 干熱滅菌。1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50 左右時(shí)，才能用來(lái)倒平板原因？你用什么辦法來(lái)估計(jì)培養(yǎng)基的溫度？問(wèn)題討論答：瓊脂是一種多糖，在98 以上熔化，在44 以下凝固，倒平板時(shí)高于50 則會(huì)燙手，低于50 時(shí)若不及時(shí)操作，瓊脂會(huì)凝固?？梢杂檬钟|摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺(jué)錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時(shí)，就可以進(jìn)行倒平

18、板了。2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過(guò)火焰？答：通過(guò)灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。3.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？4.在倒平板的過(guò)程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位， 這個(gè)平板還能用來(lái)培養(yǎng)微生物嗎？為什么？答：平板冷凝后，皿蓋上會(huì)凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。答：空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個(gè)平板培養(yǎng)微生物。5.怎樣判斷制備的培養(yǎng)基是否合格、成功，是否受到污染？提示未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫一段時(shí)間后，如果無(wú)菌落生長(zhǎng)，說(shuō)明培

19、養(yǎng)基制備成功、合格，未受到污染。（二）、純化大腸桿菌接種方法有：平板劃線法和稀釋涂布平板法1.平板劃線法原理：通過(guò)接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作,將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面。在數(shù)次劃線后,可以分離到單個(gè)菌落。微生物的接種技術(shù)平板劃線法操作：火焰接種環(huán)燒紅火焰旁火焰已冷卻的接種環(huán)一條縫隙迅速伸入平板劃破一末二最后一區(qū)的劃線倒置1 1.線條不重疊 2 2-3.從上次的末端開(kāi)始，交叉23條線3 4 4.最后的劃線不能與第一區(qū)相連。（3）平板劃線法注意事項(xiàng)接種環(huán)只蘸一次菌液，但要在培養(yǎng)基不同位置連續(xù)劃線多次。劃線首尾不能相接。劃線后，培養(yǎng)皿倒置培養(yǎng)1224h。微生物的恒溫培養(yǎng)微生

20、物的恒溫培養(yǎng)微生物的恒溫培養(yǎng)平板劃線操作中三種灼燒的目的不同特別提醒項(xiàng)目目的沾取菌液前灼燒避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染菌種每次劃線前灼燒殺死上一次劃線結(jié)束后接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時(shí)接種環(huán)上的菌種直接來(lái)源于上一次劃線的末端劃線操作結(jié)束后灼燒及時(shí)殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免菌種污染環(huán)境和感染操作者1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？ 在劃線操作結(jié)束時(shí)，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？答：操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時(shí)，接種環(huán)上的菌種直接來(lái)源于上次劃線

21、的末端，從而通過(guò)劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時(shí)菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)，能及時(shí)殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。問(wèn)題討論2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線？答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。3.在作第二次以及其后的劃線操作時(shí)，為什么總是從上一次劃線的末端 開(kāi)始劃線？答：劃線后，線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開(kāi)始，能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個(gè)細(xì)菌繁殖而來(lái)的菌落。問(wèn)題討論2. 稀釋涂布平板法原理：將菌液進(jìn)行一系列的 ，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面，進(jìn)行

22、培養(yǎng)。操作：在稀釋度足夠高的菌液里，聚集在一起的微生物將被分散成 ，從而能在培養(yǎng)基表面形成單個(gè)菌落。梯度稀釋單個(gè)細(xì)胞A.系列稀釋操作a.編號(hào)為101106試管中分別盛有9 mL水。b.用移液管吸取 mL培養(yǎng)的菌液，注入101倍稀釋的試管中，得到稀釋菌液。c.從101倍稀釋的試管中吸取1 mL稀釋液，注入102倍稀釋的試管中。依次類推，完成菌液的稀釋。1提醒：移液管要經(jīng)過(guò)滅菌，并且操作應(yīng)在酒精燈火焰附近完成。微量 移液器B.涂布平板操作涂布器消毒：將涂布器浸在盛有 的燒杯中取菌液：取少量菌液(不超過(guò)0.1 mL)，滴加到 表面涂布器滅菌：將沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃盡后， 810

23、 s涂布平板：用涂布器將 均勻地涂布在培養(yǎng)基表面。涂布時(shí)可轉(zhuǎn)動(dòng) 培養(yǎng)皿，使菌液分布均勻酒精培養(yǎng)基冷卻菌液提醒：取出涂布器時(shí)，應(yīng)避免酒精滴落；燃燒后的涂布器，應(yīng)冷卻后再浸入酒精。稀釋涂布平板法：a.梯度稀釋菌液：b.涂布平板：不超過(guò)0.1ml各梯度分別涂布3個(gè)平板1個(gè)涂布蒸餾水作空白對(duì)照滴灼試涂稀釋103倍稀釋104倍稀釋105倍關(guān)鍵點(diǎn)撥兩種接種方法的比較項(xiàng)目平板劃線法稀釋涂布平板法用途一般用于菌種的純化一般用于篩選菌株優(yōu)點(diǎn)可對(duì)混合菌進(jìn)行分離可以計(jì)數(shù)缺點(diǎn)不能計(jì)數(shù)操作復(fù)雜，若平板不干燥，則效果不好；若菌液濃度大，則長(zhǎng)不出單菌落培養(yǎng)結(jié)果 1. 涂布平板的所有操作都應(yīng)在火焰附近進(jìn)行。結(jié)合平板劃線與系列

24、稀釋的無(wú)菌操作要求，想一想，第2步應(yīng)如何進(jìn)行無(wú)菌操作？應(yīng)從操作的各個(gè)細(xì)節(jié)保證“無(wú)菌”。例如，酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍等等。問(wèn)題討論2.平板劃線法接種菌種時(shí)，哪些操作可防止雜菌污染？提示(1)接種前將接種環(huán)放在酒精燈火焰上灼燒。(2)劃完一個(gè)區(qū)域后，將接種環(huán)灼燒，冷卻后再劃下一區(qū)域。(3)接種環(huán)沾取菌液時(shí)，要將試管口、棉塞等通過(guò)火焰。(4)劃線時(shí)將培養(yǎng)皿的皿蓋打開(kāi)一條縫隙，將沾有菌種的接種環(huán)迅速伸入平板內(nèi)，劃線后及時(shí)蓋上皿蓋。3.在做第二次劃線以及其后的操作時(shí)，為什么總是從上一次劃線的末端開(kāi)始劃線？4.稀釋涂布平板操作結(jié)束后，為什么要將一個(gè)未

25、接種的培養(yǎng)基和一個(gè)已接種的培養(yǎng)基放在一起培養(yǎng)？未接種的培養(yǎng)基表面是否有菌落生長(zhǎng)很關(guān)鍵。如果有菌落生長(zhǎng)，說(shuō)明了什么？提示劃線末端含有的細(xì)菌數(shù)目較少，每次從上一次劃線的末端開(kāi)始劃線能夠使細(xì)菌的數(shù)目隨劃線次數(shù)的增加而逐漸減少，最終分散成單個(gè)的細(xì)菌。提示培養(yǎng)未接種培養(yǎng)基的作用是對(duì)照。未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫12 d后無(wú)菌落生長(zhǎng)，說(shuō)明培養(yǎng)基的制備是成功的；若有菌落生長(zhǎng)，說(shuō)明培養(yǎng)基滅菌不徹底，或培養(yǎng)基被污染，需要重新制備。(1)培養(yǎng)基的制作是否合格 如果未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫12 d后無(wú)菌落生長(zhǎng)，說(shuō)明培養(yǎng)基的 制備是成功的，否則需要重新制備。(2)接種操作是否符合無(wú)菌要求 如果培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落

26、的顏色、形狀、大小基本一致，并符合大腸桿菌 菌落的特點(diǎn)，則說(shuō)明接種操作是符合要求的；如果培養(yǎng)基上出現(xiàn)了其他菌 落，則說(shuō)明接種過(guò)程中，無(wú)菌操作還未達(dá)到要求，需要分析原因，再次練習(xí)。(3)是否進(jìn)行了及時(shí)細(xì)致的觀察與記錄 培養(yǎng)12 h與24 h后的大腸桿菌菌落的大小會(huì)有明顯不同，及時(shí)觀察記錄的 同學(xué)會(huì)發(fā)現(xiàn)這一點(diǎn)，并能觀察到其他一些細(xì)微的變化。這一步的要求主要 是培養(yǎng)學(xué)生良好的科學(xué)態(tài)度與習(xí)慣。三、課題成果評(píng)價(jià) 1、臨時(shí)保藏法 對(duì)象： 溫度： 缺點(diǎn)：2、甘油管藏法： 對(duì)象： 溫度：頻繁使用的菌種 4（冰箱） 容易被污染或產(chǎn)生變異 長(zhǎng)期保存的菌種 -20（冷凍箱） 四、課題延伸甘油冷凍管藏（-20）固體培養(yǎng)基斜面保藏（-4） 臨時(shí)保藏長(zhǎng)期保存大腸桿菌分離后保存菌種保藏方法的比較項(xiàng)目臨時(shí)保藏甘油管藏適用范圍 的菌種 的菌種培養(yǎng)基 培養(yǎng)基 培養(yǎng)基保藏溫度4 20 特點(diǎn)需不定期轉(zhuǎn)移菌種；保存時(shí)間短；菌種易被污染或產(chǎn)生變異保存時(shí)間長(zhǎng)；菌種安全性和穩(wěn)定性高具體方法接種到 培養(yǎng)基上在合適的溫度下培養(yǎng)長(zhǎng)成菌落 冰箱中保藏甘油瓶中裝入甘油后 將菌液轉(zhuǎn)移至甘油瓶中混勻后冷凍箱中保存頻繁使用長(zhǎng)期保存固體斜面液體固體斜面4 滅菌本課題知識(shí)小結(jié):【典例解析】例1關(guān)微生物營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的敘述中，正