第八章_抗生素藥物的分析ppt課件

1、第八章 抗生素藥物的分析.第一節(jié) 概 述抗生素的概念：具有抑制或殺滅微生物的一類物質(zhì)。抗生素的特征：生物體在生命活動過程中合成的次級代謝產(chǎn)物。性質(zhì)不穩(wěn)定，易降解、聚合純度普通較低臨床上會引起不良反響臨床運(yùn)用廣泛，影響大.抗生素藥質(zhì)量量研討的工程：性狀及鑒別實驗，含量測定或效價測定，酸堿度測定，澄明度，水分或枯燥失重，平安實驗異常毒性，熱原，降壓物質(zhì)，無菌。其他檢查：組分、雜質(zhì)、晶型、比旋度、灰分、重金屬、熔點等。抗生素藥品分析常用的方法：物理方法:旋光法、紫外、紅外、色譜等化學(xué)方法專屬性不強(qiáng)：功能團(tuán)反響，鑒別和含量的測定。容量分析法：酸堿滴定青霉素含量測定和碘量法。生物學(xué)方法：酶反響、微生物法

2、測定效價.第二節(jié) 抗生素效價微生物檢定法 一、微生物檢定法定義： 是利用微生物發(fā)育時對某些物質(zhì)的特殊依賴性，按這些物質(zhì)對微生物生長的影響，對他們作出定量鑒定的方法。微生物檢定法可分為三類：稀釋法dilute method、比濁法 turbid compare method、瓊脂分散法diffuse method。.與化學(xué)方法相比：優(yōu)點：1、原理與醫(yī)療要求根本一致 2、對微生物作用直接反映其抗菌活性缺陷：1、結(jié)果是總效價，無法區(qū)分多組分 2、時間長，有一定誤差，操作繁雜.二、抗生素規(guī)范效價potency)單位牛津單位:抑制50毫升肉湯培育基中金黃色葡萄球菌生長的青霉素的最低含量為一個牛津單位.一

3、個牛津單位相當(dāng)于0.6ug的青霉素鈉鹽所具有的抗生活力，1mg青霉素G鈉鹽含有1667個牛津單位,(IU)一稀釋單位 (u/ml，u/mg)將1mg抗生素配成溶液，在一定條件下進(jìn)展稀釋，對某一細(xì)菌能抑制其生長的最高稀釋度，即為1mg抗生素中可含有的單位。.二分量單位 (u/mg) 以抗生物有效成分即生理活性部分的分量作為抗生素的單位。稱分量單位.。如一個鏈霉素堿單位的分量為1微克，一個青霉素G鈉鹽的單位的分量為0.6微克。同一種抗生素的各種鹽的校價可根據(jù)其分子量與規(guī)范鹽類進(jìn)展換算而得。.青霉素G鉀鹽的實際效價U/mg=U/mg.1類似分量單位: 以抗生素鹽類純品的分量為單位。包括無生物活性的酸

4、根和金屬離子。2分量折算單位 以與原始的生物活性相當(dāng)?shù)募兛股貙嵺`分量為一個單位，3特定單位 以特定抗生素某一批產(chǎn)品的某一分量為一個單位，經(jīng)有關(guān)國家權(quán)威機(jī)構(gòu)認(rèn)可而定.效價測定的方法：一、稀釋法dilute method二、比濁法 turbid compare method三、瓊脂分散法diffuse method .一、稀釋法 原理：用液體培育基逐級將抗生素稀釋，在各管中參與等量的實驗菌液，進(jìn)展培育，察看抑制細(xì)菌生長的最低抗生素濃度，再與同法測定的規(guī)范品終點作比較，從而求得被測抗生素的效價。.X=(T/S)*CX樣品效價(U/ml)T檢品液最大稀釋倍數(shù)S規(guī)范品液最大稀釋倍數(shù)C規(guī)范品液效價(U/

5、ml).試管編號12345678910稀釋倍數(shù)規(guī)范品供試品2-4-8-16-32-+64+128+256+512+1024+-：細(xì)菌被抑制 +：細(xì)菌生長X=(T/S)*C=16/32*40=20 U/ml).檢測終點判別：1、實驗菌生長完全抑制2、生長50%抑制3、指示劑變色4、電位差的改動5、菌種的溶血景象等.二、比濁法 原理：將一定量的抗生素加至接種有實驗微生物的液體培育基內(nèi)，混勻后，經(jīng)短期培育約3-4h，丈量培育基濁度，其濁度與細(xì)菌數(shù)、細(xì)菌群體質(zhì)量存在直接關(guān)系，在一定的范圍內(nèi)符合比耳定律。 細(xì)菌數(shù)、細(xì)菌群體質(zhì)量又直接受抗生素效價的影響。.影響要素：一、影響比濁法的物理要素 1、散射景象

6、2、菌液濃度： 3、細(xì)菌體大小的變化二、培育基：在沒有外加抑制劑的情況下，菌體的生長受培育基的成分、酸度、培育溫度、通氣等條件影響。普通的實驗菌是金黃色葡萄球菌，pH在6.8-7.8。三、培育：溫度、振搖。普通培育時間3小時，可縮短為2小時。.操作流程如圖：.根本要點：1 培育條件的控制：試管規(guī)格均一 水浴箱水溫均勻，試管按拉丁方陳列。2 細(xì)菌生長誤差的控制：3 丈量時間的控制：各管應(yīng)先充分混勻，將菌液移入比色皿后靜止2分鐘后測定。.三、瓊脂分散法diffuse method 即管碟法管碟法原理: 抗生素在涂布特定菌的瓊脂培育基內(nèi)分散，構(gòu)成一定濃度抗生素的球型區(qū)，抑制實驗菌生長，經(jīng)過透明培育基

7、察看抑菌圈，抗生素劑量的對數(shù)與抑菌圈面積或直徑成正比。在同樣條件下將知效價的規(guī)范品溶液與未知效價的供試品溶液的劑量反響(抑菌圈)進(jìn)展比較；當(dāng)規(guī)范品和供試品是屬于同一性質(zhì)的抗生素時，規(guī)范品溶液和供試品溶液對一定實驗菌所得的劑量反響曲線，在一定劑量范圍內(nèi)應(yīng)相互平行。根據(jù)以上原理，可設(shè)計為一劑量法、二劑量法及三劑量法。從而可以較為準(zhǔn)確地測定供試品的效價。.抑菌圈的構(gòu)成. M:抗生素在管中的量D：分散系數(shù)T：分散時間C：最低抑菌濃度H：培育基厚度.D的影響要素：抗生素本身構(gòu)造、分子量等，構(gòu)造簡單者容易分散，分子量大的分散就慢，雜質(zhì)：抗生素或培育基中含有雜質(zhì)，雜質(zhì)本身也有分散系統(tǒng)，看干擾抗生素的分散，影

8、響抑菌圈的大小和明晰度。瓊脂含量：含量過多影響抗生素的分散，過少又使鋼管下陷，影響抑菌圈的大小。菌種對抗生素的吸附作用：pH影響分子的方式、溫度影響分散D增大，r也增大.T的影響： 普通T添加，r增大，但時間太長影響抑菌圈明晰度。M的影響：在一定的范圍內(nèi)，小管內(nèi)M越大，抑菌圈直徑越大，M還與抗生素的抗菌活性、濃度、鋼管的大小、劑型、輔料等有關(guān)。C的影響：C越小，抑菌圈直徑越大，C與菌種、菌量、培育基、溫度等有關(guān)H的影響：培育基增厚，那么抑菌圈減小。.操作中要留意：1實驗菌種：挑選適宜的敏感菌；用適宜的菌種保管方法；定期對菌種分別純化；控制菌齡菌量。2培育基：培育基的成分影響抑菌圈的大小和明晰度

9、，pH也很重要。.一劑量法規(guī)范曲線法一劑量法規(guī)范曲線法原理：在一定范圍內(nèi)，抑菌圈的直徑隨抗生素濃度的增減而增減。并且抑菌圈的直徑與抗生素的對數(shù)劑量成線性關(guān)系。據(jù)此測定抗生素效價。 .Y=a+bXY:抑菌圈直徑A：截距B：斜率X：抗生素濃度的對數(shù)。 .方法：為了消除平板間的差別，在每一平板的含菌培育基上放置6個小鋼管，相間的3個小管內(nèi)參與抗生素規(guī)范品的某一濃度Ck, 他所產(chǎn)生的抑菌圈直徑平均值為 ，另外3個小管內(nèi)參與規(guī)范品的中心濃度Co,他所產(chǎn)生的抑菌圈直徑平均值為 。 令fk =這樣采用本身對照的方法，可以消除平板間的誤差，使結(jié)果更加準(zhǔn)確。f= a+bX規(guī)范曲線的制備：做8個濃度，取24個平皿

10、，分8組，每組3個取平均值。fk對X作圖。- .檢品的效價檢定： 取3個平皿，每個放6個小管。在間隔的3個小管內(nèi)參與抗生素規(guī)范品的中心濃度(Co),另3 個小管內(nèi)參與估計濃度相當(dāng)于Co的檢品溶液。丈量出fk,從規(guī)范曲線中計算出檢品的濃度，在換算出每毫克的單位數(shù)。.二劑量法： 將抗生素的規(guī)范品及檢品各稀釋成有一定比例的二種劑量2：1或4：1，即高劑量和低劑量，在同一平板上進(jìn)展對比，根據(jù)所產(chǎn)生抑菌圈大小來計算檢品效價的方法。.SH:為抗生素規(guī)范品高劑量dS2所致的抑菌圈直徑SL：為抗生素規(guī)范品低劑量(dS1)所致的抑菌圈直徑UH：為抗生素檢品高劑量(dT2)所致的抑菌圈直徑UL：為抗生素檢品低劑量

11、(dT1)所致的抑菌圈直徑.要求：1、高劑量抑菌圈直徑應(yīng)為2024nm，個別可為1824mm，高劑量與低劑量抑菌圈直徑之差應(yīng)大于或等于2mm。2、底層瓊脂20ml，上層5ml，每一檢品所用平板不少于4個。3、等距安頓小鋼管4個，相對角為同一物質(zhì)。4、 為10010%更準(zhǔn)確要求1005%5、規(guī)范品與檢品同質(zhì).三劑量法： 運(yùn)用高、中、低三種劑量，在同一實驗條件下比較規(guī)范品及檢品溶液的抑菌圈大小，以求得檢品效價的方法。.S3:為抗生素規(guī)范品高劑量dS3所致的抑菌圈直徑S2: 為抗生素規(guī)范品中劑量dS2所致的抑菌圈直徑S1: 為抗生素規(guī)范品低劑量dS1所致的抑菌圈直徑U3：為抗生素檢品高劑量(dT3)

12、所致的抑菌圈直徑U2：為抗生素檢品中劑量(dT2)所致的抑菌圈直徑U1: 為抗生素檢品低劑量(dT1)所致的抑菌圈直徑.要求：1、規(guī)范品中劑量抑菌圈直徑1518mm2、高、中、低劑距為1:0.83、每一檢品不得少于6個平皿4、每板上等距安放小鋼管6個5、: 10010%100%5%.三 影響抗生素效價管碟法測定結(jié)果的要素及其控制一影響抑菌圈外形的要素與控制 1稀釋抗生素用的緩沖液的PH值、鹽濃度的影響 . pH值低或含鹽濃度高，就會不顯抑菌圈或呈卵圓形抑菌圈。這是由于抗生素溶液的鹽濃度高或pH值過低，能夠改動抗生素分子的解離形狀，影響了抗生素對實驗菌抑制造用。 2制各瓊脂培育基菌層，加菌時培育

13、基溫度的影響 3測試用的器材洗凈度的影響 4 雙碟培育溫度的影響 5 其他操作的影響.二影響抑菌圈邊緣明晰度的要素與控制 1 實驗菌長時間放置菌群中的一些菌株生理特性有所變化，或是生長速度改動，或?qū)股氐拿舾卸扔兴兓霈F(xiàn)雙圈，抑菌圈的邊緣不清。 在檢定時菌層培育基中的菌量影響抑菌圈，菌層培育基中的菌量過低，抑菌圈邊緣模糊不清，菌量過高、使抑菌圈太小并且影響實驗菌靈敏度。因此，在正式檢測之前，找出最適菌量。 2 培育基的原資料種類與質(zhì)量，生測用培育基用的原資料的選擇很重要。 3調(diào)理培育基的pH值或添加適量的鹽濃度可使抑菌圈明晰. 4不適當(dāng)延伸雙碟的培育時間，使抑菌圈邊緣不清。.抗生素效

14、價管碟法測定的操作技術(shù)操作分為八步：1實驗菌的純化與懸液的制備2 緩沖液、滅菌水與培育基的制備3規(guī)范品、供試品的稱量、溶解與稀釋4 雙碟的制備及放管5 滴加藥液6恒溫培育7 丈量抑菌圈直徑或面積8 計算操作流程：.四、比濁法與管碟法比較比濁法管碟法優(yōu)點1、快速1、結(jié)果較穩(wěn)定2、客觀、精確2、大批量3、無擴(kuò)散影響缺點1、對樣品潔凈度要求高1、擴(kuò)散因素影響較大2、實驗要求較嚴(yán)2、時間長（2天)3、操作繁瑣,人為因素的干擾.第二節(jié) 抗生素類藥物的鑒別.一、-內(nèi)酰胺類抗生素的鑒別構(gòu)造的共同點：1、和內(nèi)酰胺相鄰的碳原子上有一羧基，2、內(nèi)酰胺中氮原子相對的碳原子上有一功能團(tuán)氨基。 分類：青霉烷類，頭孢烯類

15、，碳青霉烯類硫霉素，單環(huán)-內(nèi)酰胺克拉維酸。.鑒別： 1、酶法： -內(nèi)酰胺酶2、紅外吸收光譜法：3000-2800(C-H),3350cm-1(N-H),1800-1600(羰基)，1460-5甲基或次甲基3、紫外吸收光譜法4、茚三酮反響：是氨基的反響，與茚三酮縮合， 生成藍(lán)紫色化合物。 5、色譜法：薄層色譜后，氯鉑酸與硫醚基反響是靈敏度高的顯色試劑 .二、氨基糖苷類抗生素環(huán)己醇配基以糖苷鍵與氨基糖相連。鏈霉素，布魯霉素，卡那霉素，慶大霉素，新霉素。 一呈色反響1、茚三酮反響：2、坂口反響：鏈霉素水解產(chǎn)物鏈霉胍特有。鏈霉胍，8-羥喹啉分別與次溴酸鈉反響，其各自的產(chǎn)物在相互作用生成橙紅色化合物。

16、3、糖類反響：莫利西反響 脫水 -奈酚糖 糠醛 紅紫色產(chǎn)物.4、埃爾松-摩根：樣品在強(qiáng)酸或強(qiáng)堿水解后釋放出氨基乙糖，在堿性條件下與乙酰丙酮縮合，構(gòu)成吡咯樣的衍生物，在堿性條件下與對二甲胺基苯甲醛的乙醇及鹽酸溶液成紅色，在540nm處可定量測定。5、麥芽酚反響： 水解、重排 Fe3+鏈霉糖 麥芽酚 紫紅色絡(luò)合物 OH- H+.三、四環(huán)類抗生素構(gòu)造:氫化四駢苯,四環(huán)素，土霉素，金霉素，強(qiáng)力霉素。 一呈色反響 1、濃硫酸反響 四環(huán)素 深紫色； 金霉素 藍(lán)色至綠色； 土霉素 朱紅色； 強(qiáng)力霉素 黃色； 2、三氯化鐵反響：酚羥基 二熒光反響:土霉素綠色熒光，四環(huán)素黃色熒光 三紫外光譜 四色譜.四、大環(huán)內(nèi)

17、酯抗生素 構(gòu)造：一個大環(huán)內(nèi)酯環(huán)為母核，經(jīng)過糖苷鍵與1-3個糖相連。 紅霉素，螺旋霉素，柱晶白霉素 一呈色反響 1、硫酸反響：遇硫酸均呈紅棕色 2、莫利西反響：糖類的反響 3、Seliwanaff 反響： 脫水 間苯二酚糖 糖醛衍生物 具顏色產(chǎn)物 紅霉素 淡黃色； 螺旋霉素 亮紫紅色；碳霉素 深青紫色； 柱晶白霉素 淡青色；.二薄層色譜(三) 光譜學(xué)鑒別紫外光譜紅外光譜.五、利福霉素類抗生素的鑒別構(gòu)造：一個脂肪鏈經(jīng)過酰胺鍵與一個平面的芳香基團(tuán)銜接成一個環(huán)橋式化合物，所以又稱環(huán)橋類抗生素。代表藥物：利福平rifampicin鑒別：呈色反響：1濃鹽酸反響：2三氯化鐵：，向1毫升利福霉素的溶液中，滴加

18、三氯化鐵乙醇溶液，有綠色，藍(lán)綠色。闡明有酚羥基3硝酸鹽反響：利福平，溶液中參與硝酸鈉溶液，顏色由橙色變?yōu)榘导t色。.六、多肽類抗生素： 抗感染的桿菌肽Bacitracin、多粘菌素、萬古霉素。用于癌癥治療的放線菌蘇D、搏來霉素。鑒別：茚三酮反響：磷鎢酸反響：雙縮脲反響：.第三節(jié) 抗生素類藥物的雜質(zhì)檢查一、高分子雜質(zhì)、降解產(chǎn)物及異構(gòu)體 1、青霉素 過敏原：青霉噻唑多肽或青霉噻唑蛋白 凝膠過濾法分別，用Penamaldate法測定 HgCl2 青霉噻唑衍生物 Penamaldate 半合成-內(nèi)酰胺類抗生素中微量雜質(zhì)N,N二甲基苯胺的測定：.2、鏈霉素毒性雜質(zhì): 鏈霉胍,鏈胍雙氫鏈糖;雙氫鏈霉素;鏈霉

19、素醛基結(jié)合物; 神經(jīng)毒性：二鏈霉胺二鏈霉胺含量測定原理:二鏈霉胺等不被KBH4復(fù)原，能與鹽酸氨基脲反響，生成的縮氨脲在233nm有吸收峰.3、土霉素 脫水土霉素、差向土霉素、-阿撲土霉素、-阿撲土霉素等降解產(chǎn)物 薄層分別，熒光測定4、四環(huán)素 脫水四環(huán)素、差向四環(huán)素、差向脫水四環(huán)素 HPLC測定.二、無機(jī)雜質(zhì)的檢查三、溶媒殘留量 1、比色法： 甲醇氧化成甲醛，用品紅試劑測定 丙酮與水楊醛縮合比色 醋酸丁酯與鹽酸羥胺反響后比色測定 2、氣相色譜 3、HPLC 4、紅外光譜.青霉素鈉 拼音名：Qingmeisuna 英文名：Benzylpenicillin Sodium C16H17N2NaO4S 356.38 本品為(2S,5R,6R)-3,3- 二甲基-6-(2-苯乙酰氨基)-7- 氧代-4- 硫雜-1- 氮雜雙環(huán)3.2.0 庚烷-2- 甲酸鈉鹽。按無水物計算，含青霉素按C16H17N2NaO4S 計算，不得少于96.0 【性狀】 本品為白色結(jié)晶性粉末；無臭或微有特異性臭；有引濕性；遇酸、堿或氧化劑等即迅速失效，水溶液在室溫放置易失效。 本品在水中極易溶解，在乙醇中溶解，在脂肪油或液狀石蠟中不溶。 .【鑒別】 (1) 取本品與知含