核算雜交技術(shù)聚合酶鏈反應(yīng)

1、核算雜交(zjio)技術(shù)共一百零二頁概述(i sh)分子生物學(xué)的重要方法之一使用特定標(biāo)記的已知核酸序列與待測核酸進(jìn)行特異性的雜交結(jié)合，形成雜交體，并利用相應(yīng)的顯示技術(shù)來檢測目標(biāo)(mbio)核酸的存在及其位置的分子生物學(xué)方法共一百零二頁基本原理共一百零二頁核酸(h sun)由許多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，為生命的最基本物質(zhì)之一。核酸廣泛存在于所有動(dòng)物、植物細(xì)胞、微生物內(nèi)、生物體內(nèi)核酸常與蛋白質(zhì)結(jié)合形成核蛋白。不同的核酸，其化學(xué)組成、核苷酸排列順序等不同。根據(jù)化學(xué)組成不同，核酸可分為核糖核酸，簡稱(jinchng)RNA；和脫氧核糖核酸，簡稱DNA。DNA是儲(chǔ)存、復(fù)制和傳遞遺傳信息的主要物質(zhì)

2、基礎(chǔ)，RNA在蛋白質(zhì)合成過程中起著重要作用，其中轉(zhuǎn)移核糖核酸，簡稱tRNA，起著攜帶和轉(zhuǎn)移活化氨基酸的作用；信使核糖核酸，簡稱mRNA，是合成蛋白質(zhì)的模板；核糖體的核糖核酸，簡稱rRNA，是細(xì)胞合成蛋白質(zhì)的主要場所。共一百零二頁核酸(h sun)的結(jié)構(gòu)與特征核酸的結(jié)構(gòu)一級(jí)結(jié)構(gòu)：核苷酸以3，5磷酸二酯鍵構(gòu)成(guchng)無分支結(jié)構(gòu)的線性分子 二級(jí)結(jié)構(gòu)：雙螺旋結(jié)構(gòu) 或局部雙鏈三級(jí)結(jié)構(gòu)：超螺旋結(jié)構(gòu) 四級(jí)結(jié)構(gòu)：DNA與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物 共一百零二頁核算的結(jié)構(gòu)(jigu)與特征核酸的特性核酸的變性作用(zuyng) 爆發(fā)式 Tm值核酸的復(fù)性作用 驟然冷卻 緩慢冷卻共一百零二頁核酸(h sun)的雜交在

3、適宜的條件下，將不同來源的DNA放在試管里，經(jīng)熱變形后，慢慢冷卻，讓其復(fù)性。若這些異源DNA之間在某些區(qū)域有相同的序列，則可以通過互補(bǔ)堿基多之間非共價(jià)鍵（氫鍵）的作用，形成穩(wěn)定的雙鏈區(qū)，即復(fù)性形成雜交DNA探針（probe）：利用標(biāo)記分子對(duì)其它分子的識(shí)別性而實(shí)現(xiàn)對(duì)后者進(jìn)行檢測的一種技術(shù)，通常(tngchng)把標(biāo)記的分子叫探針探針技術(shù)與核酸分子雜交技術(shù)相結(jié)合共一百零二頁共一百零二頁核算雜交(zjio)的方法固相雜交固相支持物應(yīng)具備的特征：1、具有較強(qiáng)的結(jié)合核酸分子的能力2、與核酸分子結(jié)合后，應(yīng)不影響其與探針分子的雜交反應(yīng)3、與核酸分子的結(jié)合穩(wěn)定(wndng)牢固，能經(jīng)受雜交、洗膜等操作過程而不

4、至于脫落或脫落很少4、非特異性吸附少，在洗膜條件下能將非特異性吸附在其表面的探針分子洗脫掉5、具有良好的機(jī)械性能固相雜交類型：Southern印記、Northern印記、組織原位雜交、菌落原位雜交等液相雜交共一百零二頁核酸(h sun)探針的制備共一百零二頁概述(i sh)核酸探針以研究和診斷為目的，用來(yn li)檢測特定序列核算的DNA或RNA片段。共一百零二頁核酸(h sun)探針的種類DNA探針(tn zhn)cDNA探針RNA探針寡核苷酸探針優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)共一百零二頁核酸探針(tn zhn)的標(biāo)記和檢測放射性標(biāo)記 32P和35S切口(qi ku)移位法隨機(jī)引物延伸標(biāo)記法末端標(biāo)記法125I

5、標(biāo)記RNA和DNA非放射性標(biāo)記 生物素、洋地黃毒苷配體-dUTP、辣根過氧化物、堿化基團(tuán)半抗原、熒光素、化學(xué)發(fā)光劑、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶間接標(biāo)記法直接標(biāo)記法DNA探針的吖啶酯標(biāo)記共一百零二頁Southern印跡雜交共一百零二頁概述(i sh)Southern blotting將待測核酸分子通過一定的方法轉(zhuǎn)移并結(jié)合到一定的固相支持物上，即印跡固定于膜上的核酸同標(biāo)記的探針在一定的溫度(wnd)和離子強(qiáng)度下退火（復(fù)性），即分子雜交過程共一百零二頁Southern blotting待測核算樣品的制備與限制酶消化采集樣本、提取(tq)DNA基因組DNA很長，通常用限制性酶消化共一百零二頁Souther

6、n blotting瓊脂糖凝膠電泳分離待測DNA樣品目的(md)：按片斷長短進(jìn)行分離，確定雜交靶分子的大小瓊脂糖凝膠濃度的選擇電泳，EB染色，紫外燈觀察凝膠共一百零二頁Southern blotting電泳凝膠的預(yù)處理為了使DNA片段在合理的時(shí)間內(nèi)從凝膠中移動(dòng)出來，必須將最長的DNA片段控制(kngzh)在大約2kb一下0.25mol/L HCl短暫脫嘌呤，堿液浸泡，使DNA變性病斷裂形成較短的單鏈DNA片段，用中性pH的緩沖液中和凝膠中的緩沖液，然后在20SSC中平衡凝膠10min共一百零二頁Southern blotting轉(zhuǎn)膜常用固相支持物：NC膜和Nylon膜常用轉(zhuǎn)膜方法：細(xì)管虹吸印跡

7、(yn j)法、電轉(zhuǎn)移法、真空轉(zhuǎn)移法等共一百零二頁Southern blotting探針標(biāo)記預(yù)雜交與Southern雜交將膜上所能與DNA結(jié)合的位點(diǎn)全部(qunb)封閉，即預(yù)雜交的目的；預(yù)雜交后雜交2SSC淋洗膜后置于合適的容器中并加入10ml左右的預(yù)雜交溶液，65轉(zhuǎn)動(dòng)或搖動(dòng)3-4h；煮沸探針5-10min使其變性，立即加入65預(yù)熱的雜交液；倒去預(yù)雜交液并加完成的雜交液， 65轉(zhuǎn)動(dòng)或搖動(dòng)過夜共一百零二頁Southern blotting洗膜采用核素標(biāo)記的探針(tn zhn)或發(fā)光劑標(biāo)記的探針(tn zhn)進(jìn)行雜交的關(guān)鍵一步放射性自顯影檢測X線底片曝光與洗片共一百零二頁Southern blo

8、tting注意事項(xiàng)共一百零二頁Northern 雜交(zjio)技術(shù)共一百零二頁實(shí)驗(yàn)原理： Northern雜交是利用DNA可以與RNA進(jìn)行分子雜交來檢測特異性RNA的技術(shù)。其基本原理和程序與Southern雜交類似，基本過程包括RNA的提取(tq)，瓊脂糖凝膠電泳分離，將變性的RNA從凝膠向?yàn)V膜轉(zhuǎn)移，然后與濾膜結(jié)合，最后用標(biāo)記探針對(duì)固定在膜上的RNA進(jìn)行雜交，用放射自顯影等方法顯示與標(biāo)記探針序列互補(bǔ)的目的條帶。 共一百零二頁 由于RNA極易降解，而RNA酶不僅無處不在，而且很難消除，所以在操作過程中必須采取必要的措施，包括使用專門準(zhǔn)備的用具、試劑和溶液等，所有溶液盡量用DEPC處理后高壓消毒

9、(xio d)的高質(zhì)量去離子水制備。由于手汗含有大量的RNA酶，因此操作人員必須戴防護(hù)手套。共一百零二頁實(shí)驗(yàn)步驟： 1、進(jìn)行RNA瓊脂糖凝膠電泳 2、RNA變性 3、將RNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜上 4、使RNA與尼龍膜結(jié)合 5、RNA與探針雜交 6、洗去非結(jié)合探針 7、放射自顯影顯示與標(biāo)記探針序列(xli)互補(bǔ)的 目的條帶共一百零二頁 變性(binxng)： 由于RNA直接與尼龍膜結(jié)合力差，且具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)，必須將RNA先經(jīng)變性劑（甲醛/羥甲基汞/戊二醛）處理，一方面使RNA變性，另一方面可促進(jìn)RNA與濾膜有效結(jié)合。 注意：RNA變性與DNA變性方法不同，不能用堿變性，否則易引起RNA水解。共一百零二頁

10、 轉(zhuǎn)移： 用刀片修飾凝膠，棄去不需要部分和加樣孔以上部分，并在一角切成三角形缺口以做記號(hào)。剪取一張略大的尼龍膜，一角剪成與凝膠缺口同樣大小的三角形缺口，將膜漂浮(pio f)在一盤去離子水表面，待完全侵濕后在10倍SSC中侵泡至少5min。 轉(zhuǎn)膜有兩種方法：電轉(zhuǎn)移法和毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法共一百零二頁毛細(xì)管轉(zhuǎn)移(zhuny)法圖示：共一百零二頁 電轉(zhuǎn)移法圖示：共一百零二頁 取出尼龍膜，甩掉多余液體，將有RNA的一面朝上，在濾紙上晾幾分鐘。 將尼龍膜晾干(lin n)后，夾在兩濾紙之間，在真空烘烤箱中80烘烤2h。共一百零二頁雜交 將放射性同位素標(biāo)記的DNA探針(tn zhn)經(jīng)100 煮沸5min和冰浴

11、2min變性，然后將探針(tn zhn)和膜放入袋中雜交，在68水浴中雜交過夜。 共一百零二頁 雜交結(jié)束后，將尼龍膜在一定量的0.1% SDS-1倍SSC中室溫下輕輕搖動(dòng)(yo dng)洗滌10min，然后在一定量的預(yù)熱至68的0.1%SDS-0.5倍SSC中洗滌3次。 共一百零二頁 注意事項(xiàng)： 1、EB會(huì)影響RNA與尼龍膜的結(jié)合，所以在膠中不能加核酸染料(rnlio)EB。 2、實(shí)驗(yàn)所用的器具、試劑以及實(shí)驗(yàn)環(huán)境一定要防止RNase的污染。 3、所有用于Noethern印跡的溶液均需用DEPC處理后高壓消毒的高質(zhì)量去離子水制備。 4、操作人員必須戴防護(hù)手套和口罩，防止RNase污染和操作人員吸

12、入DEPC中毒。共一百零二頁聚合酶鏈反應(yīng)共一百零二頁基因(jyn)擴(kuò)增（gene amplification) 指生物體內(nèi)或體外基因拷貝數(shù)大規(guī)模增加。PCR擴(kuò)增：應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）技術(shù)，在體外酶促合成特異DNA片段(pin dun)的一種方法?；驍U(kuò)增技術(shù)-PCR共一百零二頁DNA的復(fù)制(fzh)（1）3-OH進(jìn)攻5- PiDNA聚合酶催化(cu hu)DNA的延伸方向:5-3共一百零二頁DNA的復(fù)制(fzh)（2）DNA復(fù)制相關(guān)蛋白在復(fù)制起始點(diǎn)打開(d ki)雙鏈DNA然后DNA解鏈酶結(jié)合到單鏈DNA上進(jìn)一步解開雙鏈DNA 共一百

13、零二頁DNA的復(fù)制(fzh)（3）共一百零二頁P(yáng)CR技術(shù)(jsh)的創(chuàng)建 Kary B. Mullis（穆利斯（美）Khorana(1971)等提出在體外經(jīng)DNA變性(binxng),與適當(dāng)引物雜交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的設(shè)想。1983年,Mullis發(fā)明了PCR技術(shù),使Khorana的設(shè)想得到實(shí)現(xiàn)。1988年Saiki等將耐熱DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技術(shù)。1989年美國Science雜志列PCR為十余項(xiàng)重大科學(xué)發(fā)明之首,比喻1989年為PCR爆炸年,Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。共一百零二頁故事(gsh)發(fā)生在1983年的春夏之交共一百零二頁Kary B.

14、Mullis (1944 -)，在Cetus公司工作期間，發(fā)明了PCR。 他原本是要合成DNA引物來進(jìn)行測序工作， 卻常為沒有足夠多的模板DNA而煩惱。1983年春夏之交的一個(gè)晚上，他開車去鄉(xiāng)下(xing xia)別墅的路上萌發(fā)了用兩個(gè)引物（而不是一個(gè)引物）去擴(kuò)增模板DNA 的想法.很少有在公司工作(gngzu)的科研人員得諾貝爾獎(jiǎng)， Mullis是其中之一共一百零二頁Mullis開車的時(shí)候, 瞬間感覺兩排路燈(ldng)就是DNA的兩條鏈，自己的車和對(duì)面開來的車象是DNA聚合酶，面對(duì)面地合成著DNA共一百零二頁Mullis的第一個(gè)PCR實(shí)驗(yàn)(shyn) 1983年9月中旬， Mullis在反

15、應(yīng)體系中加 入DNA聚合酶后在37 一直(yzh)保溫。結(jié)果第二 天在瓊脂糖電泳上沒有 看到任何條帶。于是他認(rèn)識(shí)到有必要用加熱來解鏈，每次解鏈后再加入DNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)，依次循環(huán)。1983年12月，他終于看到了被同位素標(biāo)記的PCR條帶。共一百零二頁945537共一百零二頁基本原理PCR是一種體外酶促合成特異DNA片段的新方法它由一對(duì)引物介導(dǎo)，與模板DNA特異結(jié)合，選擇性地?cái)U(kuò)增特異的DNA片段反應(yīng)體系包括：DNA靶序列、引物、四種三磷酸脫氧核苷酸（dNTP）、耐熱(nai r)DNA聚合酶、合適的緩沖液體系共一百零二頁P(yáng)CR技術(shù)(jsh)的三步反應(yīng)共一百零二頁P(yáng)CR循環(huán)(xnhun)-變性共一

16、百零二頁P(yáng)CR循環(huán)(xnhun)-變性共一百零二頁P(yáng)CR循環(huán)(xnhun)-變性共一百零二頁P(yáng)CR循環(huán)(xnhun)退火共一百零二頁P(yáng)CR循環(huán)(xnhun)延伸共一百零二頁P(yáng)CR循環(huán)(xnhun)延伸共一百零二頁P(yáng)CR循環(huán)(xnhun)延伸共一百零二頁P(yáng)CR循環(huán)(xnhun)延伸共一百零二頁P(yáng)CR整個(gè)(zhngg)過程共一百零二頁共一百零二頁P(yáng)CR的基本原理PCR反應(yīng)(fnyng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)1234522557294時(shí)間（min）溫度（）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)13步2530輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性子鏈延伸DNA加倍DNA變性

17、形成2條單鏈模板(mbn)DNA95共一百零二頁P(yáng)CR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程(guchng)PCR的特點(diǎn)50引物1引物2DNA引物共一百零二頁P(yáng)CR的基本原理PCR反應(yīng)(fnyng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶共一百零二頁P(yáng)CR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程(guchng)PCR的特點(diǎn) 第1輪結(jié)束(jish)第2輪開始95共一百零二頁P(yáng)CR的基本原理PCR反應(yīng)條件(tiojin)PCR過程PCR的特點(diǎn)72TaqTaqTaqTaq共一百零二頁P(yáng)CR的基本原理PCR反應(yīng)(fnyng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)第2輪結(jié)束(jish)共一百零二頁

18、PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程(guchng)PCR的特點(diǎn)模板(mbn)DNA第1輪擴(kuò)增第2輪擴(kuò)增第3輪擴(kuò)增第4輪擴(kuò)增第5輪擴(kuò)增第6輪擴(kuò)增共一百零二頁P(yáng)CR的技術(shù)(jsh)路線共一百零二頁P(yáng)CR的基本(jbn)步驟體系（加樣方法） 10PCR緩沖液 10ul DNA模板(mbn) 0.1-1ug dNTP（2mmol/L） 各10ul 兩種引物（10-50umol/L） 各1-2ul ddH2O（滅菌） 加至100ul 離心15s，加石蠟共一百零二頁P(yáng)CR的基本(jbn)步驟PCR循環(huán) 預(yù)變性 97，2-5min，迅速冷卻至室溫(sh wn) 加入TaqDNA聚合酶 主循環(huán) 變性94

19、 30-60s 退火55 30-60s 延伸72 60-150s 循環(huán)25-35次 終延伸 72 5-10min共一百零二頁共一百零二頁P(yáng)CR的反應(yīng)(fnyng)體系及其優(yōu)化共一百零二頁概述(i sh)模板引物緩沖體系一價(jià)或二價(jià)(r ji)陽離子四種dNTP耐熱DNA聚合酶共一百零二頁模板(mbn)模板(mbn)的純化模板DNA片段大小適宜的模板量共一百零二頁引物 引物：決定PCR反應(yīng)的特異性 PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度 理論上，只要(zhyo)知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，用 PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增共一百零二頁 基本原

20、則是最大限度地提高擴(kuò)增效率和特異性，同時(shí)(tngsh)盡可能抑制非特異性擴(kuò)增。引物設(shè)計(jì)(shj)的原則共一百零二頁引物引物的長度引物的擴(kuò)增跨度引物的組成(z chn)引物3端配對(duì)引物的濃度共一百零二頁引物長度： 15-30bp，常用20bp左右 引物的有效長度不能大于 38 bp，否則最適 延伸溫度會(huì)超過TaqDNA聚合酶的最適溫度 （74），不能保證PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(chnw)的特異性引物擴(kuò)增跨度：以500bp為宜 特定條件下可擴(kuò)增長至10kb的片段共一百零二頁引物堿基：G+C含量以40-60%為宜 G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C 過多易出現(xiàn)非特異條帶 ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤

21、或嘧啶核苷酸的成串排列，尤其3端不應(yīng)超過3 個(gè)連續(xù)的G或C，因?yàn)檫@樣(zhyng)會(huì)使引物在G+C富集區(qū) 引發(fā)錯(cuò)誤延伸避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)和引物間互補(bǔ) 特別避免 3端的互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異性的擴(kuò)增條帶 共一百零二頁共一百零二頁引物 3端的堿基要求嚴(yán)格配對(duì)（不能做任何修飾） 特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，以避免因末端 堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失敗引物5端可修飾 引物5端限定著PCR產(chǎn)物的長度，但對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大；引物5端堿基可不與模板(mbn)DNA 互補(bǔ)而呈游離狀態(tài)；引物5端最多可加10個(gè)堿 基而對(duì)PCR反應(yīng)無影響 共一百零二頁引物的特異性： 引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它

22、(qt)序列無明顯同源性引物量： 每條引物的濃度0.1 0.5M，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)共一百零二頁技術(shù)(jsh)舉例共一百零二頁共一百零二頁共一百零二頁共一百零二頁共一百零二頁共一百零二頁共一百零二頁共一百零二頁共一百零二頁共一百零二頁耐熱(nai r)DNA聚合酶目前有兩種 Taq DNA 聚合酶供應(yīng) 天然酶：從水生嗜熱桿菌中提純 基因工程酶：大腸菌合成(hchng)一個(gè)典型的 PCR反應(yīng)約需酶量1- 2.5U/100 ul體系濃度過高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少共一百零二頁Taq DNA 聚合

23、酶Taq DNA 聚合酶的功能Taq DNA 聚合酶的特性(txng)Taq DNA 聚合酶的使用量Taq DNA 聚合酶的影響因素共一百零二頁三磷酸(ln sun)脫氧核苷酸在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50200M，濃度過低會(huì)降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量注意4種dNTP的濃度要相等（等摩爾配制 ）,如其中(qzhng)任何一種濃度不同于其它幾種時(shí)（偏高或偏低），就會(huì)引起錯(cuò)配高濃度的dNTP可與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度下降，影響DNA聚合酶的活性共一百零二頁二價(jià)(r ji)陽離子Mg2+Mg2+對(duì)PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響在一般(ybn)的 PCR反應(yīng)中，各種dNTP濃度為200u

24、mol/L時(shí)，Mg2+濃度為1.52.0 mmol/L為宜Mg2+濃度過高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增， 濃度過低會(huì)降低 Taq DNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少共一百零二頁P(yáng)CR反應(yīng)(fnyng)條件的優(yōu)化共一百零二頁概述(i sh)溫度循環(huán)參數(shù)PCR反應(yīng)(fnyng)促進(jìn)劑液態(tài)石蠟反應(yīng)體系中各因素的相互作用共一百零二頁 變性(binxng)溫度與時(shí)間：一般9394，1min足以使模板變性(binxng)若低于93則需延長時(shí)間但溫度不能過高，因?yàn)楦邷丨h(huán)境對(duì)酶的活性有影響。共一百零二頁 退火(復(fù)性(f xn)溫度與時(shí)間：退火溫度是影響PCR特異性的重要因素退火溫度與時(shí)間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度(nngd)，還有靶基因序列的長度對(duì)于20個(gè)核苷酸，G+C含量約50%的引物，55作為選擇最適退火溫度的起點(diǎn)較為理想共一百零二頁引物的復(fù)性溫度通過以下公式幫助(bngzh)選擇合適的溫度：