(完整版)4-轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究方法課件

1、轉(zhuǎn)錄組學(xué)基本研究方法陳軍chenjun2011.5.10上堂課內(nèi)容mRNA檢測技術(shù)核酸雜交技術(shù)原位雜交逆轉(zhuǎn)錄PCR (Reverse transcription PCR，RT-PCR)RACE全長cDNA文庫Real-time PCR核酸雜交northern blot放射性同位素標(biāo)記物-32P-dCTP靈敏度達(dá)0.01pg非放射性標(biāo)記物地高辛靈敏度達(dá)0.1pgDIG-dUTP-通過酶促反應(yīng)摻入到DNA/RNA中去制成探針-雜交-加抗地高辛-酶的復(fù)合物加底物顯色探針制備探測不同條件下的基因表達(dá)變化B. WITEK-ZAWADA,200328S rRNA18S rRNAFISH：Fluoresce

2、nce In Situ Hybridization原位雜交1原位雜交3Moroz LL, 2006逆轉(zhuǎn)錄酶：依賴于RNA的DNA聚合酶。這種酶是 1970 年美國科學(xué)家特明 (H. M. Temin) 和巴爾的摩 (D. Baltimore) 分別于動物致癌 RNA 病毒中發(fā)現(xiàn)，他們并因此獲得 1975 年度諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。逆轉(zhuǎn)錄(Reverse transcription)RT-PCR是將RNA的反轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U增（PCR）相結(jié)合的技術(shù)。首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶的作用從RNA合成 cDNA，再以cDNA為模板，擴增合成目的片段。RT-PCR以mRNA的polyA為錨定3 R

3、ACE原理上比3RACE要稍微復(fù)雜要點: 逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV合成cDNA具有加尾特性，即在合成的cDNA鏈3加上3-4個dCTP，而且當(dāng)存在帽子結(jié)構(gòu)時該酶的加尾活性最高然后以這段polyC為錨定5 RACEReal-time PCR轉(zhuǎn)錄組學(xué)基本研究方法概念基于測序的轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法EST全長cDNA文庫生物信息學(xué)分析基于雜交的轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法基因芯片生物信息學(xué)分析本堂課內(nèi)容Ct：threshold cycleReal-time PCR 基本原理SYBR-Green熒光染料標(biāo)定dsDNA理論上N1/N2 = 2Ct實際上PCR擴增的效率并非100%CtN1N2什么是轉(zhuǎn)錄組、轉(zhuǎn)錄組學(xué)轉(zhuǎn)錄組（Transcri

4、ptom）：細(xì)胞所包含mRNA的總和。與基因組不同的是，轉(zhuǎn)錄組的定義中包含了時間和空間的限定。 轉(zhuǎn)錄組學(xué)（Transcriptomics）：研究細(xì)胞在某一功能狀態(tài)下所含mRNA的類型與拷貝數(shù)；比較不同功能狀態(tài)下mRNA表達(dá)的變化，搜尋與功能狀態(tài)變化緊密相關(guān)的重要基因群。 轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究方法基于測序：全長cDNA文庫、EST文庫、SAGE基于雜交：cDNA芯片（GeneChip，microarray）基因表達(dá)聚類cDNA文庫cDNA:為具有與某RNA鏈呈互補的堿基序列的單鏈DNA即complementary DNA之縮寫。 以mRNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶在體外反轉(zhuǎn)錄成cDNA，與適當(dāng)?shù)妮d體（常用噬

5、菌體或質(zhì)粒載體）連接后轉(zhuǎn)化受體菌，則每個細(xì)菌含有一段cDNA，并能繁殖擴增，這樣包含著細(xì)胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合稱為該組織細(xì)胞的cDNA文庫。 全長cDNA文庫構(gòu)建EST90年代初Craig Venter 提出了EST的概念，并測定了609條人腦組織的EST，宣布了cDNA大規(guī)模測序的時代的開始 (Adams et al., 1991)。EST（Expressed Sequence tags，表達(dá)序列標(biāo)簽 ）是從已建好的cDNA庫中隨機抽取克隆，從5末端或3末端對插入的cDNA片段進行一輪單向自動測序，所獲得的約60-500bp的一段cDNA序列。 1993年前EST數(shù)據(jù)收錄于Ge

6、nBank， EBI和DDBJ。 1993年NCBI(National Center of Biotechnology Information)建立了一個專門的EST數(shù)據(jù)庫dbEST來保存和收集所有的EST數(shù)據(jù)。 95年中期GenBank 中EST的數(shù)目超過了非EST的數(shù)目。 現(xiàn)在GenBank中EST的數(shù)目已經(jīng)超過了三千五百萬，約占GenBank中序列數(shù)的60%. EST相關(guān)數(shù)據(jù)庫 儲存EST原始數(shù)據(jù)的一級數(shù)據(jù)庫 EMBL GenBank (dbEST) DDBJ UniGene (/UniGene) TIGR Gene Indices (/tdb/tgi/) STACK (http:/ww

7、w.sanbi.ac.za/Dbases.html)對EST進行聚類拼接的二級數(shù)據(jù)庫EST已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用于基因識別，因為EST的數(shù)目比GenBank中其它的核苷酸序列多，研究人員更容易在EST庫中搜尋到新的基因(Boguski et al., 1994). 在同一物種中搜尋基因家族的新成員(paralogs)。 在不同物種間搜尋功能相同的基因(orthologs)。 已知基因的不同剪切模式的搜尋?！咀ⅲ翰贿^很難確定一個新的序列是由于交替剪切產(chǎn)生的或是由于cDNA文庫中污染了基因組DNA序列(Wolfsberg et al., 1997)】EST的應(yīng)用 1： EST與基因識別因為EST序列是從

8、某特定組織的cDNA文庫中隨機測序而得到，所以可以用利用未經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化和差減雜交的cDNA文庫EST分析特定組織的基因表達(dá)譜。標(biāo)準(zhǔn)化的cDNA文庫和經(jīng)過差減雜交的cDNA文庫則不能反應(yīng)基因表達(dá)的水平。 CGAP 為研究癌癥的分子機理，美國國家癌癥研究所NCI的癌癥基因組解析計劃(Cancer Genome Anatomy Project , CGAP)構(gòu)建了很多正常的或是癌癥前期的和癌癥后期的組織的cDNA文庫，并進行了大規(guī)模的EST測序，其中大部分的文庫未經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化或差減雜交處理。CGAP網(wǎng)站提供了多種工具用以分析不同文庫間基因表達(dá)的差異, 如： Digital Gene Expression D

9、isplayer (DGED) cDNA xProfilerEST的應(yīng)用 4：利用EST大規(guī)模分析基因表達(dá)水平EST技術(shù)流程：一、cDNA文庫構(gòu)建 非標(biāo)準(zhǔn)化的cDNA文庫的構(gòu)建。（可用于基因表達(dá)量的分析） 經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化或扣除雜交處理的cDNA文庫。（富集表達(dá)豐度較低的基因） Oligo d(T) cDNA文庫。（非翻譯區(qū)由于不含有編碼序列，與編碼區(qū)保守序列相比所受到的選擇壓力比較小，因而其多態(tài)性程度比較高，便于多態(tài)性位點的選擇以用于遺傳圖譜的構(gòu)建。 ） 隨機引物cDNA文庫。（所獲得的EST在基因功能的鑒定時具有更多的信息含量，并且在構(gòu)建EST數(shù)據(jù)庫時更有優(yōu)勢，同時有利于利用EST數(shù)據(jù)庫聚類完整的

10、基因和閱讀框的尋找，便于利用更敏感的蛋白質(zhì)比較來尋找同源基因。 ）二、序列測定及數(shù)據(jù)分析隨機挑取克隆進行5或3端測序序列前處理聚類和拼接基因注釋及功能分類后續(xù)分析 EST軟件平臺EST序列庫/序列的質(zhì)量檢查測序量監(jiān)控聚類和拼接檢查（借助于基因組信息）全長ORF尋找發(fā)現(xiàn)全長基因研究表達(dá)基因概況的主要實驗手段（DNA chip、proteomics的先驅(qū)）功能分類表達(dá)量分析SAGE的先驅(qū)交替剪接檢測EST特有信息測序方向的選擇根據(jù)不同的實驗?zāi)康倪x擇不同的測序方向： 5端 5上游非翻譯區(qū)較短且含有較多的調(diào)控信息。一般在尋找新基因或研究基因差異表達(dá)時用5端EST較好，大部分EST計劃都是選用5端進行測

11、序的，而且從5端測序有利于將EST拼接成較長的基因序列。 3端 3端mRNA有一20200bp的plyA結(jié)構(gòu)，同時靠近plyA又有特異性的非編碼區(qū)，所以從3端測得EST含有編碼的信息較少但研究也表明，10的mRNA3端有重復(fù)序列，這可以作為SSR標(biāo)記；非編碼區(qū)有品種的特異性，可以作為STS標(biāo)記 兩端測序 獲得更全面的信息。基因注釋及功能分類注釋： 序列聯(lián)配 Blastn， Blastx 蛋白質(zhì)功能域搜索(二結(jié)構(gòu)比對) Pfam Interproscan 較好匹配InterproScanNt BlastnEST sequencesNr Blastx完成注釋無理想匹配較好匹配完成注釋無理想匹配較好

12、匹配無理想匹配New sequences域的注釋后 續(xù) 分 析常用的基因注釋流程 手工分類 大部分以Adams 95年的文章中的采用分類體系為標(biāo)準(zhǔn)?！続dams. MD, et al. Initial assessment of human gene diversity and expression patterns based upon 83 million nucleotides of cDNA sequence. Nature. 1995 377(6547 Suppl):3-174 】 計算機批量處理 利用標(biāo)準(zhǔn)基因詞匯體系Gene Ontology，進行近似的分類(分子功能、生物學(xué)過程、

13、分子組分)。 (/) 基因產(chǎn)物直系同源簇的分析（COG：Cluster of Orthologous Groups of proteins ） (/COG/)基因功能分類 表1：家豬脂肪組織的已知基因功能分類表2：豬脂肪組織與豬胚胎胸腺組織和豬甲狀腺組織表達(dá)譜的比較參考文獻：1、豬脂肪組織表達(dá)序列標(biāo)簽（ESTs）大規(guī)模測序及分析 鄧亞軍等，遺傳學(xué)報，Vol.31, NO.11, 2004 2、兩種家豬心臟組織基因表達(dá)譜的分析 曾燕舞等，遺傳學(xué)報，Vol.31, No.6, 2004 EST的代謝途徑分析(KEGG) http:/www.genome.ad.jp/kegg/ 后續(xù)分析 比較基因組

14、學(xué)分析 基因表達(dá)譜分析 新基因研究 基因可變剪切分析 實驗驗證 MicroArray GeneChip RTPCR Northern blotting EST很短，沒有給出完整的表達(dá)序列； 低豐度表達(dá)基因不易獲得； 由于只是一輪測序結(jié)果，出錯率達(dá)2%-5%； 有時有外源的mRNA污染或是基因組DNA的污染； 有時出現(xiàn)鑲嵌克?。?序列的冗余，導(dǎo)致所需要處理的數(shù)據(jù)量很大。EST數(shù)據(jù)的不足基因芯片Spotted MicroarrayscDNA ArraysOligo Arrays In Situ Oligo SynthesisPhotosynthesisPlaner surfaceMicroflui

15、dics chipE-field synthesisIntegrated Chips Integrated uF, microarray and detection chips with PCR, fluorescence or e-detectionMicrofluidicsPlasticsCeramics SiliconOther materials不同的生物芯片技術(shù)平臺點樣芯片原位合成芯片微流體芯片整合型芯片基因芯片的探針Tagged RNA fragments flushed over arrayLaser activation of fluorescent tagsOptical s

16、canning of hybridization intensities基因芯片的雜交實驗點樣芯片非接觸式接觸式點樣芯片預(yù)先合成探針 Oligo探針 （GoArrays） PCR產(chǎn)物探針 （Primegens）點制芯片 預(yù)先合成好的探針通過類似于噴墨打印機的技術(shù)噴射到玻璃基片表面，或者用針頭點在片基上。 芯片探針的設(shè)計PCR產(chǎn)物設(shè)計軟件（Primegens） /structure/primegens/ Oligo芯片設(shè)計軟件 （GoArrays） http:/www.isima.fr/bioinfo/goarrays/點制過程Selectively expose array sites to

17、lightFlush chips surface with solution of protected A, C, G, TAffymetrix 基因芯片合成原理光源遮蔽板芯片array probesA 33 arrayCGACGACACGAGCGAGCNucleotide Deposition Sequence ACGA Mask 1AAAAA探針合成array probesA 33 arrayCGACGACACGAGCGAGCNucleotide Deposition Sequence ACGC Mask 2CCCCCCAAAAA探針合成A 33 arrayCGACGACACGAGCGAG

18、CNucleotide Deposition Sequence ACGG Mask 3CCCCCCAAAAAGGGGGGCGACGACGAGCGAGCAC探針合成完成的芯片LTLLLCLLLLLLLLACTTTACCCCCCGCCGATATCATCATCGACGAACTACTAGCAGCTTOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPLTLLLCLLLLLLLLACTTTACCCCCCGCCGATATCATCATCGACGAACTACTAGCAGCTTOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPLTLLLCLLLLLLLLACTTTACCCCCCGCCGATATCATCATCGACGA

19、ACTACTAGCAGCTTOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOP全自動芯片合成 For growth step: one type of monomer is coupled to specific sites deprotected using PGA.Computer generated light irradiation patternsXeotron DNA 芯片合成系統(tǒng)DNA SynthesizerIrradiation monitor樣本的處理方法按照樣本分 DNA、RNA、DNA-蛋白復(fù)合體按照標(biāo)記信號分子劃分 熒光燃料、生物素、放射性元素按照標(biāo)記方法分 cDNA 直接標(biāo)記(間接標(biāo)記)、