抗黃曲霉毒素M1抗體制備及檢測方法建立

1、抗黃曲霉毒素M1抗體制備及檢測要領創(chuàng)立【關鍵詞】黃曲霉毒素1；單克隆抗體；酶聯(lián)免疫吸附試驗摘要：目的制備針對黃曲霉毒素1的單克隆抗體并創(chuàng)立針對黃曲霉毒素1的間接競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測要領。要領利用B細胞雜交瘤技能，創(chuàng)立能排泄抗黃曲霉毒素1單克隆抗體的雜交瘤細胞株，制備抗黃曲霉毒素1單克隆抗體，創(chuàng)立間接競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測要領。效果研制出1株能特異性排泄抗黃曲霉毒素1單克隆抗體的雜交瘤細胞株，定名為2F2。該單克隆抗體的Ig亞類為IgG1，親和常數(shù)為2810-11l/L。該抗體與黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2和黃曲霉毒素2等布局雷同物有薄弱的交織反響，具有較

2、高的特異性。在此底子上創(chuàng)立了間接競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測要領。該要領的最低檢出濃度為007ng/l，校正曲線的線性范疇為0022ng/l，線性方程y=-04364x+02693(R2=09949)。要領的加標接納率為725%1313%。結論制備了具有高特異性和親和力的抗黃曲霉毒素1單克隆抗體，并創(chuàng)立了快速、敏捷的針對黃曲霉毒素1的酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測要領。關鍵詞：黃曲霉毒素1；單克隆抗體；酶聯(lián)免疫吸附試驗Keyrds：aflatxin1;nlnalantibdy;enzye-linkediunsrbetassay黃曲霉毒素1(aflatxin1,AF1)是動物攝入黃曲霉毒素B1(AFB1)后在

3、體內(nèi)經(jīng)羥基化代謝的產(chǎn)物，存在于動物體內(nèi)可食部門，如乳、肝、蛋類等，此中以乳最為常見，且乳與乳成品中的AF1在消費和貯藏期間相對不變，巴氏消毒難以粉碎1。AF1的急性毒性與AFB1大抵雷同，可引起實行動物產(chǎn)生腫瘤2，50g/(kgb)的AF1可致大鼠肝癌及結腸腺癌3，別的尚有AF1引起牙原性腫瘤的報道4。鑒于AF1對人類康健組成埋伏的威脅，在我國食用乳與乳成品者又多為嬰幼兒、老年人和體弱多病者，因此，必需對其含量舉行監(jiān)控，限定AF1在牛奶或乳成品中的污染程度，到達庇護消耗者康健的目的。因此，創(chuàng)立正確、輕便、快速、敏捷、接納率高、不需特別裝備和可在下層實行室開展的檢測闡發(fā)要領非常需要。本文旨在制備

4、抗黃曲霉毒素1單克隆抗體，并對抗體特性舉行判斷，為進一步研制具有我國自主知識產(chǎn)權的免疫學快速檢測試劑盒提供技能支持。1質(zhì)料與要領11質(zhì)料111東西2造就箱(美國Queue公司)；清潔事情臺(北京半導體裝備一廠)；生物倒置顯微鏡(日本歐林巴斯光學株式會社)；酶標闡發(fā)儀(瑞士SUNRISE公司)；電子闡發(fā)天平(瑞士ettler公司)；低溫高速離心機(德國Herle公司)；平凡離心機(北京醫(yī)用離心機廠)；電泳儀(美國BIRAD公司)；微量可調(diào)移液器(法國Gilsn公司)；細胞造就板(96孔(美國star公司)；24孔(美國Gib公司)；酶標板(96孔，美國rning公司)。112試劑黃曲霉毒素1，黃

5、曲霉毒素1-BSA偶聯(lián)物(AF1-BSA)、牛血明凈卵白(BSA)、抗體亞類測定試劑盒(Ig,IgG,IgA,IgD,IgG1,IgG2a,IgG2b,IgG3)、黃曲霉毒素B1(AflatxinB1)、黃曲霉毒素B2(AflatxinB2)、黃曲霉毒素G1(AflatxinG1)和黃曲霉毒素G2(AflatxinG2)(美國Siga公司)。RPI1640造就基，選擇性造就基，福氏佐劑(完全、不完全)、二甲基亞砜(DS)，3,3,5,5四甲基聯(lián)苯氨(TB)、吐溫20(Teen20)、聚乙二醇(PEG，4000)、青霉素、鏈霉素(美國Gib公司)；辣根過氧化物酶羊抗鼠IgG(北京中山試劑公司)；

6、30%H22(優(yōu)級純，北京化工場)；二甲基甲酰胺、過碘酸鈉、酸楚、硼氫化鈉、無水乙醇、乙醚、檸檬酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀、氯化鈉、氫氧化銨、硫酸銨、氫氧化鈉、無水碳酸鈉、碳酸氫鈉、乙酸鈉等，均為闡發(fā)純以上(北京化學試劑市肆)。113溶液體系參考文獻5制備。114細胞系與實行動物小鼠骨髓瘤細胞系Sp2/0由本室傳代，并經(jīng)8氮雜鳥嘌呤處置懲罰。雌性BALB/小鼠，體重1820g(軍事醫(yī)學科學院實行動物研究所動物繁育場)。12要領121免疫動物接納小劑量長周期的免疫方案。對68周齡的雌性BALB/小鼠，體重1820g，初次免疫用100g黃曲霉毒素1-小牛血明凈卵白(BSA)與等

7、量完全福氏佐劑混勻，腹腔注射。2周后，用50g黃曲霉毒素1-BSA與等量不完全福氏佐劑混勻后，腹腔注射。今后每隔2周用50g黃曲霉毒素1-BSA與等量不完全福氏佐劑混勻，腹腔注射。8周后脾內(nèi)免疫50g黃曲霉毒素1-BSA作為增強免疫，3d后取脾細胞舉行交融。122細胞交融免疫小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞(Sp2/0)以101混淆，用50%聚乙二醇(PEG)作交融劑。交融細胞懸于含20%小牛血清的選擇造就基內(nèi)，分種于加有BALB/小鼠腹腔排泄細胞作滋養(yǎng)層的96孔細胞造就板中，置5%2,37孵箱中造就，當鏡檢雜交瘤克隆生長達1/31/2視野時，取上清舉行篩眩123雜交瘤挑選及抗體檢測以黃曲霉毒素1-

8、BSA為包被抗原，用間接非競爭ELISA法挑選排泄抗黃曲霉毒素1抗體的細胞孔，用黃曲霉毒素1間接競爭按捺性ELISA法確證。以免疫小鼠的血清為陽性比較，以Sp2/0細胞造就的上清液為空缺比較，以細胞造就板中未長出克隆的細胞造就上清為陰性比較，陽性細胞孔的判斷尺度為(A試驗-A空缺)/(A比較-A空缺)21。124雜交瘤細胞克隆化接納造就瓶內(nèi)正確計數(shù)稀釋法8。當一連3次100%陽性，即可將雜交瘤細胞凍存于液氮罐中。125單克隆抗體的消費接納動物體內(nèi)誘生單克隆抗體的要領6。126單克隆抗體的純化接納飽和硫酸銨法對腹水舉行純化7。13單克隆抗體的判斷抗體的免疫球卵白種別及亞類判斷接納抗體亞類測定試劑

9、盒舉行測定?？贵wIgG含量接納二喹啉甲酸(BA)卵白測定試劑盒舉行測定?？贵w分子量接納十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)法8?？贵w滴度測定以黃曲霉毒素1-BSA為包被抗原，從110000開始將抗體舉行倍比稀釋，以Sp2/0細胞造就上清為陰性比較，用間接非競爭ELISA要領測定抗體滴度，以(A試驗-A空缺)/(A比較-A空缺)21的最大稀釋倍數(shù)為滴定盡頭?？贵w親和力的測定接納間接非競爭性ELISA法，即測定抗體的親和常數(shù)9?？贵w的特異性和抗體的敏捷度用間接競爭按捺性ELISA法舉行測定，參試毒素為黃曲霉毒素B1，黃曲霉毒素B2，黃曲霉毒素G1和黃曲霉毒素G2和黃曲霉毒素2。14樣品提取

10、根據(jù)國度尺度要領提炔10。15黃曲霉毒素1間接競爭按捺性酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測要領試驗條件的最正確組適用棋盤滴定法確定。(1)用黃曲霉毒素1-牛血明凈卵白毗連物(00625ng/l)包被酶標微孔板，每孔100l，4留宿；(2)酶標板參加差異濃度的黃曲霉毒素1尺度溶液或樣品提取液和單克隆抗體溶液的混淆液100l(該混淆液為毒素尺度溶液或樣品提取液與單克隆抗體溶液按11混淆，提早混淆好，4留宿)，371h；(3)酶標板參加辣根過氧化物酶標識表記標幟的羊抗鼠抗體，每孔100l，371h；(4)酶標板加底物溶液，每孔100l，3730in；(5)每孔參加停頓液50l，于450n處測定吸光度值(A)。(6

11、)盤算：黃曲霉毒素1含量(ng/g)=*V1*V2*X/(*V3)。式中：為酶標板上測得的黃曲霉毒素1濃度(ng/l)，根據(jù)尺度曲線求得；V1為樣品提取液的總體積(l)；V2為定容樣液的體積(l)；V3為取出的樣品液的體積(l)；X為樣品提取液的稀釋倍數(shù)；為樣品的重量(g)。2效果21單克隆抗體的制備用黃曲霉毒素1-BSA免疫BALB/小鼠得到了較好的免疫應答。細胞交融后，經(jīng)間接非競爭ELISA要領挑選，并用間接競爭ELISA要領確證，從中選擇出對黃曲霉毒素1毒素有強按捺而陽性比較孔較強的細胞株，經(jīng)34次亞克隆，到達3次100%陽性，創(chuàng)立了1株不變排泄抗黃曲霉毒素1單克隆抗體的雜交瘤細胞株，定

12、名為2F2。22單克隆抗體特性的判斷抗黃曲霉毒素1抗體亞類是IgG1，相對分子量是150KD，抗體的親和力常數(shù)是2810-11l/L?？贵w與黃曲霉毒素B1的交織反響率是155%，抗體與黃曲霉毒素G1的交織反響率是39%，抗體與黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G2、黃曲霉毒素2和牛血明凈卵白的交織反響率均1%。23黃曲霉毒素1尺度品校正曲線用20%甲醇-磷酸鹽緩沖液將黃曲霉毒素1配成差異濃度尺度利用液(0,001,002,005,010,020,050,100,200,500,1000ng/l)，將抗黃曲霉毒素1單克隆抗體根據(jù)1106稀釋，用間接競爭按捺性酶聯(lián)免疫吸附試驗法測得校正曲線，線性范疇是00

13、22ng/l，線性方程是y=-04364x+02693(R2=09949)。最低檢出濃度為007ng/l。24加標接納試驗從市場上購置鮮奶和奶粉，別離舉行05g/kg和10g/kg加標接納試驗。對鮮奶樣品的均勻加標接納率別離為(112596)%和(877198)%，對奶粉的加標接納率別離為(1197156)%和(1086147)%，對百般品的加標接納率范疇為725%1313%。3討論在本研究中所制備的抗黃曲霉毒素1單克隆抗體，對黃曲霉毒素1具有高敏捷度和高特異性，可用于創(chuàng)立檢測乳與乳成品中AF1污染程度的免疫學檢測要領，以期到達對種種奶成品開展大范圍觀察，相識我國奶和奶成品中黃曲霉毒素的污染程

14、度。關于抗體的特異性，本研究選擇了黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2、黃曲霉毒素2和牛血明凈卵白舉行交織反響。由于黃曲霉毒素在天然界中有很多衍生物，其布局極其相似，創(chuàng)立在多克隆抗體底子上的AF1檢測要領多與其他黃曲霉毒素產(chǎn)生交織反響，而使其應用代價低落11。本研究在對抗黃曲霉毒素1雜交瘤細胞株大量挑選的底子上，得到了1株能排泄抗AF1的雜交瘤細胞株2F2，用該細胞株消費的抗體僅與黃曲霉毒素B1和黃曲霉毒素G1有薄弱的交織反響，與其他黃曲霉毒素的衍生物和牛血明凈卵白無交織反響。由于黃曲霉毒素1是污染奶和奶成品的重要組分，因此，接納2F2抗體創(chuàng)立的ELISA要領可以確保

15、對黃曲霉毒素1具有高度的特異性，不會影響黃曲霉毒素1ELISA試劑盒的現(xiàn)實應用。本研究樂成地挑選出可以或許排泄抗黃曲霉毒素1的單克隆抗體雜交瘤細胞株，制備出對黃曲霉毒素1具有高親協(xié)力、高特異性的單克隆抗體，并創(chuàng)立了快速、敏捷的檢測鮮奶及奶粉中黃曲霉毒素1污染程度的酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測要領，為鮮奶及奶粉的快速篩檢提供了技能支持。參考文獻1DPHEish,ullenJ,HsiehLS,etal.anerriskspsedbyaflatxin1J.PrinessTakaatsuSyp，1985,16:57-65.2usuanV,staGB,TrifilettiR,etal.Funtinalipair

16、entfratKupfferellsinduedbyaflatxinBanditsetablitesJ.FES-Iunlgialedi-Irbilgy,1995,10(2):151-155.3YshizaaT,YaashitaA,LuY.FunisinurreneinrnfrhighandlriskareasfrhuanesphagealanerinhinaJ.ApplEnvirnirbil,1994,60(5):1626-1629.4SydenhaE,ThielPG,arasasF,etal.NaturalurrenefsefusariuytxinsinrnfrlandhighesphagealanerprevaleneareasfTranskei,SuthernAfriaJ.JAgriFdhe,1990,38(10)：1900-1903.5江濤，李鳳琴，王環(huán)宇,等.赭曲霉毒素A免疫學檢測要領的研究J.中國群眾衛(wèi)生,2022，20(5)：556-558.6馬世興.正確快速的細胞克隆化試驗研究J.單克隆抗體通訊，1993,9(2):70-72.7董志偉，王琰.抗體工程.2版，北京：北京醫(yī)科大學出書社，2002：185-187.9萬文徽.單克隆