非那西丁藥代動力學研究實驗報告分析

1、 非那西丁的藥代動力學研究實驗報告概述：非那西?。≒henacetin為一種解熱鎮(zhèn)痛藥，因為潛在副作用在臨床已基本不 使用。但由于其是 CYP1A2 酶的特異性底物，被廣泛選擇作為底物用于酶活性 測定實驗以及影響酶活性作用藥物的研究。本學期臨床藥代動學實驗課以非那 西丁在大鼠體內的代謝實驗、大鼠肝微粒體溫孵實驗兩部分為例，通過實驗設 計，實驗操作，結果評價等一系列過程，系統(tǒng)地學習了藥代動力學中藥物體內 外的簡單研究方法、實驗數(shù)據(jù)的處理、以及相關藥動學參數(shù)的計算與評價。正文1.非那西丁在大鼠體內的藥代動力學研究1.1 實驗目的研究非那西丁在大鼠體內代謝的藥代動力學，學習大鼠眼底靜脈叢取血等 操作

2、。1.2 實驗材料與方法儀器：HPLC-UV&譜儀，高速冷凍離心機，渦旋振蕩器；HPLCfe譜條件：檢測波長：254nm色譜柱： inertsil-ODS-S,P5um,4.6*150mm 流速： 1.0ml/min柱溫：40C流動相： 40（乙腈 ）： 60（50mM 磷酸鹽緩沖液）（注：50mM磷酸鹽緩沖液配制：6.8g磷酸二氫鉀，加入150ml氫 氧化鈉溶液（0.1M），配制成1L的磷酸鹽緩沖液）試劑：非那西丁注射劑，對乙酰氨基酚標準品，肝素鈉，10%高氯酸；實驗動物 ：雄性大鼠， 180g220g1.3 實驗步驟1.3.1 標準曲線的制備：取空白血漿，加入對乙酰氨基酚標準品，使其濃度分

3、別為 0.156,0.313,0.625,1.25,2.50,5.00,10.00ug/m。在給定的色譜條件 下進行HPLC分析，以樣品的峰面積對樣品濃度進行線性回歸。1.3.2給藥及血漿采集處理：取大鼠一只，尾靜脈注射非那西?。?0mg/kg）后，分別于 0，5,10,15,30,45,60,90,120min于尾靜脈取血0.5ml，肝素抗凝。離心取200ul血漿。向血漿中加入100ul 10%高氯酸，渦 旋振蕩1min （轉速為15000轉/分鐘），離心10min，取上清供HPLC分 析。1.4實驗結果處理表1體內實驗中對乙酰氨基酚標準曲線組別濃度(ug/ml)峰面積理論峰面積準確度10.

4、1561435919283(0.2554)20.3125439030.6253321936462(0.0889)41.2565033593550.095752.501067991051420.015865.002000671967140.0170710.00377336379859(0.0066)舍去第2組數(shù)據(jù)做圖得對乙酰氨基酚的標準曲線（圖1），用標準曲線的回歸方程帶入濃度計算標準曲線準確度（表1），可見除第1、2組數(shù)據(jù)外其他點基本符合準確度20%這一條件（考慮到樣品定量范圍且第一組數(shù)據(jù)準確度 基本接近20%，第1組數(shù)據(jù)不舍去），說明標準曲線有效，可用來計算定量樣 品。圖1體內實驗對乙酰氨基

5、酚標準曲線以得到的標準曲線的回歸方程計算以10mg/kg給藥的大鼠血漿樣本中的非那西丁的濃度得表2大鼠血漿樣本中非那西丁的濃度組別取血時間/mi n峰面積濃度/(ug/ml)16.5504641.007210.5492830.975314.5421070.779429.5359930.61254513359-0.006注：第5組數(shù)據(jù)是有問題的，有可能與大鼠的死亡前代謝狀態(tài)改變有 關系，故后續(xù)處理舍去第5組數(shù)據(jù)。靜脈注射后非那西丁在大鼠體內的代謝符合一房室模型，以一房室模型擬 合得圖2非那西丁 c-t 一房室擬合t/min根據(jù)擬合方程計算非那西丁的藥動學參數(shù)，得co =1.1621ug/mlVd

6、=xo/ co=1O(mg/kg)/1.1621(ug/ml)=8.6OL/kgti/2=0.693/k=0.693/0.0223=31.08mi nCL=kVd=0.0223*8.60L/kg=0.192L/(mi n kg)AUC= x0/(kVd)=10(mg/kg)/0.192L/(min kg)=52.08mg/L min1.5討論 標準曲線組數(shù)據(jù)為其他實驗組同學數(shù)據(jù)，本組由于HPLC測定時儀器出 倒峰，未取得實驗數(shù)據(jù)。取血點的設定：取血點應覆蓋藥物的吸收相、平衡相和消除相，一般設計在吸收相和平衡相各2-3個點，消除相內4-5個點。整個采樣時間至少應為 3-5個半衰期，或采樣持續(xù)至峰

7、濃度的 1/10-1/20。查文獻得非那西丁靜注后在 大鼠體內的半衰期一般為 0.5h 左右，故整個取血時間持續(xù) 1.5-2.5h 時較為合 理。3）色譜條件的設定：色譜條件的選擇首先應保證測定物質能夠良好的分 離，同時還應該考慮方法的可行性，需要的操作時間等因素。4）取血操作：應在取血前向 EP 管中加入適量肝素溶液，取入血液后立即 上下翻動 2-3 次使肝素與血液混合防止血液凝固，但不可用力過猛以免溶血影 響后續(xù)測定。5）數(shù)據(jù)分析：本組實驗中，由于大鼠死亡，取得血漿樣本的時間點較 少，故擬合曲線的偏差也比較大。因此雖然最后由此求得的t1/2 處于一般范圍內，但因為數(shù)據(jù)較少，且為單只動物實驗

8、，不排除結果的偶然性。2. 大鼠肝微粒體溫孵實驗2.1 實驗目的了解肝微粒體及肝微粒體酶活性的評價方法 ,學習肝微粒體溫孵液中對乙酰 氨基酚濃度測定方法的建立。2.2 實驗材料與方法儀器 ：HPLC-UV 色譜儀（色譜條件同前）、高速冷凍離心機、渦旋振蕩 器、恒溫水浴鍋；試劑：大鼠肝微粒蛋白溶液、NADPH再生系統(tǒng)（0.5mM NADP+、5mM MgCI、10mM G-6-P、1U G-6-P脫氫酶）、對乙酰氨基酚、非那西 丁、冰甲醇2.3 實驗步驟231.標準曲線的配制：180uI大鼠空白肝微粒體，加入20uI不同濃度的對乙 酰氨基酚，配成對乙酰氨基酚濃度分別為 1.56、 3.12、 6

9、.25、 12.5、 25、 50、 100uM的一系列溶液，再加入100ul冰甲醇沉淀，渦旋2min,12000rpm,離心10min, 取上清，20ul進樣分析。2.32溫孵實驗及樣品處理：80ul大鼠肝微粒體溶液，分別加入80ul濃度依 次為6.25、12.5、25、50、100、200、400uM的非那西丁探針底物，37 C預溫 孵5min后，再分別加入NADPH溶液40ul，于37 C溫孵30min。加入100ul冰甲 醇沉淀，渦旋2min,12000rpm,離心10min,取上層有機相200ul，20ul進樣分析2.4實驗結果：表3溫孵實驗中對乙酰氨基酚標準曲線組別濃度（umol/

10、l）峰面積理論峰面積準確度11.5636694332(0.1531)23.1261337731(0.2067)36.251448814552(0.0044)412.528850281700.024152558782554080.0609650108154109883(0.0157)7100139879第7組數(shù)據(jù)偏差較大，舍去第7組數(shù)據(jù)后作圖得標準曲線（圖3）,用標準曲 線的回歸方程帶入濃度計算標準曲線準確度（表 3），第2組數(shù)據(jù)準確度20% , 但舍去第2組數(shù)據(jù)后，得到的標準曲線雖然 R2稍有提高（R2 =0.998）,但再次代 入計算準確度時另幾組值準確度均有偏大傾向，且考慮到數(shù)據(jù)組數(shù)減少時

11、誤差 變大，故保留第2組數(shù)據(jù)。圖3溫孵實驗中對乙酰氨基酚標準曲線C(umol/L)用此標準曲線計算通過標準曲線計算出產物中對乙酰氨基酚濃度（表4），以非那西丁濃度和對乙酰氨基酚的生成速率，用雙倒數(shù)作圖法作圖（圖4），求得相關藥代動力學參數(shù)。表4溫孵實驗中相關數(shù)值計算組別峰面積C-PARA(umol/l)C-PHE(umol/L)1/c-PHEv-(umol/h/tei n)1/v125911.17436.250.1611.74260.0852293404.232912.50.0842.32950.0236360352.7351250.0427.35100.03664162257.35

12、33500.0273.53270.013652747412.45141000.01124.51390.008063446215.61842000.005156.18400.006474374719.82644000.0025198.26420.0050第1組數(shù)據(jù)不在標準曲線定量范圍內，第3組數(shù)據(jù)偏差過大，故舍去第1、3組數(shù)據(jù)，剩下5組數(shù)據(jù)以雙倒數(shù)法作圖。圖4雙倒數(shù)法作圖1/c-PHEv250.0000200.0000150.0000100.000050.00000.0000圖5底物濃度與反應物生成速率作圖c-PHE由圖4:km/vmax =0.2289 1/vmax =0.006進而，vmax

13、=166.67umol/h/gkm= 38.15umol/L求得的vmax為166.67 umol/h/g,但顯然測得的實測數(shù)據(jù)中的 v最大值大于 此值，以底物濃度對反應速率作圖（圖5），也可看出曲線在最后一個點時仍呈上升趨勢，也就是說在曲線范圍內并未達vmax，結果存在偏差。圖6雙倒數(shù)法作圖（2）0.01400.01200.01000.00800.00600.00400.00200.0000繼續(xù)舍去表4中第2組數(shù)據(jù)進行雙倒數(shù)回歸，0.01601/v由圖6：km/vmax =0.4832 1/vmax =0.0037進而，vmax=270.27umol/h/gkm= 130.59umol/L該

14、條件下求得的vmax雖然不在標準曲線定量范圍內，但比較符合圖5中的反應趨勢，更接近反應的真實狀態(tài)。2.5討論：1）終止試劑的選擇：酶反應實驗中，終止試劑的選擇非常重要，該類型實 驗中一般可選的終止試劑有乙腈和冰甲醇等，有實驗表明乙腈終止時易產生干 擾，故本實驗選擇了冰甲醇作為終止劑。2）數(shù)據(jù)分析：根據(jù)溫孵實驗結果的結果分析，實驗中反應并未達到最大反 應速率。一般在酶促反應中，反應的速率取決于底物濃度、反應時間、酶活性等因素，本次實驗中在實驗條件下未達到vmax，可能是由于此次所用的肝微粒體酶活性活性較高，在所設定的底物濃度范圍內酶仍未達到飽和，可以通過減 少肝微粒體酶的使用量，或者擴大底物濃度的設定范圍來進行改善實驗，使實 驗結果更具有科學性。個人總結相較于往常的按照既定實驗步驟操作的實驗，本學期的實驗需要實驗者更 加注重細節(jié)與思考，探索實驗中每一項設定的原因、合理性、以及不同的條件 設定對實驗結果的影響，在此基礎下，進行實驗、處理結果時又更容易促發(fā)對 實驗原理和過程的反思，從而對整個實驗以及藥代動實驗的設計有了一個比較 深的認識。另外得到的一點教訓是，實驗過程中數(shù)據(jù)及相關信息的記錄至關重 要，尤其是實驗時間跨