生物化學教學課件：第14章 基因重組和基因工程

1、 基因重組和基因工程 Genetic Recombination and Genetic Engineering第14章DNA克隆、測序與重組技術的歷史1973年，Stanley Cohen等人首次獲得體外重組DNA的分子克隆1977年，Allan Maxam和Walter Gilbert的化學裂解DNA測序問世不久，Sanger 等的雙脫氧測序法20世紀90年代啟動人類基因組計劃(human genome project，HGP)重組DNA技術學(Recombinant DNA Technology)接合作用 (conjugation)轉化作用 (transformation)轉導作用 (t

2、ransduction)轉 座重組 (transposition)同源重組 (homologous recombination)位點特異的重組(site-specific recombination)第一節(jié)自然界DNA重組和基因轉移DNA Recombination and Gene Transfer in Nature發(fā)生在同源序列間的重組稱為同源重組(homologous recombination)，又稱基本重組（general recombination）。是最基本的DNA重組方式，通過鏈的斷裂和再連接，在兩個DNA分子同源序列間進行單鏈或雙鏈片段的交換。以E.coli的同源重組為例，

3、了解同源重組機制的Holliday模型。一、同源重組E.Coli的同源重組機制RecBCD復合物具有三種酶活性：核酸外切酶、核酸內(nèi)切酶、解螺旋酶Chi位點：序列為5GCTGGTGG3，是目前發(fā)現(xiàn)的主要重組熱點RecA酶：E.coli同源重組過程中最重要的酶，又稱為重組酶?？山Y合單鏈DNA，并將此DNA插入雙鏈DNA分子的同源區(qū)，完成DNA分子間單鏈交換的重組過程。Holliday模型的4個關鍵步驟： 兩個同源染色體DNA排列整齊；片段重組體(patch recombinant)拼接重組體(splice recombinant) 一或兩個DNA中的一條鏈斷裂、并與另一個DNA對應的鏈連接，形成H

4、olliday中間體；通過分支移動產(chǎn)生異源雙鏈DNA；Holliday中間體切開并修復，形成兩個雙鏈重組體DNA，分別為： 內(nèi)切酶 (recBCD)DNA侵擾(recA)分支遷移 (recA) 內(nèi)切酶(recBCD) DNA 連接酶535353535353535353535353535333535335535353Holiday中間體53535353Holiday中間體535353535535533335555333355553335555333355553333內(nèi)切酶(ruvC)內(nèi)切酶(ruvC) DNA連接酶 DNA連接酶拼接重組體片段重組體Holliday模型異源重組體的修復 異源雙鏈重

5、組體內(nèi)不配對片段的DNA修復二、細菌的基因轉移與重組（一）接合作用當細胞與細胞、或細菌通過菌毛相互接觸時，質粒DNA從一個細胞（細菌）轉移至另一細胞（細菌）的DNA轉移稱為接合作用(conjugation)。可接合質粒如 F 因子(F factor) 細菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子。質粒（二）轉化作用通過自動獲取或人為地供給外源DNA，使細胞或培養(yǎng)的受體細胞獲得新的遺傳表型，稱為轉化作用 (transformation)。例：溶菌時，裂解的DNA片段被另一細菌攝取。（三）轉導作用當病毒從被感染的（供體）細胞釋放出來、再次感染另一（供體）細胞時，發(fā)生在供體細胞與受體細胞之間的DNA轉移及基

6、因重組即為轉導作用(transduction)。噬菌體的生活史溶源菌生長途徑 (lysogenic pathway) “和平共處”溶菌生長途徑 (lysis pathway) “殺死宿主”三、位點特異重組(site-specific recombination)位點特異性重組發(fā)生在特殊序列對之間，這一重組型式最早在噬菌體的遺傳學研究中發(fā)現(xiàn)。噬菌體有兩種存在型式：裂解狀態(tài)和溶源狀態(tài)。兩種類型間的轉換通過位點特異性重組實現(xiàn)。溶源菌生長途徑 溶菌生長途徑 噬菌體的整合酶識別噬菌體和宿主染色體的特異靶位點發(fā)生選擇性整合；反轉錄病毒整合酶可特異地識別、整合反轉錄病毒cDNA的長末端重復序列(long t

7、erminal repeat, LTR)。 （一）噬菌體DNA的整合噬菌體DNA的整合與切除為了進入溶源狀態(tài)，游離的 DNA必須整合（intergrate）到細菌DNA中去；而為了從溶源狀態(tài)向裂解狀態(tài)轉化，原噬菌體DNA則必須從細菌染色體DNA上切除（excise）。整合和切除均通過細菌DNA 和DNA上特定位點附著點（attachment site，att）之間的重組而實現(xiàn)。細菌染色體上的附著點（att）稱為attB ，含有B、O、和B三個序列（BOB），長度約25bp。 attB突變后可以阻止DNA的整合。O 序列15bp噬菌體的附著位點稱attP，由P、O和P 三個序列組成，長度約為24

8、0bp。其中O 序列是attB 和attP 所共有的，序列完全一致，長度15bp, 稱核心序列（core sequence）。是位點特異性重組發(fā)生的地方。O 序列Integration Host Factor2. -DNA從E.coli的切離：噬菌體的整合和切除1. -DNA對E.coli的整合：BOPPOB（原噬菌體）BOB（細菌）+POP （噬菌體）IntIHFBOPPOB（原噬菌體）BOB（細菌）+POP （噬菌體）Int，XisIHF整合過程 整合后的附著位點為 attL（BOP） attR（POB） 整合位點-attB、attP 切除位點-attL、attR 整合過程需要Int 和I

9、HF共同作用切除過程還需要Xis蛋白，Xis 通常抑制整合。 調(diào)節(jié)和啟動轉錄 LTR gag pol env src LTR 長末端重復序列癌基因正常的病毒基因產(chǎn)生病毒表面糖蛋白產(chǎn)生逆轉錄酶和整合酶 產(chǎn)生病毒 垮膜蛋白反轉錄病毒基因組結構產(chǎn)生p60src蛋白質，靶蛋白磷酸化（二）細菌的特異位點重組沙門菌H片段倒位決定鞭毛相轉變。鼠傷寒沙門氏菌有兩相:相：由H1基因表達產(chǎn)生H1鞭毛蛋白相：由H2基因表達產(chǎn)生H2鞭毛蛋白兩相細菌在進行細胞分裂時，以大約1/1000的頻率產(chǎn)生另一相的后代，此過程稱為相變（phase variation）。相變的實質是Hl 或H2基因選擇性表達的結果 H2鞭毛素 阻遏

10、蛋白Hin重組酶轉位片段hinH2IH1 H1鞭毛素hinH2IDNA啟動序列H1啟動序列沙門菌H片段倒位決定鞭毛相轉變H抗原刺激機體后主要產(chǎn)生IgG，H抗原分析是沙門氏菌定型的依據(jù)。自然界中存在著數(shù)以百萬計的各種抗原物質，若一種抗體分子特異性識別和結合一種抗原，體內(nèi)如何產(chǎn)生這么多種類的抗體分子呢？抗體產(chǎn)生特異性免疫應答的重要分子機制就是免疫球蛋白（IG）的基因重排。 免疫球蛋白的基因重排（三）免疫球蛋白基因的重排免疫球蛋白(Ig)，由兩條輕鏈(L鏈)和兩條重鏈(H鏈)組成，分別由三個獨立的基因族編碼，其中兩個編碼輕鏈(和)，一個編碼重鏈。 輕鏈的基因片段：重鏈的基因片段：L V J C L

11、V D J C 免疫球蛋白（Ig）的結構Ig由兩條輕鏈(L鏈)和兩條重鏈(H鏈)組成，分別由三個獨立的基因族編碼，其中兩個編碼輕鏈(和)，一個編碼重鏈。人免疫球蛋白染色體定位編碼的肽鏈基因符號染色體定位基因片段及排列組合數(shù)H鏈IgH14q32.3V65-D30-J6-C96530611700鏈Ig 2p11-12V50-J5-C505250鏈Ig 22q11.2V50-100-(J-C)4504200重鏈(IgH)基因的V-D-J重排和輕鏈(IgL)基因的V-J重排均發(fā)生在特異位點上。在V片段的下游，J片段的上游以及D片段的兩側存在保守的重組信號序列(recombination signal

12、sequence, RSS)。CACAGTG(NNNNNNN)ACAAAAACCGTGTCAC(NNNNNNN)TGTTTTTGGN:12/23bp7bp9bp切割位點重組酶識別位點此重排的重組酶共有兩個，分別由基因rag1、2 (recombination activating gene)編碼。RAG1：識別9bp信號序列。RAG2：結合于RAG1，并在7bp序列處切割。單鏈切開RAG1RAG2免疫球蛋白基因重排過程V片段J片段RSS間插DNARSSOHOHV片段J片段分子內(nèi)轉酯反應V片段J片段單鏈切開、轉移核苷酸修復、連接V片段J片段CACAGTG(NNNNNNN)ACAAAAACCGTG

13、TCAC(NNNNNNN)TGTTTTTGGN:12/23bp7bp9bp切割位點重組酶識別位點基因拼接過程中的轉酯反應7nt切割位點9nt重組酶識別位點H重鏈L1 V1 Ln Vn D1-12 J1-4 CCL1 V1 LnVn J1-4 C 輕鏈轉錄、加工AAA翻譯新生多肽鏈成熟多肽鏈L1V1 LnVn D2J1 C CL1V1 D2J1 C CL1V1 D2J1 CL1 V1J1 C AAAL1V1J1C 組合成Ig分子小鼠Ig胚系基因片段和重鏈、輕鏈配對的多樣性 基因片段數(shù) 可變區(qū)基因 經(jīng)重排和隨機配對后 多肽鏈 VJ 重組方式 推算的多樣性數(shù)目 重鏈 1000124 V-D-J 4.

14、8104 輕鏈 250 4 V-J 1.0103 概念：由插入序列和轉座子介導的基因移位或重排稱為轉座(transposition)。指DNA從一個位置移動到基因組上另一個位置。這些可移動的DNA序列包括：（一）插入序列(insertion sequences, IS) （二）轉座子（ transposons ）四、轉座重組 插入序列(insertion sequences, IS)組成：IRTransposase GeneIR（一）插入序列轉座二個分離的反向重復(inverted repeats, IR)序列特有的正向重復序列一個轉座酶（transposase)編碼基因保守性轉座(conse

15、rvative transposition) 復制性轉座(duplicative transposition)保守性轉座(conservative transposition)復制性轉座(duplicative transposition)插入序列的復制性轉座轉座子(transposons) 可從一個染色體位點轉移到另一位點的分散重復序列。IRIRTransposase Gene有用基因（二）轉座子轉座轉座子組成： 反向重復序列轉座酶編碼基因抗生素抗性等有用的基因Barbara McClintock (1902-1992), Biologist.Nobel Prize for discover

16、ing jumping genes in corn-then in bacteria and humans. Cold Spring Harbor Laboratory. 細菌的可流動性元件A插入序列：轉座酶編碼基因兩側連接反向末端重復序列(箭頭所示)B轉座子Tn3：含有轉座酶、-內(nèi)酰胺酶及阻遏蛋白編碼基因C轉座子Tn10：含四環(huán)素抗性基因及兩個相同的插入序列IS10L由轉座子介導的轉座相關概念 DNA克隆 工具酶 目的基因 基因載體基本原理 重組DNA技術與醫(yī)學的關系主要內(nèi)容：第二節(jié) DNA重組技術DNA Recombination Technique一、重組DNA技術相關概念 克隆(clo

17、ne):來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。獲取同一拷貝的過程稱為克隆化(cloning)，即無性繁殖。（一） DNA克隆分子克?。杭毎寺。簞游锟寺。嚎寺〉牟煌瑢用鎽妹笇W的方法，在體外將各種來源的遺傳物質（同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）與載體DNA接合成一具有自我復制能力的DNA分子復制子(replicon)，繼而通過轉化或轉染宿主細胞，篩選出含有目的基因的轉化子細胞，再進行擴增提取獲得大量同一DNA分子，也稱基因克隆或重組DNA (recombinant DNA) 。 DNA克隆生物技術工程: 基因工程、蛋白質工程、酶工程、細胞工程等 目的： 分離獲得某一感興趣的

18、基因或DNA 獲得感興趣基因的表達產(chǎn)物（蛋白質）基因工程(genetic engineering) 實現(xiàn)基因克隆所用的方法及相關的工作稱基因工程，又稱重組DNA工藝學。（二）工具酶 限制性核酸內(nèi)切酶 DNA聚合酶 逆轉錄酶 T4DNA連接酶 堿性磷酸酶 末端轉移酶 Taq DNA聚合酶（1）定義：識別DNA的特異序列, 并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶，簡稱限制酶。限制性核酸內(nèi)切酶存在于細菌體內(nèi)，與細菌的甲基化酶構成限制修飾體系。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+限制性核酸內(nèi)切酶(restriction endonuclease, RE)分子手術刀（2）限制酶的

19、分類: 類、 類、類（3）限制酶的命名 EcoR E：代表細菌的屬名co：代表細菌的種名R：代表菌株 ：發(fā)現(xiàn)次序名稱屬名種名株名序號來源菌株EcoREcoREscherichia coli RY13Hind HIndHaemophilius influenzae RdHpa HpaHaemophilus parainfluenzae（4）限制酶的特點識別序列：回文結構 5-GAATTC-3 3-CTTAAG-5不同堿基個數(shù)的識別序列在基因組中的出現(xiàn)頻率：四：256bp六：4kb八：65kbBam HGTCCAGGCCTAGGATCC G+GGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTG

20、GACCTG+平端切口粘端切口切割方式來源不同的限制酶，但能識別和切割同一位點，這些酶稱同功異源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam HGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bst同功異源酶：有些限制性內(nèi)切酶雖然識別序列不完全相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同的粘性末端，稱為同尾酶。這兩個相同的粘性末端稱為配伍未端(compatible end)。Bam HBg l GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC G+ATCTAG GATCT A 同尾酶名稱 識別序列及切割位點名稱識別序列及切割點切割后產(chǎn)生突出末端:BamH

21、5GGATCC.3Bgl 5AGATCT.3EcoR 5GAATTC.3Hind 5AAGCTT.3 Hpa 5CCGG.3 Mbo 5GATC.3 Nde 5GATATG.3切割后產(chǎn)生3突出末端:Apa 5GGGCCC.3Hae 5PuGCGCPy.3Kpn 5GGTACC.3Pst 5CTGCAG.3Sph 5GCATGC.3切割后產(chǎn)生平末端:Alu 5AGCT.3EcoR 5GATATC.3Hae 5GGCC.3Pvu 5CAGCTG.3Sma 5CCCGGG.3 限制性內(nèi)切核酸酶（三）目的基因研究某個基因，或者要克隆某個基因用于生產(chǎn)大量DNA和蛋白質分子,首先都要把它從龐大的基因組中分

22、離出來。你所感興趣和想研究的基因，稱為目的基因?；蚪MDNA (genomic DNA)cDNA (complementary DNA)（四）基因載體 定義為攜帶目的基因，實現(xiàn)其無性繁殖或表達有意義的蛋白質所采用的一些DNA分子。 常用載體質粒DNA噬菌體DNA病毒DNA分子運輸車克隆載體(cloning vector)為使插入的外源DNA序列被擴增而特意設計的載體稱為克隆載體。表達載體(expression vector) 為使插入的外源DNA序列可轉錄翻譯成 多肽鏈而特意設計的載體稱為表達載體。載體的選擇標準：能自主復制；具有兩個以上的遺傳標記物，便于重組體的篩選和鑒定；有克隆位點（外源D

23、NA插入點），常具有多個單一酶切位點，稱為多克隆位點；分子量小，以容納較大的外源DNA。1.質粒 (plasmid)特點 能在宿主細胞內(nèi)獨立自主復制；帶有某些遺傳信息, 會賦予宿主細胞一些遺傳性狀。 大小適宜，拷貝數(shù)多。易于從一個細菌轉移到另一個細菌，即易轉化。有利于篩選。質粒上常帶有一個或兩三個抗藥基因。有限制性內(nèi)切酶的切口。 噬菌體DNA改造系統(tǒng) gt系列（插入型，適用cDNA克隆） EMBL系列（置換型，適用基因組克?。┦删w(phage) M13噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含lacZ基因） M13mp系列 pUC系列3.粘性質粒(cosmid) 酵母人工染色體 (yeast artifici

24、al chromosome, YAC) 細菌人工染色體 (bacterial artificial chromosome, BAC) 動物病毒DNA改造的載體 （如腺病毒，腺病毒相關病毒，逆轉錄病毒）其他克隆容量：質粒：10kb 噬菌體22kb M13噬菌體1kb 粘粒40-50kb YAC：0.5-2Mb二、重組DNA技術基本原理目的基因的獲取克隆載體的選擇和構建外源基因與載體的連接重組DNA導入受體菌重組體的篩選克隆基因的表達 基因工程的基本過程（一）目的基因的獲取化學合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列 。基因組DNA文庫(genomic DNA library)cD

25、NA文庫(cDNA library)聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR)化學合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列。組織或細胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分子的轉化菌限制性內(nèi)切酶受體菌基因組DNA文庫存在于轉化細胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合從基因組DNA文庫獲取目的基因限制酶切位點限制酶消化 除去中間片段cos LR coscos L左臂R cos右臂真核生物染色體DNA限制酶部分消化 外源DNA與載體DNA混合 連接反應 體外包裝 用重組噬菌體感染大腸桿菌 20 Kb DNA 片段 cos LR co

26、s20 Kb 外源 DNA 片段 基因文庫用隨機切割的真核生物染色體DNA片段構建基因文庫 mRNA cDNA 雙鏈cDNA 重組DNA分子 cDNA文庫 反轉錄酶 載體 受體菌 復制 從cDNA文庫獲取目的基因 逆轉錄酶A A A A T T T T AAAASI核酸酶 DNA聚合酶堿水解 T T T T利用聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR)獲 取目的基因（三）外源基因與載體的連接方式：(1)同一限制酶切位點連接 (2)不同限制酶切位點連接配伍末端連接非配伍末端連接粘性末端連接（二）克隆載體的選擇和構建目的不同，操作基因的性質不同，載體的選擇和改建方

27、法也不同。 Bam H切割反應 GGATCC CCTAGGT4 DNA連接酶15CGATCC GGCCTAG+目的基因用 Bam H切割載體DNA用Bam H切割重組體載體自連目的基因自連同一限制酶切位點連接不同限制酶切位點（非配伍末端）的連接Eco R切割位點Bg l切割位點+EcoR+ Bg l雙酶切Eco R+ Bg l雙酶切T4 DNA連接酶15C重組體配伍末端的連接情況和同一限制酶切位點連接相似。平端連接 限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端粘端補齊或切平形成的平端適用于：優(yōu)點：使用范圍廣缺點：連接效率較低 目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4 DNA連接酶15C重組體載體自連目的基因 自

28、連在末端轉移酶(terminal transferase) 的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進行粘端連接。同聚物加尾連接由平端加上新的酶切位點，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進行粘端連接。 人工接頭(linker)連接5335載體DNA5335目的基因限制酶或機械剪切限制酶 53 35 5 3 T(T)nT T(T)nT 35 5 3 353 A(A)nA A(A)nA 35-核酸外切酶-核酸外切酶末端轉移酶+ dATP末端轉移酶+ dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA連接酶15C重組體5人工接頭及其應用CCGAATTCG GGCT

29、TAAGC5-3-Eco REco REco REco R受體菌條件：安全宿主菌 限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)(competent) 導入方式：轉化 (transformation)轉染 (transfection)感染 (infection)（四）重組DNA導入受體菌宿主菌細胞經(jīng)適當?shù)睦砘幚?，處于最適于接受重組體的狀態(tài)，稱感受態(tài)細胞。比如大腸桿菌在低溫下處于CaCl2溶液中一段時間，其膜通透性增加處于感受態(tài)。E.Coli感受態(tài)細胞的制備1. 直接選擇法(1) 抗藥性標記選擇(2) 標志補救(marker rescue)(3) 分子雜交法原位雜交Southern印跡2. 免疫學方法如免疫化學

30、方法及酶免檢測分析等（五）重組體的篩選(插入失活法) 抗藥性標記選擇(2) 標志補救(marker rescue)組氨酸缺陷型大腸桿菌無組氨酸的培養(yǎng)基酵母咪唑甘油磷酸脫水酶基因促進組氨酸合成DNA重組體 乳糖操縱子的天然誘導物是乳糖 乳糖類似物異丙基-D -硫代半乳糖苷（IPTG） 有更強的誘導作用。 IPTG配合使用在基因工程可作藍白斑篩選。 LacZ基因編碼的-半乳糖苷酶 X-gal 藍色吲哚產(chǎn)物 藍白斑試驗（IPTG-Xgal 試驗）誘導物 Z Y X PO Z Y X PO乳糖標志補救（-半乳糖苷酶法）lacZAmN2H片段COOH片段lacZX-galLac Z藍色化合物X-gal互

31、補（藍白篩選）（LacZ基因 N端序列）插入片段（LacZ基因失活）LacZ基因 C端序列LacZ酶 Southern印跡（3）分子雜交法 原位雜交 當溶液中的DNA分子經(jīng)高溫或高pH處理后，DNA雙鏈分子變性產(chǎn)生兩條單鏈，如果將溫度逐漸下降或pH恢復到中性，單鏈會按照堿基互補配對的原則，重新形成氫鍵恢復到原來的雙鏈結構。如果兩條單鏈的來源不同，只要它們之間的堿基順序同源互補或者部分同源互補，在條件適宜時，就可以全部或部分復性分子雜交。99原位雜交技術 將標記探針與細胞或組織切片中的核酸進行雜交，進而檢測特異的DNA或RNA序列。 細胞原位雜交 組織切片原位雜交 DNA-DNA RNA-DNA

32、 三類雜交 RNA-RNA 優(yōu)點： 不需提取核酸，故可完整保持組織或細胞的形態(tài)，因而更能準確地反映組織細胞的功能狀態(tài)。以特異序列為探針鑒定rDNA在染色體上的分布 雞的肌球蛋白的克隆和檢出免疫學方法 重組DNA技術操作過程為： 小結分分離目的基因 切限制酶切目的基因與載體接拼接重組體 轉轉入受體細胞篩篩選重組體 重組DNA技術操作的主要步驟載體質粒噬菌體病毒目的基因（外源基因）基因組DNA cDNA人工合成PCR產(chǎn)物限制酶消化開環(huán)載體DNA目的基因連接酶重組體轉化體外包裝，轉染帶重組體的宿主篩選表型篩選酶切電泳鑒定菌落原位雜交表達體系的建立： 表達載體的構建 受體細胞的建立 表達產(chǎn)物的分離純化

33、（六）克隆基因的表達 標準：選擇標志 強啟動子 翻譯調(diào)控序列多接頭克隆位點 E.coli表達體系的不足：不宜表達真核基因組DNA；不能加工表達的真核蛋白質；表達的蛋白質常形成不溶性包涵體(inclusion body) ；很難表達大量可溶性蛋白。1. 原核表達體系 (E.coli表達體系最為常用)大鼠胰島素原cDNA的表達和分泌真核基因在原核系統(tǒng)表達的困難及其解決方法 將真核基因克隆到1個強大的原核promotor和SD的下游，使真核基因處于原核啟動子的控制之下，轉錄物由于原核SD能與核糖體rRNA結合，可在原核表達.這是克服1、2困難的好辦法。真核分離出mRNA并逆轉錄成cDNA，cDNA有

34、完整的編碼順序，但無內(nèi)含子。采用偽裝辦法：將真核基因插到原核基因某密碼之后，其翻譯產(chǎn)物N端有原核多肽，這樣表達的融合蛋白，可躲避細菌蛋白酶降解作用。1.細菌RNApol不能識別真核的promotor，故真核基因不能被該酶轉錄.2.從真核轉錄的mRNA缺乏SD序列,不能結合到細菌核糖體rRNA,因此不能被翻譯成蛋白.3.真核基因有內(nèi)含子,而原核細胞缺乏真核細胞轉錄后加工系統(tǒng),成熟的mRNA不能形成,不能表達真核蛋白 ;4.表達的真核蛋白在原核細胞中不穩(wěn)定,易被細菌蛋白酶降解. 優(yōu)點：可表達克隆的cDNA及真核基因組DNA 可適當修飾表達的蛋白質 表達產(chǎn)物分區(qū)域積累 缺點：操作技術難、費時、經(jīng)濟 轉染 將表達載體導入真核細胞的過程方法：磷酸鈣轉染 DEAE葡聚糖介導轉染 電穿孔 脂質體轉染 顯微注射 2.真核表達體系（酵母、昆蟲、哺乳類動物細胞）表達載體pFASTBACI 的物理圖譜一、疾病基因的發(fā)現(xiàn)與克隆根據(jù)基因定位克隆之,并研究其性質，而認識疾病的分子機制。 疾病基因發(fā)現(xiàn): 脆性X綜合征Kallmann綜合征第三節(jié)重組DNA技術與醫(yī)學的關