杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院ppt課件

1、SDS - PAGE測(cè)定蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?了解SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的原理，并學(xué)會(huì)用這種方法測(cè)定蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量。二、實(shí)驗(yàn)原理 聚丙烯酰胺凝膠電泳之所以能將不同的大分子化合物分開，是由于這些大分子化合物所帶電荷的差別和分子大小不同之故，假設(shè)將電荷差別這一要素除去或減小到可以忽略不計(jì)的程度，這些化合物在凝膠上的遷移率那么完全取決于相對(duì)分子質(zhì)量。 SDS是十二烷基硫酸鈉sodium dodecyl sulfate的簡(jiǎn)稱，它是一種陰離子去污劑，它能按一定比例與蛋白質(zhì)分子結(jié)合成帶負(fù)電荷的復(fù)合物，其負(fù)電荷遠(yuǎn)遠(yuǎn)超越了蛋白質(zhì)原有的電荷，也就消除或降低了不同蛋白質(zhì)之間原有的電荷差別，這樣就

2、使電泳遷移率只取決于分子大小這一要素，就可根據(jù)規(guī)范蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量的對(duì)數(shù)對(duì)遷移率所作的規(guī)范曲線求得未知蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)用目前常用的垂直平板電泳，樣品的起點(diǎn)一致，便于比較。三、實(shí)驗(yàn)器材直流穩(wěn)壓電泳儀 垂直平板電泳槽含玻璃板、夾條、梳齒、夾子等移液器1.0ml、200l、20l微量注射器20l燒杯、培育皿、試管、滴管、直尺 脫色搖床四、實(shí)驗(yàn)試劑1. 凝膠貯備液：丙烯酰胺Acr29.2g和亞甲基雙丙烯酰胺Bis0.8g重蒸水溶 解后，定容至100ml，棕色試劑瓶4保管，30天內(nèi)運(yùn)用。 2. 分別膠緩沖液：1.5mol/L Tris-HCl，pH8.8。 18.15 Tris三羥甲基氨基

3、甲烷，少許重蒸水溶解，用1M HCl調(diào)pH8.8，重蒸水定容至100ml，4保管。3. 濃縮膠緩沖液：0.5mol/LHCl，pH6.8。6gTris, 少許重蒸水溶解，用1M HCl調(diào)pH6.8，重蒸水定容至100ml，4保管。4. 10%SDS，室溫保管。5. 兩類樣品緩沖液： 2倍復(fù)原緩沖液2reducing buffer 0.5mol/L HCl，pH6.8 2.5 ml 甘油 2.0 ml 質(zhì)量濃度10%SDS 4.0ml 質(zhì)量濃度0.1%溴酚藍(lán) 0.5ml -巰基乙醇 1.0 ml 總體積10 ml 四、實(shí)驗(yàn)試劑6. 電極緩沖液，pH8.3。 Tris3g，甘氨酸14.4g，SDS

4、1.0g加重蒸水溶解定容至1000ml，4保管。7. 低分子量規(guī)范蛋白質(zhì)上海產(chǎn)。 開封后溶于200l重蒸水，加200l 2倍樣品緩沖液復(fù)原緩沖液，分裝20小管，-20保管。臨用前沸水浴35min，其相對(duì)分子量Mr如下： 兔磷酸化酶B 97 400 牛血潔白蛋白 66 200 兔肌動(dòng)蛋白 43 000 牛碳酸酐酶 31 000 胰蛋白酶抑制劑 20 100 雞蛋清溶菌酶 14 4008. 質(zhì)量濃度為10%過硫酸銨： 臨用前配制9. 染色液： 0.25g考馬斯亮藍(lán)R250，參與40ml甲醇，10ml冰醋酸,蒸餾水定容至100ml，過濾。10. 脫色液：50ml甲醇，75ml冰醋酸與875 ml重蒸

5、水混合。11. 待測(cè)蛋白樣品。 12. 1%瓊脂糖最好用電極液配13. TEMED 五、實(shí)驗(yàn)步驟1、洗凈晾干電泳槽、玻璃板、夾條、梳齒等。安裝后用1%瓊脂糖封玻璃板兩側(cè)及底部。2、分別膠的選擇和配置方法 1按照待分別蛋白質(zhì)的大致分子量選用不同濃度的膠。 2分別膠和濃縮膠的配制方法五、實(shí)驗(yàn)步驟3、分別膠的灌制 按照上表左邊操作。因參與TEMED后凝膠就開場(chǎng)聚合，故應(yīng)立刻混勻混合液，然后用滴管汲取分別膠，在電泳槽的兩玻璃之間灌注，防止氣泡。留出梳齒的齒高加1cm空間以便灌注濃縮膠。用滴管小心地在溶液上覆蓋一層重蒸水，將電泳槽垂直靜置于室溫下約4060min，待分別膠聚合完全后，除去覆蓋的重蒸水。4

6、、濃縮膠的灌制 等分別膠聚合后配制 按照上表右邊操作?；靹蚝蠊嘧⒃诜謩e膠上。小心插入梳齒，防止混入氣泡，將電泳槽垂直靜置于室溫下至濃縮膠完全聚合約40min。5、樣品的制備 1規(guī)范蛋白樣品的制備 樣品約5-10g，最好離心取上清加樣 取分裝好的20l低相對(duì)分子質(zhì)量規(guī)范蛋白質(zhì)，放入沸水浴中加熱35min，取出冷卻。 2待測(cè)樣品的制備 同規(guī)范蛋白質(zhì)樣品處置6、 電泳 1待濃縮膠完全聚合后，標(biāo)志好加樣孔位置，將電泳槽注滿電極緩沖液，小心拔出梳齒，用電極緩沖液沖洗加樣孔數(shù)次。 2用微量注射器按次序向加樣孔內(nèi)加樣。 3接上電泳儀，上電極接電源負(fù)極，下極接正極。翻開電源，調(diào)理電流至2030mA并堅(jiān)持電流強(qiáng)度恒定。待藍(lán)色的溴酚藍(lán)條帶遷移至距凝膠下端約1cm時(shí)，停頓電泳。 五、實(shí)驗(yàn)步驟7、 染色與脫色 小心將膠取出，置于一大培育皿中。加染色液染色30min，傾出染色液，參與脫色液，數(shù)小時(shí)改換一次脫色液，直至背景明晰。8、相對(duì)分子量的計(jì)算 用直尺分別量出規(guī)范蛋白質(zhì)、待測(cè)蛋白質(zhì)區(qū)帶中心以及溴酚藍(lán)前沿距分別膠頂端的間隔，按下式計(jì)算相對(duì)遷移率R： 相對(duì)遷移率