發(fā)酵工程概述課件

1、第二章 發(fā)酵工程基本原理第一節(jié) 發(fā)酵工程概述第二節(jié) 發(fā)酵罐及發(fā)酵工程應(yīng)用實(shí)例第一節(jié) 發(fā)酵工程概述Ferment the engineering to say all一、發(fā)酵四、發(fā)酵工程的基本工序二、培養(yǎng)基二、影響微生物生長(zhǎng)發(fā)育的因素一、發(fā)酵1.什么是發(fā)酵 發(fā)酵(fermentation)最初是指，用酵母作用于谷物或果汁，進(jìn)行酒精發(fā)酵并產(chǎn)生 CO2 的現(xiàn)象。發(fā)酵是人類較早接觸的一種生物化學(xué)反應(yīng)。 例如：C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2 + 2ATP (放出能量:118 kJ/mol)酒化酶發(fā)酵(葡萄糖) 此過(guò)程是微生物在無(wú)氧狀況下的呼吸過(guò)程，是微生物獲取能量的一種形式。 在細(xì)胞漿內(nèi)所

2、發(fā)生的，由葡萄糖直接分解為丙酮酸的過(guò)程。 目前，人們把借助微生物在有氧或無(wú)氧條件下的生命活動(dòng)來(lái)制備微生物或其代謝產(chǎn)物的過(guò)程，統(tǒng)稱為發(fā)酵。 例如：黃青霉素 有氧發(fā)酵 青霉素北京棒桿菌 EMP酵解 丙酮酸Embden-Meyerhof-Parnus草酰乙酸 谷氨酸三羧酸循環(huán)谷氨酸脫氫酶2.什么是發(fā)酵工程 所謂發(fā)酵工程是指，采用現(xiàn)代工程技術(shù)手段，利用微生物生命活動(dòng)的某些特定功能，為人類生產(chǎn)有用的產(chǎn)品，或直接把微生物應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程的一種生物技術(shù)。 發(fā)酵工程的內(nèi)容包括菌種的選育、培養(yǎng)基的配制、滅菌、擴(kuò)大培養(yǎng)和接種、發(fā)酵過(guò)程和產(chǎn)品的分離提純等方面。 例如：北京棒桿菌擴(kuò)大培養(yǎng)發(fā)酵菌種過(guò)濾發(fā)酵液(糖化液培

3、養(yǎng)基)(預(yù)處理)提取、分離濃縮、純化干燥產(chǎn)品(L-谷氨酸)3.什么是微生物 微生物是一些個(gè)體微小、構(gòu)造簡(jiǎn)單的低等生物，其體形一般在0.1毫米以下，肉眼看不見(jiàn)或難以看清的微小生物的總稱。 目前知道的最小的微生物是病毒。流感病毒H1N型流感病毒酵母菌4.微生物的特點(diǎn) 微生物的個(gè)體都極為微小，一般用微米(10-6 m)或納米(10-9 m)作單位。由于其個(gè)體微小，必然導(dǎo)致其比表面非常大。（如：最普遍的桿菌其平均長(zhǎng)度僅為2m） 體積小、比表面大比表面積 = (1/m)表面積體積高倍顯微鏡下的大腸桿菌（1-3m） 微生物這種體積小、比表面積大，有利于其與周圍環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)、能量和信息交換。實(shí)際上，微生物的

4、其它屬性都和此特點(diǎn)有著密切關(guān)系。 微生物的比表面大，有利于促進(jìn)其參與生物化學(xué)反應(yīng)。如：微生物的發(fā)酵。種類多、分布廣 目前已發(fā)現(xiàn)的微生物在10萬(wàn)種以上。不同種類的微生物具有不同的代謝方式，能分解各式各樣的有機(jī)物和無(wú)機(jī)物。凡是動(dòng)、植物能利用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，微生物一概可以利用；而大量動(dòng)、植物所不能利用、甚至是劇毒物質(zhì)，微生物照樣可以很好地利用。 例如：廢水生化處理就是利用微生物各取所需，共同作用于廢水中的毒性物質(zhì)，使其降解而達(dá)到防治公害的目的；發(fā)酵工業(yè)就是利用不同的微生物在生化過(guò)程中累積的代謝產(chǎn)物，生產(chǎn)各種發(fā)酵產(chǎn)品。 由于微生物的食譜極廣，生長(zhǎng)要求不高，生長(zhǎng)繁殖速度極快，使得其在自然界分布極廣。這為生物

5、化工就地取材提供了方便。漿染廠廢水生化處理生長(zhǎng)旺、繁殖快 在生物界中，微生物具有極高的繁殖速度，其中以二均分裂方式繁殖的細(xì)菌尤為突出。 例如：大腸桿菌在 37下，每 18mit 分裂一次，每天要分裂 80 次之多；1個(gè)大腸桿菌經(jīng) 48h 后，可產(chǎn)生2.21043 個(gè)后代。 乳酸菌在 25下，每 38mit 分裂一次，每天要分裂 38 次；1個(gè)乳酸菌 48h 后，可產(chǎn)生 2.71011 個(gè)后代。 微生物的這一特點(diǎn)在發(fā)酵工業(yè)上有著重要的實(shí)踐意義，主要體現(xiàn)在生產(chǎn)周期短、效率高。適應(yīng)強(qiáng)、易變異 微生物對(duì)環(huán)境條件尤其是惡劣極端環(huán)境有著驚人的適應(yīng)能力，堪稱生物界之最。例如：1982年報(bào)導(dǎo)的嗜酸熱硫球菌屬(

6、Sulfosphaerellus)，最適生長(zhǎng)溫度為 70。 味精生產(chǎn)設(shè)備 由于微生物的個(gè)體一般都是單細(xì)胞或接近于單細(xì)胞，利用物理或化學(xué)人工誘變處理，容易使它們的遺傳性質(zhì)發(fā)生異變，從而改變微生物的代謝途徑，產(chǎn)生新的菌種。 例如：生產(chǎn)味精的谷氨酸棒桿菌經(jīng)過(guò)變異后，它的高絲氨酸缺陷型可生產(chǎn)賴氨酸，它的抗甲硫氨酸變異株可生產(chǎn)蛋氨酸。二、培養(yǎng)基 培養(yǎng)基（Medium）是微生物發(fā)酵過(guò)程所必需的養(yǎng)料，一般都含有碳源、氮源物質(zhì)、無(wú)機(jī)鹽(包括微量元素)以及維生素和水等。 從發(fā)酵生產(chǎn)用途的角度來(lái)看，培養(yǎng)基可分為孢子培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基三類。1.孢子培養(yǎng)基 孢子培養(yǎng)基又稱為斜面培養(yǎng)基，是為了使菌體生長(zhǎng)快，

7、產(chǎn)生孢子數(shù)量大、質(zhì)量好，不會(huì)引起菌種變異采用的培養(yǎng)基。 一般而言，孢子培養(yǎng)基的碳源和氮源不宜多，否則只長(zhǎng)菌絲，少長(zhǎng)或不長(zhǎng)孢子；另外，孢子培養(yǎng)基的無(wú)機(jī)鹽濃度應(yīng)適當(dāng)控制，否則會(huì)影響孢子的顏色和孢子的量。孢子培養(yǎng)車間2.種子培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基是供孢子發(fā)芽、生長(zhǎng)和大量繁殖菌絲體，并使菌體長(zhǎng)得粗壯，成為活力強(qiáng)的“種子”的培養(yǎng)基。 種子培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分要求比較豐富和完全，氮源和維生素的含量也要高些，但總濃度以略稀薄為好，這樣可達(dá)到較高的溶解氧，供大量菌體生長(zhǎng)繁殖。此外，種子培養(yǎng)基還需考慮在微生物代謝過(guò)程中能維持穩(wěn)定的pH值。青霉菌種子培養(yǎng)車間3.發(fā)酵培養(yǎng)基 發(fā)酵培養(yǎng)基是使接種的菌絲生長(zhǎng)并能高效表達(dá)，獲得高

8、產(chǎn)量發(fā)酵產(chǎn)物，同時(shí)組分盡可能單一的培養(yǎng)基。 發(fā)酵培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分與種子培養(yǎng)同樣，要求比較豐富和完全，有利于產(chǎn)物的合成。 此外應(yīng)注意，在發(fā)酵過(guò)程中，培養(yǎng)基不宜一次性大量、快速加入碳源和氮源；在產(chǎn)物分泌期間應(yīng)維持pH值的穩(wěn)定。葡萄酒發(fā)酵車間三、影響微生物生長(zhǎng)發(fā)育的因素 微生物在生命活動(dòng)中，與周圍環(huán)境有著密切的聯(lián)系。除了培養(yǎng)基的組成外，溫度、pH 值、通氣等因素均影響著微生物的生長(zhǎng)與發(fā)育。 微生物的生長(zhǎng)實(shí)際上是生物體的一系列生物化學(xué)反應(yīng)、酶反應(yīng)的有機(jī)組合，溫度是這些反應(yīng)必需的條件。 根據(jù)微生物生長(zhǎng)的適宜溫度范圍，一般可將其大致分為低溫菌、中溫菌和高溫菌三類。1.溫度 種類 最適溫度/ 存在環(huán)境 低溫

9、菌 1020 水、冷藏物 中溫菌 2040 大多數(shù)環(huán)境 高溫菌 5075 土壤、溫泉、堆肥2. pH值 微生物的生長(zhǎng)需要在一定的 pH 值環(huán)境下才可正常生長(zhǎng)、繁殖。如果pH值不適，不但妨礙菌體的正常生長(zhǎng)，還會(huì)改變微生物的代謝途徑及產(chǎn)物的性質(zhì)。例如：黑曲霉檸檬酸pH = 2-2.5pH = 2.6-6.5菌體生長(zhǎng)、繁殖草酸pH = 7丙酮丁醇梭菌pH = 5.57.0菌體生長(zhǎng)、繁殖pH = 4.35.3丙酮丁醇發(fā)酵 環(huán)境的通氣程度對(duì)微生物的生長(zhǎng)影響很大。按照微生物對(duì)氧氣的需求不同，可將其大致分為好氧性微生物、厭氧性微生物及兼性微生物三類。3.通氣好氧性微生物 好氧性微生物（好氣微生物）在生長(zhǎng)繁殖

10、過(guò)程中，需要不斷攝取周圍環(huán)境中的氧。微生物在發(fā)酵過(guò)程中，能利用的氧必須是溶解于培養(yǎng)基中的溶解氧（DO）。顯微鏡下的黑曲霉菌 例如：大多數(shù)細(xì)菌屬于好氧性微生物；硫桿菌屬(Thiobacillus)中的氧化亞鐵硫桿菌(Thio. ferroxidans) 屬于好氧性固氮微生物。厭氧性微生物 厭氧性微生物不需要分子態(tài)氧，分子態(tài)氧對(duì)其有毒害作用。如：丙酮丁醇梭菌。兼性微生物 兼性微生物既能在有氧條件下生長(zhǎng)，又能在無(wú)氧條件下生活。如：酵母菌，在有氧條件下迅速生長(zhǎng)繁殖，在無(wú)氧條件下則進(jìn)行發(fā)酵，并產(chǎn)生大量乙醇。顯微鏡下的酵母菌問(wèn)題討論與練習(xí)61 什么是發(fā)酵？什么是發(fā)酵工程？63 影響微生物生長(zhǎng)發(fā)育的因素有哪

11、些？62 微生物的特點(diǎn)是什么？資料卡片61（略） 發(fā)酵(fermentation)是指，借助微生物在有氧或無(wú)氧條件下的生命活動(dòng)來(lái)制備微生物或其代謝產(chǎn)物的過(guò)程。 發(fā)酵工程是指，采用現(xiàn)代工程技術(shù)手段，利用微生物生命活動(dòng)的某些特定功能，為人類生產(chǎn)有用的產(chǎn)品，或直接把微生物應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程的一種生物技術(shù)。 發(fā)酵工程的內(nèi)容包括菌種的選育、培養(yǎng)基的配制、滅菌、擴(kuò)大培養(yǎng)和接種、發(fā)酵過(guò)程和產(chǎn)品的分離提純等方面。 從工程的角度來(lái)看，微生物的主要特點(diǎn)有如下幾個(gè)方面：1.體積小、比表面大，有利于促進(jìn)其參與生物化學(xué)反應(yīng)。2.種類多、分布廣，為生物化工就地取材提供了方便。3.生長(zhǎng)旺、繁殖快，有利于提高生產(chǎn)效率。4.適

12、應(yīng)強(qiáng)、易變異，有助于新品種的培養(yǎng)。62（略）資料卡片63（略） 除了培養(yǎng)基的組成外，溫度、pH 值、通氣等因素均影響著微生物的生長(zhǎng)與發(fā)育。1.溫度微生物的生長(zhǎng)實(shí)際上是生物體的一系列生物化學(xué)反應(yīng)、酶反應(yīng)的有機(jī)組合，溫度是這些反應(yīng)必需的條件。2.pH 值微生物的生長(zhǎng)需要在一定的 pH 值環(huán)境下才可正常生長(zhǎng)、繁殖。如果pH 值不適，不但妨礙菌體的正常生長(zhǎng)，還會(huì)改變微生物的代謝途徑及產(chǎn)物的性質(zhì)。3.通氣環(huán)境的通氣程度對(duì)微生物的生長(zhǎng)影響很大。例如：酵母菌，在有氧條件下迅速生長(zhǎng)繁殖，在無(wú)氧條件下則進(jìn)行發(fā)酵，并產(chǎn)生大量乙醇。 因此，在發(fā)酵過(guò)程中，須按照微生物對(duì)氧氣的需求不同，控制好培養(yǎng)基中的溶解氧（DO值）

13、。四、發(fā)酵工程的基本工序 我們知道，發(fā)酵工程的內(nèi)容包括菌種的選育、培養(yǎng)基配制、滅菌、擴(kuò)大培養(yǎng)和接種、發(fā)酵過(guò)程和產(chǎn)品的分離提純等方面。 從工程學(xué)的角度來(lái)看，我們可將發(fā)酵工程可概括地分為菌種、發(fā)酵和提煉（包括廢水處理）等三個(gè)階段，這三個(gè)階段通常我們又將其稱為發(fā)酵工程的上游工程、中游（發(fā)酵）工程和下游工程。即：上游工程中游（發(fā)酵）工程下游工程原料產(chǎn)品1.發(fā)酵的上游工程 發(fā)酵的上游工程包括優(yōu)良種株的選育，最適發(fā)酵條件（pH、溫度、溶氧和營(yíng)養(yǎng)組成）的確定，營(yíng)養(yǎng)物的準(zhǔn)備等。 發(fā)酵的上游工程的基本工序可簡(jiǎn)單地表述為：菌種菌種選育孢子制備種子種子制備種子的擴(kuò)大培養(yǎng)菌種的選育 菌種的選育常見(jiàn)的有自然選育和誘變育

14、種兩種方法。自然選育菌種采樣增殖培養(yǎng)純種分離純種培養(yǎng)生產(chǎn)性能測(cè)定菌種野生菌種 不經(jīng)過(guò)人工處理，利用菌種的自然突變而進(jìn)行菌種篩選的過(guò)程叫做自然選育。自然選育是一種簡(jiǎn)單易行的選育方法，它可以達(dá)到純化菌種，防止菌種衰退、穩(wěn)定生產(chǎn)、提高產(chǎn)量的目的。但是自然選育的最大缺點(diǎn)是效率低、進(jìn)展慢。菌種自然選育基本步驟可表述為： 使培養(yǎng)物獲得單個(gè)菌落 測(cè)定代謝產(chǎn)物或其它目的性狀誘變選育 誘變選育是利用各種物理、化學(xué)因素，通過(guò)人工誘發(fā)的基因突變而進(jìn)行菌種篩選的過(guò)程。菌種誘變選育基本步驟可表述為：同步培養(yǎng)出發(fā)菌株使菌細(xì)胞處于相同或接近的生理狀態(tài)制備孢子懸液誘變處理化學(xué)誘變劑物理誘變劑得到基因突變的菌株平板分離挑取疑似

15、突變菌落突變體的篩選純種培養(yǎng)生產(chǎn)性能測(cè)定菌種通過(guò)多次篩選，確定目標(biāo)突變菌株純種培養(yǎng)問(wèn)題： 什么是化學(xué)誘變？什么是物料誘變？資料卡片一、化學(xué)誘變劑及其作用機(jī)制 引起突變的化學(xué)物質(zhì)稱為化學(xué)誘變劑。常見(jiàn)的變劑有烷化劑、核酸堿基類似物及其它類誘變劑。 烷化劑往往帶有一個(gè)或多個(gè)活潑的烷基，如烷基磺酸鹽、亞硝基烷基化合物等。烷化劑的作用機(jī)制是：通過(guò)烷基化，導(dǎo)致 DNA斷裂、缺失或修補(bǔ)。1.烷化劑2.核酸堿基類 核酸堿基類化學(xué)誘變劑具有與 DNA堿基類似的結(jié)構(gòu)。如，5-溴尿嘧啶、2-氨基嘌呤等。其作用機(jī)制是作為 DNA的成份而滲入到DNA分子中去，使DNA復(fù)制時(shí)發(fā)生配對(duì)錯(cuò)誤，從而引起有機(jī)體變異。3.亞硝酸

16、亞硝酸能使嘌呤或嘧啶脫氨，改變核酸結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，造成 DNA復(fù)制紊亂。亞硝酸還能造成DNA雙鏈間的交聯(lián)而引起遺傳效應(yīng)。資料卡片二、物理誘變 通過(guò)物理方法引起的突變稱為物理誘變。常見(jiàn)的物理誘變劑有紫外線，X射線，-射線，快中子，激光，微波，離子束等。 紫外輻射可以引起堿基轉(zhuǎn)換、顛換、移碼突變或缺失；激光通過(guò)光效應(yīng)、熱效應(yīng)和電磁效應(yīng)的綜合作用，能使生物的染色體斷裂或形成片斷；-射線可使脫氧核糖的堿基發(fā)生氧化或DNA分子的化學(xué)鍵斷裂、同時(shí)還能引起染色體畸變。 微波輻射屬于一種低能電磁輻射，具有較強(qiáng)生物效應(yīng)的頻率范圍在 300MHz300GHz，對(duì)生物體具有熱效應(yīng)和非熱效應(yīng)。其熱效應(yīng)能引起生物體局部溫度

17、上升，從而引起生理生化反應(yīng)；其非熱效應(yīng)能使生物體產(chǎn)生非溫度關(guān)聯(lián)的各種生理生化反應(yīng)。在這兩種效應(yīng)的綜合作用下,生物體會(huì)產(chǎn)生一系列突變效應(yīng)。種子的擴(kuò)大培養(yǎng) 種子的擴(kuò)大培養(yǎng)就是，為每次發(fā)酵罐的投料提供相當(dāng)數(shù)量的代謝旺盛的種子。菌種接種、培養(yǎng)休眠狀生產(chǎn)用種子接種、斜面活化扁瓶或搖瓶冷凍干燥管斜面菌種種子罐種子 將選育得到的菌種通過(guò)搖瓶、種子罐等逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，最終可獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種。實(shí)驗(yàn)室階段的種子培養(yǎng)生產(chǎn)車間階段的種子培養(yǎng)菌種的工藝要求 品種純正、生產(chǎn)能力高、遺傳性狀穩(wěn)定。菌種品質(zhì)淀粉 葡萄糖 酒精 + 二氧化碳淀粉酶酒化酶醋酸桿菌O2CH3COOH + CO2醋酸桿菌 菌種品種的純正與否，直

18、接影響著發(fā)酵產(chǎn)品的質(zhì)量與品質(zhì)。若菌種中含有有害雜菌，常會(huì)使我們得不到發(fā)酵目標(biāo)產(chǎn)品。 例如：釀酒 我們知道，遺傳與變異是生物的基本屬性。在發(fā)酵的上游工程中，對(duì)選育出來(lái)的菌種還需經(jīng)過(guò)多級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)。若菌種的遺傳性狀不穩(wěn)定，則會(huì)發(fā)生變異直接影響發(fā)酵生產(chǎn)。 例如：啤酒酵母常采用三級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，擴(kuò)大倍數(shù)為46倍。 種子各階段的制備，應(yīng)無(wú)其它微生物污染、種子生命力強(qiáng)。 若種子的制備受到其它微生物的污染，往往會(huì)使發(fā)酵得不到所需的目標(biāo)產(chǎn)品。種子制備病毒株種子制備 菌種保存應(yīng)采用冷凍干燥管或液氮管，使菌種經(jīng)存放后能保持菌種的存活和生產(chǎn)能力的穩(wěn)定性。 冷凍干燥保藏是一切生物樣品保藏的重要方法，特別適用于微生物菌種的保

19、藏。菌種保存菌種冷凍干燥保存 菌種經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的保存、長(zhǎng)期的使用或轉(zhuǎn)管次數(shù)過(guò)多后，其活力往往會(huì)下降。應(yīng)定期對(duì)菌種進(jìn)行分離復(fù)壯，以防菌種退化確保菌種的純正和生產(chǎn)能力的穩(wěn)定性。 常用的菌種復(fù)壯方法有“重新選育法”、“移植活化法”、“改變養(yǎng)分法”和“改善環(huán)境法”。菌種復(fù)壯 在發(fā)酵生產(chǎn)中，應(yīng)注意儲(chǔ)備生產(chǎn)能力相同而遺傳性狀不同的幾個(gè)備用菌種，以備生產(chǎn)菌種受噬菌體污染或其它異常情況時(shí)替換。菌種儲(chǔ)備蘋果醋發(fā)酵生產(chǎn)線資料卡片1.重新選育法 利用原有的菌株，通過(guò)重新選育得到菌種。2.移植活化法 當(dāng)菌種保存期久了，其活力會(huì)有一定程度的下降。此時(shí)，可將其進(jìn)行重新移植培養(yǎng)，維持其活力。3.改變養(yǎng)分法 有些菌類對(duì)培養(yǎng)基的

20、營(yíng)養(yǎng)成分，往往有喜新厭舊的現(xiàn)象，連續(xù)用同一營(yíng)養(yǎng)成分的培養(yǎng)基，會(huì)使該菌種生產(chǎn)力下降、退化。因此，隔一段時(shí)間后，通過(guò)改變其培養(yǎng)基的組成和比例，也能起到菌種復(fù)壯的作用。4.改善環(huán)境法 一個(gè)優(yōu)良的菌種，若傳代次數(shù)太多，或環(huán)境不好，也會(huì)引起衰退。此時(shí)只需通過(guò)改善環(huán)境對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)，也可起到菌種復(fù)壯的作用。 所謂中游工程主要指在最適發(fā)酵條件下，發(fā)酵罐中大量培養(yǎng)細(xì)胞和生產(chǎn)代謝產(chǎn)物的工藝技術(shù)。其主要工藝要求為：2.中游工程發(fā)酵 要求原材料質(zhì)量穩(wěn)定、品種純正。原材料最好選擇微生物發(fā)酵專用的工業(yè)級(jí)即可，試劑級(jí)原材料成本較高。材料質(zhì)量 在發(fā)酵起始及過(guò)程中，要求原材料、設(shè)備、空氣等須經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的滅菌處理。材料處理?xiàng)l件控制 在發(fā)酵過(guò)程中，應(yīng)按發(fā)酵的要求，嚴(yán)格控制發(fā)酵體系的溫度、pH值及溶解氧(DO值)等條件。資料卡片幾種微生物耐受和適合的pH值微生物類型 pH 值范圍 微生物例舉嗜酸微生物 2 4.0氧化硫硫桿菌、嗜酸熱硫化葉菌、隱蔽熱網(wǎng)菌耐酸微生物 3.5 6醋酸桿菌、乳酸桿菌嗜中性微生物 6 8多數(shù)微生物、根瘤菌、放線菌嗜堿微生物 11 12少數(shù)嗜鹽堿桿菌屬、外硫紅螺菌屬、某些芽孢桿菌 3.發(fā)酵的下游工程 發(fā)酵的下游工程是指，從發(fā)酵液中分離和