藥品質量控制中的生物檢定課件

1、藥品質量控制中的生物檢定 上海市食品藥品檢驗所 藥理毒理室/藥物安全評價中心主任 唐黎明第1頁，共58頁。藥品質量控制中的生物檢定一、藥品質量控制中的生物檢定概述二、效價測定的基本原理和技術要求三、生物檢定中安全性檢查制定原則四、安全性檢查的基本原理和技術要求五、生物檢定的發(fā)展第2頁，共58頁。一、藥品質量控制中的生物檢定概述生物檢定（bioassay）的定義生物檢定法是利用生物體包括整體、離體組織、器官、細胞和微生物等評估藥物生物活性的一種方法。它以藥物的藥理作用為基礎，以生物統(tǒng)計為工具，運用特定的實驗設計在一定條件下比較供試品和相當?shù)臉藴势坊驅φ掌匪a(chǎn)生的特定反應，通過等反應劑量間比例的運

2、算或限值劑量引起的生物反應程度，從而測定供試品的效價、生物活性或雜質引起的毒性。第3頁，共58頁。產(chǎn)品生物活性的信息（ 與臨床療效一致）評價批與批之間穩(wěn)定性和一致性監(jiān)測不曾預料、不易發(fā)現(xiàn)的構象變化所有變化的綜合效應工藝與方法驗證一、概述：作用第4頁，共58頁。藥品質量控制項目性狀、鑒別、檢查和含量生物檢定-檢查類和含量類。藥品（生化藥品、中藥）生物制品（疫苗、血液制品）一、概述：應用范圍第5頁，共58頁。 體內檢測：以整體動物為生物體，能反映藥物對人體的作用方式，是最經(jīng)典的生物效價檢測方法體內測定法的有蛋白質、肽類激素等一、概述：生物檢定的方法第6頁，共58頁。 體外檢測離體動物器官測定法細胞

3、培養(yǎng)（促進細胞生長、抑制細胞生長、間接保護細胞）測定法生化酶促反應測定法免疫學活性測定法一、概述：生物檢定的方法第7頁，共58頁。 定性 （鑒別） 對能用理化方法測定的藥品，生物效價檢測可降為鑒別項的定性測定一、概述：生物檢定的方法第8頁，共58頁。 半定量法（活性檢查）理化測定占主導地位效價測定可歸于活性檢查項采用半定量方法設定限值，不需精密生物統(tǒng)計盡可能減少實驗動物或其他生物體用量一、概述：生物檢定的方法第9頁，共58頁。 定量法效價（potency）測定是生物檢定的主要內容一、概述：生物檢定的方法第10頁，共58頁。二、效價測定的基本要求和基本方法第11頁，共58頁。二、效價測定的基本要

4、求原則：相關性重復性靈敏性適用性定性定量 第12頁，共58頁。二、效價測定的基本要求 生物檢定標準品()標準品都有標示效價，以效價單位（u）表示，其含義和相應的國際標準品的效價單位一致第13頁，共58頁。二、效價測定的基本要求實驗設計與生物統(tǒng)計： 等反應劑量對比可靠性測驗 可信限和可信限率第14頁，共58頁。二、效價測定的基本方法 直接測定法：直接測得藥物對各個動物最小有效量或最小致死量的檢定方法洋地黃及其制劑的效價測定-鴿最小致死量法第15頁，共58頁。二、效價測定的基本方法 量反應平行線測定法： 要求在一定劑量范圍內，S和T的對數(shù)劑量x和反應或反應的特定函數(shù)y呈直線關系當S和T的活性組分基

5、本相同時，兩直線平行第16頁，共58頁。三、生物檢定中安全性檢查制定原則第17頁，共58頁。三、安全性檢查制定原則 1. 靜脈注射 細菌內毒素（或熱原）第18頁，共58頁。三、安全性檢查制定原則 1. 靜脈注射異常毒性檢查所用原料系動物來源或微生物發(fā)酵液提取物，組分結構不清晰或有可能污染毒性雜質，且又缺乏有效的理化分析方法的靜脈用注射劑，應考慮設立異常毒性檢查第19頁，共58頁。三、安全性檢查制定原則 1. 靜脈注射過敏反應檢查所用原料系動物來源或微生物發(fā)酵提取物時，組分結構不清晰，且有可能污染異源蛋白或未知過敏反應物質的靜脈用注射劑，如缺乏相關的理化分析方法且臨床發(fā)現(xiàn)過敏反應，應考慮設立過敏

6、反應檢查項第20頁，共58頁。三、安全性檢查制定原則 1. 靜脈注射降壓物質或組胺類物質所用原料系動物來源或微生物發(fā)酵提取物時, 組分結構不清晰或有可能污染組胺、類組胺樣降血壓物質的靜脈用注射劑，應考慮設立降壓物質或組胺類物質檢查項第21頁，共58頁。三、安全性檢查制定原則 2.肌內注射 異常毒性檢查過敏反應檢查細菌內毒素檢查臨床用藥劑量較大，生產(chǎn)工藝易污染細菌內毒素的肌內注射用注射劑，應考慮設細菌內毒素檢查項第22頁，共58頁。三、安全性檢查制定原則 3.特殊途徑的注射劑椎管內、腹腔、眼內等特殊途徑的注射劑，其安全性檢查項目一般應符合靜脈用注射劑的要求必要時增加其它安全性檢查項目，如刺激性檢

7、查、細胞毒性檢查第23頁，共58頁。三、安全性檢查制定原則 4. 注射劑輔料注射劑輔料使用面廣，用量大，來源復雜，與藥品的安全性直接相關 應根據(jù)輔料來源、性質、用途、用法用量，配合理化分析方法，設立必要的安全性檢查項目第24頁，共58頁。三、安全性檢查制定原則 5. 其它 原料和生產(chǎn)工藝特殊的注射劑必要時應增加特殊的安全性檢查項目，如病毒檢查、細胞毒性檢查等第25頁，共58頁。三、安全性檢查制定原則中藥注射劑安全性檢查項目熱原（或細菌內毒素）異常毒性過敏反應溶血與凝聚降壓物質檢查（功能主治中具有與升壓相關內容的注射劑除外）第26頁，共58頁。三、安全性檢查制定原則方法適用性（設定限值前研究）確

8、定限值應進行三批以上供試品的檢查驗證 第27頁，共58頁。四、安全性檢查的基本原理和技術要求第28頁，共58頁。（一）熱原檢查法本法系將一定劑量的供試品，靜脈注入家兔體內，在規(guī)定時間內，觀察家兔體溫升高的情況，以判定供試品中所含熱原的限度是否符合規(guī)定第29頁，共58頁。（一）熱原檢查法動物：家兔，健康合格，體重1.7kg以上體溫：38. 0 39. 6的范圍內，且最高與最低體溫相差不超過0. 4的家兔結果判斷：0.6總和1.3第30頁，共58頁。（一）熱原檢查法熱原檢查限值的確定一般為人用每公斤體重每小時最大供試品劑量的35倍供試品注射體積每公斤體重一般不少于0.5mL，不超過10mL限值劑量

9、應不影響正常體溫第31頁，共58頁。（二）細菌內毒素檢查法細菌內毒素檢查法的分類定性法： 凝膠法半定量法：凝膠半定量試驗定量法：光度測定法濁度法 （終點濁度法、動態(tài)濁度法）顯色基質法（終點顯色法、動態(tài)顯色法）第32頁，共58頁。（二）細菌內毒素檢查法確定內毒素限值L=K/ML為供試品的細菌內毒素限值M為人用每公斤體重或每平方米每小時的臨床最大用藥劑量注射劑K=5EU/（kgh）放射性藥品注射劑K=2.5EU/（kgh）鞘內用注射劑K=0.2EU/（kgh）K=194EU/（m2h）第33頁，共58頁。（二）細菌內毒素檢查法干擾試驗新藥的內毒素檢查試驗前建立內毒素檢查法時鱟試劑、供試品的配方、生

10、產(chǎn)工藝改變或試驗環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗結果的變化時，須重新進行干擾試驗第34頁，共58頁。（二）細菌內毒素檢查法凝膠法凝膠法系通過鱟試劑與內毒素產(chǎn)生凝集反應的原理來檢測或半定量內毒素的方法第35頁，共58頁。（二）細菌內毒素檢查法光度測定法濁度法利用檢測鱟試劑與內毒素反應過程中的濁度變化而測定內毒素含量的方法終點濁度法動態(tài)濁度法第36頁，共58頁。 （二）細菌內毒素檢查法光度測定法顯色基質法利用檢測鱟試劑與內毒素反應過程中產(chǎn)生的凝固酶使特定底物釋放出呈色團的多少而測定內毒素含量的方法終點顯色法動態(tài)顯色法第37頁，共58頁。（三）異常毒性檢查法本法系給予小鼠一定劑量的供試品溶液，在規(guī)定時

11、間內觀察小鼠出現(xiàn)的死亡情況，以判定供試品是否符合規(guī)定的一種方法第38頁，共58頁。（三）異常毒性檢查法小鼠，體重1720g，5只分別給予供試品溶液0.5ml結果判斷 全部小鼠在給藥后48小時內不得有死亡第39頁，共58頁。（三）異常毒性檢查法限值確定急性毒性數(shù)據(jù)（LD50或LD1）限值至少應小于LD1可信限下限的1/3（建議采用1/31/6）靜脈注射最大劑量0.8ml/20g仍未見毒性反應或死亡，可以此作為檢查限值第40頁，共58頁。 （四）溶血與凝聚檢查法本法系將一定量供試品與2%的家兔紅細胞混懸液混合，溫育一定時間后，觀察其對紅細胞狀態(tài)是否產(chǎn)生影響的一種方法第41頁，共58頁。 （四）溶血

12、與凝聚檢查法 結果判斷 當陰性對照管無溶血和凝聚發(fā)生，陽性對照管有溶血發(fā)生，若供試品管中的溶液在3小時內不發(fā)生溶血和凝聚，判定供試品符合規(guī)定；若供試品管的溶液在3小時內發(fā)生溶血和（或）凝聚，判供試品不符合規(guī)定第42頁，共58頁。 （四）溶血與凝聚檢查法限值 一般對注射劑原液和稀釋液進行溶血與凝聚實驗研究 一般應高于臨床最大使用濃度第43頁，共58頁。 （五）過敏反應檢查法本法系將一定量的供試品溶液注入豚鼠體內，間隔一定時間后靜脈注射供試品溶液進行激發(fā)，觀察動物出現(xiàn)過敏反應的情況，以判定供試品是否引起動物全身過敏反應第44頁，共58頁。 （五）過敏反應檢查法 檢查法 豚鼠6只，隔日每只每次腹腔注

13、射供試品溶液0.5ml，共3次，進行致敏均分為2組，每組3只，分別在首次注射后第14日和第21日，由靜脈注射供試品溶液1ml進行攻擊第45頁，共58頁。 （五）過敏反應檢查法結果判斷 靜脈注射供試品溶液30分鐘內，不得出現(xiàn)過敏反應。如有豎毛、發(fā)抖、干嘔、連續(xù)噴嚏3聲、連續(xù)咳嗽3聲、紫疳和呼吸困難等現(xiàn)象中的2種或2種以上，或出現(xiàn)二便失禁、步態(tài)不穩(wěn)或倒地、抽搐、休克、死亡現(xiàn)象之一者，判供試品不符合規(guī)定第46頁，共58頁。 （五）過敏反應檢查法限值確定測定供試品對豚鼠腹腔（或皮下）和靜脈給藥的無毒性反應劑量在首次給藥后14、21、28天中選擇最佳激發(fā)時間致敏和激發(fā)劑量應小于該途徑的急性毒性反應劑量,

14、 適當參考臨床劑量一般激發(fā)劑量大于致敏劑量第47頁，共58頁。 （六）降壓物質檢查法本法系比較組胺對照品（S）與供試品（T）引起麻醉貓血壓下降的程度，以判定供試品中所含降壓物質的限度是否符合規(guī)定第48頁，共58頁。 （六）降壓物質檢查法方法：體重2kg以上的貓供試品按一定注射速度靜脈注射不同劑量，觀察供試品對貓血壓反應的劑量反應關系 第49頁，共58頁。 （六）降壓物質檢查法結果判斷 dT反應平均值不大于ds反應平均值，并且dT反應平均值任何一次反應值不大于組胺高劑量反應值，即判定供試品降壓物質檢查符合規(guī)定第50頁，共58頁。 （六）降壓物質檢查法限值和要求供試品與對照品注射體積應相同，通常為

15、0.11ml/kg臨床單次用藥劑量的1/55倍作為降壓反應物質檢查劑量限值如供試品有一定降壓作用，則可按最大無降壓反應劑量的1/2-1/4作為限值劑量供試品原液靜脈注射1ml/kg劑量未見降壓反應，該劑量可作為給藥限值第51頁，共58頁。 （七）組胺檢查法本法系將一定濃度的供試品和組胺對照品分別觀察豚鼠離體回腸出現(xiàn)的收縮反應幅度并加以比較，以判定供試品是否符合規(guī)定的一種方法第52頁，共58頁。五、生物檢定的發(fā)展第53頁，共58頁。（一）現(xiàn)狀 生物檢定的優(yōu)缺點生測法的優(yōu)點：生測法的缺點：第54頁，共58頁。（二）效價測定品種和范圍的變化 1儀器的改進2 抗生素的含量測定3刪除生物檢定品種4取消的生物效價測定5 簡化與減少6 需要改進提高的生化藥品種第55頁，共58頁。（三）安全性檢查的變化細菌內毒素替代家兔熱原檢