微生物檢驗第九章分枝放線菌

1、分枝桿菌放線菌諾卡菌共四十一頁Mycobacterium是一類細(xì)長略帶彎曲的桿菌(gnjn)，含有分枝菌酸，有分枝生長的趨勢而得名。具有抗酸性，故又稱抗酸桿菌(acid-fast bacillus)。人結(jié)核(jih)分枝桿菌牛分枝桿菌非洲分枝桿菌共四十一頁第一節(jié) 結(jié)核(jih)分枝桿菌共四十一頁莢膜： CR3結(jié)合、降解大分子物質(zhì)、保護(hù)、 抑制溶酶體融合脂質(zhì)： 索狀因子、磷脂、硫酸腦苷脂、蠟質(zhì)D蛋白質(zhì): 超敏反應(yīng)、結(jié)核結(jié)節(jié)的形成傳播途徑：呼吸道、消化道、損傷(snshng)的皮膚疾?。憾喾N臟器的結(jié)核病，肺結(jié)核最為多見。共四十一頁免疫性： 高感染率，低發(fā)病率。 抗體無保護(hù)作用(zuyng) 帶菌免

2、疫 細(xì)胞免疫 細(xì)長略帶彎曲的桿菌，抗酸染色(rns)后結(jié)核分枝桿菌呈紅色，背景呈藍(lán)色。菌體外有莢膜。共四十一頁專性需氧改良羅氏培養(yǎng)基生長緩慢表面干燥(gnzo)、不透明的菜花樣粗糙型菌落液體培養(yǎng)時生成菌膜共四十一頁抵抗力較強。耐干燥，在干燥的痰內(nèi)生存68個月，對化學(xué)消毒劑的抵抗力較強，在3HCl或6H2SO4中不被殺死，對濕熱敏感(mngn),在7075乙醇中數(shù)分鐘即被殺死。共四十一頁結(jié)核(jih)分枝桿菌不發(fā)酵糖類，有毒株中性紅試驗均陽性，無毒株則為陰性，并失去索狀生長現(xiàn)象。H2O2煙酸硝酸鹽人型結(jié)核分枝桿菌+牛型結(jié)核分枝桿菌+-共四十一頁（1）Direct Smear 2.Morpholo

3、gic Examinations 報告標(biāo)準(zhǔn)-全視野未找到抗酸菌1+100個視野發(fā)現(xiàn)39個2+100個視野發(fā)現(xiàn)1099個3+每個視野發(fā)現(xiàn)19個4+每個視野發(fā)現(xiàn)10個以上共四十一頁（2）濃縮集菌涂片檢查法 如果直接涂片鏡檢不易(b y)檢出結(jié)核桿菌，應(yīng)采用濃縮集菌涂片檢查法，以提高結(jié)核桿菌的檢出率。將標(biāo)本離心，取沉淀涂片，或采用漂浮集菌法，集菌后標(biāo)本經(jīng)反復(fù)多次使涂層加厚，一般取34個接種環(huán)，干燥固定后染色鏡檢。共四十一頁3.核酸檢測 用PCR法快速診斷結(jié)核分枝桿菌感染,特異性與敏感性均大于95。.抗原檢測：用ELISA法檢測結(jié)核分枝桿菌抗原，可快速得知(d zh)是否感染結(jié)核分枝桿菌.抗PPDIg

4、G的檢測 用ELISA法檢測患者血清中抗PPDIgG，可作為活動性結(jié)核分枝桿菌感染的快速診斷方法，陽性率為8090。共四十一頁.分離(fnl)培養(yǎng) 專性需氧、羅氏培養(yǎng)基、8w前處理(chl)目的：去除雜菌，痰液均質(zhì)化。方法：挑取5ml痰液至已經(jīng)標(biāo)記的50ml離心試管中；加入等量的2% N-乙酰半胱氨酸-氫氧化鈉（NACL-NaOH）前處理液（去污染）；漩渦振蕩20秒；靜置15分鐘，切勿超過20分鐘；加入無菌PBS（PH6.8）至約50mL，蓋緊蓋子；離心3000r/min，15分鐘；倒掉上清液；添加1-3mlPBS（PH6.8）以中和PH至6.8.共四十一頁 無菌毛細(xì)管吸取消化后標(biāo)本0.1ml

5、，滴加于中性羅氏培養(yǎng)基，將接種過的斜面來回晃動，使菌液均勻鋪于斜面上，斜面朝上放37恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。每一標(biāo)本同時接種2支。接種后第一周每天觀察一次，此后每周觀察一次。陽性結(jié)果經(jīng)涂片(t pin)證實隨時報告。若7天內(nèi)報告陽性，則為快速生長菌，超過7日則為緩慢生長菌。陰性結(jié)果至8周報告。必要時可延長。 共四十一頁.鑒定 (1)PCR反向膜探針雜交ELISA法(PCR雜交梳) (2)DNA探針 (3)16s rRNA基因序列測定 (4)高效液相色譜(s p)(HPLC)檢測 共四十一頁.藥物敏感性試驗 將純培養(yǎng)物菌懸液，接種含各種濃度藥物的固體培養(yǎng)基上，同時(tngsh)做不含藥物的對照組。經(jīng)過培養(yǎng)

6、，含有藥物的培養(yǎng)基上菌落數(shù)目是對照組的75以上，則認(rèn)為該菌對該藥物濃度為完全耐藥，如無菌落生長則為敏感。共四十一頁四、免疫學(xué)診斷(zhndun)1、結(jié)核菌素試驗原理(yunl)：純蛋白衍生物(PPD)，是用三氯醋酸沉淀結(jié)核菌培養(yǎng)濾液后的純化物。注入皮內(nèi)后如受試者已感染結(jié)核，則結(jié)核菌素與致敏淋巴細(xì)胞特異性結(jié)合，形成遲發(fā)型超敏反應(yīng)性炎癥。共四十一頁 應(yīng)用： 選擇BCG接種對象(duxing)及測定接種效果，結(jié)核菌素反應(yīng)陰性者應(yīng)接種BCG； 結(jié)核菌素試驗對嬰幼兒可做診斷結(jié)核病之用； 在末接種BCG的人群中作結(jié)核分枝桿菌感染的流行病學(xué)調(diào)查； 可借用其測定腫瘤病人的細(xì)胞免疫功能。共四十一頁2、結(jié)核(ji

7、h)分枝桿菌抗原檢測3、結(jié)核分支桿菌抗體檢測4、全血干擾素釋放試驗 ESAT、CFP-10共四十一頁第二節(jié) 非典型分枝桿菌 指結(jié)核分枝桿菌和麻風(fēng)分枝桿菌以外的分枝桿菌。因具有抗酸性，故又稱非典型抗酸性菌。 廣泛分布于外環(huán)境和人及動物的機體中。已發(fā)現(xiàn)50種以上能引起人類疾病(jbng)，引起的肺部感染。共四十一頁特點(tdin)1、對人類的致病性比MTB低。2、機體免疫力低下時作為繼發(fā)性疾病發(fā)生。3、與結(jié)核(jih)分支桿菌發(fā)生混合感染4、對抗結(jié)核藥物天然耐藥光產(chǎn)色分枝桿菌暗產(chǎn)色分枝桿菌不產(chǎn)色分枝桿菌迅速生長分枝桿菌共四十一頁、光產(chǎn)色分枝桿菌 特點是在暗處不產(chǎn)生(chnshng)色素，光照1h后

8、能在48h內(nèi)，菌落轉(zhuǎn)為黃色或橘黃色。對人有致病性的是：1堪薩斯分枝桿菌廣泛分布于水和土壤中， 能引起肺內(nèi)外結(jié)核樣的病變。2海分枝桿菌為水中的腐生菌。通過皮膚微 小創(chuàng)口侵入，引起所謂的“游泳池肉芽腫”。3猿分枝桿菌先后從猿和人體分離出此菌。共四十一頁二、暗產(chǎn)色分枝桿菌有光或無光均能產(chǎn)生(chnshng)色素，呈黃色或橘黃色。對人有致病性的為：1瘰痢分枝桿菌 25-37均可生長，35最 為適宜，45則不能生長?？梢鹑肆馨徒Y(jié) 炎或肺部感染。2斯氏分枝桿菌 37時為暗產(chǎn)色，25 時 為光產(chǎn)色。本菌引起成人肺部的慢性感染。共四十一頁三、不產(chǎn)色分枝桿菌不能產(chǎn)生色素。對人有致病性的是： 1鳥-胞內(nèi)復(fù)合分枝

9、桿菌(MAC/MAIC) AIDS患 者易感染，對抗結(jié)核藥物不敏感或產(chǎn)生耐 藥。2潰瘍分枝桿菌通過創(chuàng)傷感染，四肢伸側(cè)形 成無痛性潰瘍，緩慢(hunmn)愈合或出現(xiàn)繼發(fā)感染。3蟾蜍分枝桿菌為蟾蜍肉芽腫的病原菌。多引 起老年男性的慢性肺部感染。共四十一頁四、迅速(xn s)生長分枝桿菌 在普通(ptng)培養(yǎng)基上生長速度快，生長溫度為25-45，對人有致病性的是：1偶發(fā)分枝桿菌可引起人局部或肺部感染， 對現(xiàn)有的抗結(jié)核藥物均有耐藥性。2龜分枝桿菌可引起人的軟組織病變及手 術(shù)后繼發(fā)感染，亦可引起肺部感染。共四十一頁第三節(jié) 麻風(fēng)(mfng)分枝桿菌 麻風(fēng)病的病原菌，麻風(fēng)是一種慢性傳染病，主要表現(xiàn)為皮膚、

10、粘膜和神經(jīng)末梢的損害。晚期可侵犯深部組織和器官，形成肉芽腫。 根據(jù)臨床表現(xiàn)、免疫病理變化(binhu)和細(xì)菌檢查結(jié)果等將麻風(fēng)分為瘤型、結(jié)核樣型和界限類綜合征等三種病型。 共四十一頁 抗酸桿菌，呈束狀或團狀排列， G+無鞭毛(binmo)、莢膜和芽胞。麻風(fēng)分枝桿菌為典型的胞內(nèi)寄生菌，有該菌存在的細(xì)胞胞質(zhì)呈泡沫狀稱麻風(fēng)細(xì)胞用藥后細(xì)菌可斷裂為顆粒狀、鏈桿狀等，著色不均勻，叫做不完全菌。共四十一頁微生物學(xué)(wi shn w xu)檢驗顯微鏡檢查：在鏡檢時應(yīng)注意與結(jié)核分枝(fn zh)桿菌桿菌形態(tài)相鑒別麻風(fēng)分枝(fn zh)桿菌多呈束狀或成團聚集結(jié)核分枝(fn zh)桿菌多散在麻風(fēng)分枝(fn zh)桿菌

11、菌體粗直，兩端尖細(xì)，而結(jié)核分枝(fn zh)桿菌則細(xì)長略彎曲且有分枝(fn zh)現(xiàn)象活組織切片：抗酸染色及病理學(xué)檢查共四十一頁放線菌屬與諾卡菌屬共四十一頁主要致病菌衣氏放線菌（A. israelii)屬于(shy)正常菌群。在機體抵抗力減弱、口腔衛(wèi)生不良、拔牙或外傷時引起內(nèi)源性感染，導(dǎo)致軟組織的化膿性炎癥。若無繼發(fā)感染則大多呈慢性無痛性過程，并常伴有多發(fā)性瘺管形成，排出黃色硫磺樣顆粒，此即為放線菌病。最為常見的是面頸部感染。放線菌屬共四十一頁致病性與免疫性放線菌：正常菌群所致疾?。?.內(nèi)源性感染(gnrn)(放線菌病)：軟組織肉芽腫性炎癥(慢性,無痛,多發(fā)性瘺管,排出硫磺樣顆粒)2.齲齒和牙

12、周炎免疫性：細(xì)胞免疫共四十一頁G+、非抗酸性絲狀菌培養(yǎng)困難，厭氧或微需氧硫磺樣顆粒（菌落） 壓片或組織切片，顯微鏡下可見(kjin)顆粒呈菊花狀生物學(xué)性狀(xngzhung)共四十一頁硫磺(lihung)樣顆粒(sulfur granule)共四十一頁培養(yǎng)：厭氧或微需氧氣體環(huán)境：5 CO2營養(yǎng)(yngyng)培養(yǎng)基：腦心浸液瓊脂平板溫度與時間：37，2448h菌落:灰白色蜘蛛狀、不規(guī)則結(jié)節(jié)狀或臼齒狀菌落, 初分離(粗糙)生化特性:溶血(-) 葡萄糖(+) 甘露醇(+) 吲哚(-) 過氧化氫酶試驗(-)共四十一頁微生物學(xué)檢查主要：硫磺樣顆粒（膿汁,痰,分泌物） 有顆粒：壓片鏡檢:菊花狀排列的菌絲

13、 無顆粒：分枝菌絲，斷裂的菌細(xì)胞(xbo)必要：厭氧培養(yǎng)（緩慢，37培養(yǎng)2w以上）共四十一頁諾卡菌屬1.需氧2.含分枝菌酸3.分布：土壤中，多數(shù)：非致病菌4.致病菌： 星形諾卡菌（N. asteroides） 巴西(b x)諾卡菌（N. brasiliensis） 豚鼠諾卡菌（N. caviae）共四十一頁生物學(xué)性狀(xngzhung)形態(tài)：與以色列放線菌相似 革蘭染色：陽性 抗酸染色：陽性 脫色時間延長 陰性(與TB區(qū)別(qbi) 硫磺樣顆粒: 滲出液、痰或膿汁中有時可見淡黃、紅色或黑色小顆粒。 共四十一頁營養(yǎng)要求：不高（沙氏或普通瓊脂培養(yǎng)基）氣體環(huán)境：需氧，有氣生菌絲培養(yǎng)溫度：室溫或37生

14、長速度：緩慢生長，約1周色素：星形諾卡菌：黃色或深橙色，無白色菌絲 巴西諾卡菌：有白色菌絲菌絲斷裂(dun li)： 5天后鏡檢可見鏈球狀或鏈桿狀 （放線菌屬：24h開始)培養(yǎng)特征：菌落：有皺褶、顆粒狀 共四十一頁致病性侵入途徑：呼吸道或皮膚創(chuàng)傷所致疾?。褐Z卡菌病（nocardiosis） 外源性感染(gnrn) 化膿性感染 肺部：肺炎、肺膿腫、肺空洞 腦部：腦膿腫、腦膜炎 其他：腎、肝、脾、心包等 （慢性肉芽腫，瘺管） 好發(fā)于免疫缺陷患者共四十一頁微生物學(xué)(wi shn w xu)檢查 1.硫磺樣顆粒壓片 2.取痰、腦脊液、膿汁： 涂片 革蘭染色及抗酸染色 3.分離(fnl)培養(yǎng)：沙保弱或普通瓊脂培養(yǎng)基 4.生化試驗共四十一頁共四十一頁內(nèi)容摘要分枝桿菌放線菌諾卡菌。分枝桿菌放線菌諾卡菌。加入等量的2% N-乙酰半胱氨酸-氫氧化鈉（NACL-NaOH）前處理液（去污染）。靜置15分鐘，切勿超過20分鐘。因具有抗酸性，