動物細(xì)胞培養(yǎng)制藥工藝課件

1、第十七章 動物細(xì)胞培養(yǎng)制藥工藝動物細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用動物細(xì)胞培養(yǎng)制藥工藝17.1 制藥動物細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)與特征17.2 基因工程動物細(xì)胞系的構(gòu)建17.3 動物細(xì)胞培養(yǎng)基的制備17.4 動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)17.5 培養(yǎng)過程檢測與工藝控制17.1制藥動物細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)與特征一、動物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能二、制藥動物細(xì)胞的種類三、生產(chǎn)用細(xì)胞系四、動物細(xì)胞的生產(chǎn)特征17.1制藥動物細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)與特征 1.動物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能2、動物細(xì)胞培養(yǎng)的代謝特征葡萄糖和谷氨酰胺：能量和合成代謝的前體。葡萄糖限制:通過增加谷氨酰胺消耗得以補(bǔ)償，反之亦然。葡萄糖代謝：糖酵解為主，生成丙酮酸和乳酸，乳酸分泌到胞外并在培養(yǎng)液中積累

2、。另一條途徑為TCA循環(huán)，徹底氧化產(chǎn)生CO2和水。一小部分為戊糖磷酸途徑，生成4、5、7碳糖和NADPH。中間產(chǎn)物進(jìn)入脂肪酸代謝、核酸代謝和氨基酸代謝。葡萄糖代謝旺盛，產(chǎn)生大量乳酸，對細(xì)胞有毒性。三羧酸循環(huán)2、動物細(xì)胞培養(yǎng)的代謝特征谷氨酰胺代謝：脫氨、轉(zhuǎn)氨等，合成其他非必需氨基酸。脫氨作用：生成谷氨酸，脫氨產(chǎn)生的氨，對細(xì)胞有毒性。轉(zhuǎn)氨作用：生成嘧啶，嘌呤，氨基糖等合成代謝前體。谷氨酰胺與丙酮酸發(fā)生轉(zhuǎn)氨作用，生成丙氨酸，進(jìn)入培養(yǎng)液并積累。離體動物細(xì)胞，轉(zhuǎn)氨是主要代謝途徑；Gln是動物細(xì)胞的氮源，Gln受限制時，通過增加其他氨基酸的消耗得以補(bǔ)償。流加葡萄糖或谷氨酰胺，控制整個代謝過程，避免有毒廢物

3、的積累。 蛋白質(zhì)合成場所：粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的核糖體，以 mRNA為模板，進(jìn)行密碼的翻譯。3、蛋白質(zhì)合成，糖基化修飾和分泌表達(dá)動物細(xì)胞制藥表達(dá)系統(tǒng)蛋白質(zhì)糖基化修飾糖基化場所：粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)和高爾基體，加工修飾形成糖基化蛋白質(zhì)，糖基結(jié)構(gòu)易變化。不同細(xì)胞系糖基化特征不同，根據(jù)藥物的結(jié)構(gòu)，選擇適宜細(xì)胞系。動物細(xì)胞制藥表達(dá)系統(tǒng)糖基化改造是研究熱點(diǎn)。糖基化蛋白質(zhì)分泌分泌泡與細(xì)胞膜融合，把產(chǎn)物釋放到胞外，完成了蛋白質(zhì)的分泌表達(dá)。動物細(xì)胞制藥表達(dá)系統(tǒng)細(xì)胞周期：細(xì)胞從分裂開始到分裂結(jié)束的一段時間。一個細(xì)胞分裂，形成兩個細(xì)胞。1224h。4、細(xì)胞周期與凋亡四個階段：M期：分裂期，很短，0.51 h分裂間期 G1 S

4、G2 期。 G1期：DNA 復(fù)制前期,差異大 S期：DNA 合成期，68 h G2期：DNA 復(fù)制后期，25 h 細(xì)胞死亡的兩種方式：壞死：環(huán)境因素或病原物入侵，細(xì)胞受到嚴(yán)重傷害時快速膨脹，染色質(zhì)凝聚而死亡，細(xì)胞直接裂解。 特征是壞死過程不受細(xì)胞自主控制。細(xì)胞凋亡：細(xì)胞對環(huán)境變化作出的有計劃的、執(zhí)行預(yù)定程序的死亡應(yīng)答過程。特征是細(xì)胞收縮，細(xì)胞核和DNA斷裂，同時被膜包裹形成凋亡小體。4、細(xì)胞周期與凋亡動物細(xì)胞制藥表達(dá)系統(tǒng)顯微鏡下凋亡的細(xì)胞形態(tài)反應(yīng)器中的死亡形式主要是凋亡不同細(xì)胞凋亡發(fā)生不同原因：缺乏生長因子或血清、營養(yǎng)受限和逆境等均可引發(fā)凋亡發(fā)生。細(xì)胞培養(yǎng)中需嚴(yán)格控制條件，防止細(xì)胞凋亡。動物細(xì)

5、胞制藥表達(dá)系統(tǒng) 5、制藥動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) 5.1 哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) 5.2 昆蟲表達(dá)系統(tǒng)基于細(xì)胞來源：原代細(xì)胞，傳代細(xì)胞?；诩?xì)胞壽命：有限細(xì)胞系，無限細(xì)胞系。基于細(xì)胞的染色體數(shù)目：二倍體細(xì)胞系，異倍體細(xì)胞系?；讷@得方式：工程細(xì)胞系，癌變細(xì)胞系?；谏L特性：貼壁依賴型，非貼壁依賴型5.1 哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)1、細(xì)胞系的分類動物細(xì)胞制藥表達(dá)系統(tǒng)概念：是生長和壽命有限的細(xì)胞，經(jīng)過若干傳代培養(yǎng)后失去增殖能力，老化死亡。特點(diǎn)：有限生長（時間），有接觸抑制性（密度）。舉例： WI-38、MRC-5、2BS等用于藥品生產(chǎn)，曾經(jīng)廣泛應(yīng)用，但不是理想的生產(chǎn)細(xì)胞系。壽命：取決于細(xì)胞來源的物種和年齡、器

6、官。人細(xì)胞最高培養(yǎng)次數(shù)為5060代。胚成纖維細(xì)胞：人，50代；雞胚，30代；小鼠，8代。 （1）有限細(xì)胞系動物細(xì)胞制藥表達(dá)系統(tǒng)概念：細(xì)胞在生長基質(zhì)上分裂增殖，逐漸匯集成片，當(dāng)每個細(xì)胞與其周圍的細(xì)胞互相接觸時，細(xì)胞就停止增殖。特點(diǎn)：保持充足的營養(yǎng)，細(xì)胞仍可存活一段時間，但細(xì)胞密度不再增加。大多數(shù)細(xì)胞：形成單層細(xì)胞，有少數(shù)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞（癌細(xì)胞）：無接觸抑制（2）無限細(xì)胞系概念是壽命和活性不受傳代次數(shù)影響的細(xì)胞系，可連續(xù)培養(yǎng)。也稱為永久細(xì)胞系或連續(xù)細(xì)胞系。其特點(diǎn)：永生，沒有接觸抑制現(xiàn)象，對培養(yǎng)條件和營養(yǎng)因子等要求較低，倍增時間短，非常適合于制藥工業(yè)生產(chǎn)。動物細(xì)胞制藥表達(dá)系統(tǒng)（3）工程細(xì)胞系采用基因工

7、程技術(shù)對宿主細(xì)胞的遺產(chǎn)物質(zhì)進(jìn)行了修飾改造，獲得具有穩(wěn)定遺傳的獨(dú)特性狀的細(xì)胞系。方法：融合或重組Namalwa：類淋巴母細(xì)胞，懸浮生長。英國Wellcome公司Sendai病毒誘導(dǎo)，大規(guī)模生產(chǎn)干擾素，批準(zhǔn)上市。產(chǎn)品逐漸淘汰。WI-38：Wistar Institute（WI），二倍體成纖維細(xì)胞系，壽命有限。貼壁生長，對很多病毒敏感，第一個被用于制備疫苗。MRC-5：二倍體成纖維細(xì)胞系，生長較WI-38快，對逆境有一定抗性，用于制備疫苗。2、生產(chǎn)用細(xì)胞系動物細(xì)胞制藥表達(dá)系統(tǒng)（1）人源細(xì)胞系CHO細(xì)胞：Chinese hamster ovary特點(diǎn)：貼壁型生長，也可懸浮培養(yǎng)，對剪切力和滲透壓有較高的

8、忍受能力。最為普遍和成熟表達(dá)糖基化蛋白藥物的細(xì)胞。多種衍生突變株，高表達(dá)。藥物：EPO、HBsAg、G-CSF、凝血因子、DNA酶I（2）哺乳動物細(xì)胞系動物細(xì)胞制藥表達(dá)系統(tǒng)BHK21：baby hamster kidney，成纖維樣細(xì)胞，用于增殖病毒、制備疫苗和重組蛋白。上市重組凝血因子。Vero細(xì)胞系：非洲綠猴腎的成纖維細(xì)胞，多倍體核型，貼壁依賴性。Vero E6最為常用，可增殖多種病毒，生產(chǎn)疫苗。動物細(xì)胞制藥表達(dá)系統(tǒng)（2）哺乳動物細(xì)胞系是脾臟B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合細(xì)胞特點(diǎn)：無血清培養(yǎng)基中高密度懸浮生長，容易轉(zhuǎn)染和生長，大量分泌和高效表達(dá)。應(yīng)用：抗體藥物生產(chǎn)。（3）雜交瘤細(xì)胞系動物細(xì)胞制藥

9、表達(dá)系統(tǒng)昆蟲桿狀病毒科核多角體病毒（載體）攜載外源基因，感染昆蟲細(xì)胞或幼蟲（宿主），高水平表達(dá)外源蛋白質(zhì)。1983：苜蓿尺蠖核多角體病毒秋黏蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)1984：家蠶核多角體病毒家蠶幼蟲表達(dá)系統(tǒng)。應(yīng)用：生產(chǎn)抗體、試劑盒等。日本批準(zhǔn)用家蠶系統(tǒng)生產(chǎn)干擾素已上市。常用的昆蟲表達(dá)系統(tǒng)：Sf21：來源于秋粘蟲的卵巢細(xì)胞。容易放大，高效表達(dá)。Sf9：從SF21中分離得到，最常用。抗機(jī)械剪切，無血清培養(yǎng)基的攪拌反應(yīng)器中生長。TN-5B1-4：來源于粉紋夜蛾。表達(dá)能力高，能懸浮培養(yǎng)。5.2 昆蟲表達(dá)系統(tǒng)家蠶完成基因組測序（西南大學(xué)完成）優(yōu)點(diǎn)：安全：桿狀病毒無致病性，產(chǎn)品安全性受FDA認(rèn)可易飼養(yǎng)：家蠶喪失了野

10、外生存能力，飼養(yǎng)，發(fā)育快。高量表達(dá)：強(qiáng)啟動子，外源基因可超量表達(dá)；高效表達(dá)：可容納較大的外源基因（12kb），表達(dá)數(shù)個外源基因，如抗體，并且裝配成有功能的分子。缺點(diǎn)：翻譯后的加工：昆蟲細(xì)胞能進(jìn)行一系列翻譯后的加工，但與哺乳動物細(xì)胞不完全相同；蛋白質(zhì)合成與加工不匹配，修飾效率可能不高，引起溶解性、穩(wěn)定性、免疫性等變化。重組率低，篩選困難，周期長，需要410d。2、優(yōu)點(diǎn)與不足表達(dá)系統(tǒng)對培養(yǎng)條件要求嚴(yán)格對培養(yǎng)基組成要求高天然結(jié)構(gòu)與活性的藥物6.動物細(xì)胞的生產(chǎn)特征對培養(yǎng)條件要求嚴(yán)格1、溫度2、氧氣3、pH值 對培養(yǎng)基組成要求高 天然結(jié)構(gòu)與活性的藥物 生產(chǎn)工藝特征17.2 基因工程動物細(xì)胞的構(gòu)建17.2

11、.1 表達(dá)載體的設(shè)計與構(gòu)建17.2.2 轉(zhuǎn)染與培養(yǎng)17.2.3 篩選與鑒定病毒載體： 牛痘病毒：構(gòu)建多價疫苗 腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒：腫瘤基因治療 (重組人p53腺病毒注射液；5型腺病毒載體DNA和人p53腫瘤抑制基因重組；術(shù)中、術(shù)后使用可消滅殘留癌)。 桿狀病毒:外源基因表達(dá)（昆蟲）。質(zhì)粒載體：穿梭載體，細(xì)菌體內(nèi)擴(kuò)增，在動物細(xì)胞中表達(dá)。 選擇標(biāo)記，擴(kuò)增系統(tǒng)。17.2.1 表達(dá)載體的設(shè)計與構(gòu)建1、載體類型動物細(xì)胞制藥細(xì)胞系構(gòu)建動物病毒啟動子：SV40早期和晚期啟動子、腺病毒晚期啟動子、CMV立即早期基因啟動子。動物基因的啟動子：高表達(dá)，延長因子EF-1啟動子、泛素蛋白C啟動子、IgG啟動子。2、

12、啟動子與復(fù)制子啟動子編碼藥物基因終止子，選擇標(biāo)記動物細(xì)胞制藥細(xì)胞系構(gòu)建終止密碼子: T(U)AA, T(U)AG,T(U)GA PolyA信號序列：不宜太長，避免能量過度消耗。常用:SV40 polyA(131)、BGH的polyA(225bp)。3、終止子表達(dá)載體結(jié)構(gòu)舉例化學(xué)方法：磷酸鈣，樹脂，DEAE-葡聚糖物理方法：基因槍，顯微注射，電擊穿孔生物方法：病毒17.2.2 轉(zhuǎn)染與培養(yǎng)動物細(xì)胞制藥細(xì)胞系構(gòu)建轉(zhuǎn)染：通過病毒載體把外源基因?qū)氩溉閯游锛?xì)胞的技術(shù)?；瘜W(xué)轉(zhuǎn)染動物細(xì)胞制藥細(xì)胞系構(gòu)建動物細(xì)胞制藥細(xì)胞系構(gòu)建磷酸鈣轉(zhuǎn)染電擊穿孔物理轉(zhuǎn)染病毒載體的轉(zhuǎn)染病毒感染細(xì)胞的過程：吸附，脫殼核酸進(jìn)入進(jìn)入細(xì)胞

13、核整合動物細(xì)胞制藥細(xì)胞系構(gòu)建DNA合成途徑阻斷標(biāo)記，抗生素抗性標(biāo)記：篩選標(biāo)記與原理動物細(xì)胞制藥細(xì)胞系構(gòu)建選擇劑基因作用機(jī)理甲氨喋呤dhfr二氫葉酸類似物，競爭性抑制DHFR活性。氨喋呤Tk抑制正常途徑dTTP合成5-溴脫氧尿苷Tk阻斷dNTP正常合成途徑G418, Zeocinneo干擾核糖體，阻斷蛋白合成小結(jié)與思考題動物細(xì)胞培養(yǎng)制藥擴(kuò)增培養(yǎng)：非選擇性培養(yǎng)基，1-2d篩選培養(yǎng)：選擇性培養(yǎng)基,2-4d更換培養(yǎng)基，23周，獲得單克隆細(xì)胞集落。鑒定：對獨(dú)立集落進(jìn)行穩(wěn)定性、表達(dá)量、生物活性等鑒定。建庫：按生物制品要求，建立細(xì)胞系和建庫，妥善保存。動物細(xì)胞制藥細(xì)胞系構(gòu)建3、篩選與鑒定、建庫動物細(xì)胞培養(yǎng)基

14、制備培養(yǎng)基組成成分培養(yǎng)基種類培養(yǎng)基質(zhì)量控制動物細(xì)胞培養(yǎng)基制備培養(yǎng)基組成成分1、糖類2、氨基酸3、維生素4、無機(jī)鹽類5、生長類因子與激素動物細(xì)胞培養(yǎng)的種類1、天然培養(yǎng)基2、合成培養(yǎng)基血清（Serum）成分與作用血清（Serum）成分與作用血清（Serum）成分與作用2、合成培養(yǎng)3、無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)基質(zhì)量的控制1、培養(yǎng)用水質(zhì)2、緩沖液Ca,Mg離子具有細(xì)胞凝集作用3、生理鹽水和平衡鹽溶液3、生理鹽水和平衡鹽溶液4、氨基酸配制5、NaHCO3配制6、培養(yǎng)基滅菌動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)動物細(xì)胞生長和基質(zhì)依賴性動物細(xì)胞培養(yǎng)基本過程動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)方法動物細(xì)胞生長和基質(zhì)依賴性1、生長基質(zhì)2、貼壁依賴性細(xì)胞3、非貼壁依賴性細(xì)胞4、兼性貼壁依賴性細(xì)胞動物細(xì)胞培養(yǎng)基本過程1、原代細(xì)胞培養(yǎng) 過程2、傳代細(xì)胞培養(yǎng) 過程動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)方法1、單層貼壁培養(yǎng) 概念與過程1、單層貼壁培養(yǎng) 特點(diǎn)2、懸浮培養(yǎng)3、微載體培養(yǎng)4、固定化培養(yǎng) 90年代以來, 醫(yī)學(xué)界開始嘗試以微膠囊作為基因重組細(xì)胞的免疫隔離和運(yùn)載工具, 利用重組細(xì)胞的代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié)機(jī)體生理功能, 治療相關(guān)疾病。 微囊化人胰島 培養(yǎng)15d微囊化小牛腎上腺嗜鉻細(xì)胞 培養(yǎng)0d微囊化肝癌細(xì)胞 培養(yǎng)40d不同放大倍