色譜分析法導(dǎo)論課件

1、高效液相色譜法High Performance Liquid Chromatography 高效液相色譜法（HPLC）概述 高效液相色譜法 高效液相色譜(HPLC)是以溶劑液體為流動(dòng)相的色譜方法。按照固定相不同可分為：液液分配色譜；吸附色譜(液固色譜)；離子交換色譜；尺寸排阻色譜(凝膠滲透色譜)。此外，還有親和色譜、平板色譜(薄層色譜)等。早期液相色譜，包括Tswett的工作，都是在直徑15cm, 長(zhǎng)50500cm的玻璃柱中進(jìn)行的。為保證有一定的柱流速，填充的固定相顆粒直徑多在150200m范圍內(nèi)。即使這樣，流速仍然很低(1mL/min)，分析時(shí)間仍然很長(zhǎng)！高效液相色譜法（HPLC）概述 當(dāng)加

2、壓增加流速(真空或空氣泵)時(shí)，盡管分析時(shí)間減少，但柱塔板高度Hmin也相應(yīng)增加了！或者說(shuō)柱效下降了。 為了解決分析時(shí)間及柱效問(wèn)題，人們認(rèn)識(shí)到：最為有效地增加柱效的唯一方法是減小填充物的粒徑（310 m）！ 直到60年代，由于在高壓下操作的液壓設(shè)備、高效固定相以及高靈敏檢測(cè)器的出現(xiàn)及發(fā)展，才徹底解決了分析時(shí)間及柱效的問(wèn)題。即所謂的高效液相色譜技術(shù)才真正得到廣泛應(yīng)用。H = A + B/u + cu高速：HPLC采用高壓輸液設(shè)備，流速大大增加，分析速度極快，只需數(shù)分鐘；而經(jīng)典方法靠重力加料，完成一次分析需時(shí)數(shù)小時(shí)。高效：填充物顆粒極細(xì)且規(guī)則，固定相涂漬均勻、傳質(zhì)阻力小，因而柱效很高?？梢栽跀?shù)分鐘內(nèi)

3、完成數(shù)百種物質(zhì)的分離。高靈敏度：檢測(cè)器靈敏度極高：UV10-9g, 熒光檢測(cè)器10-11g。高效液相色譜的特點(diǎn)分析對(duì)象及范圍：GC分析只限于氣體和低沸點(diǎn)的穩(wěn)定化合物，而這些物質(zhì)只點(diǎn)有機(jī)物總數(shù)的20%；HPLC可以分析高沸點(diǎn)、高分子量的穩(wěn)定或不穩(wěn)定化合物，這類物質(zhì)占有機(jī)物總數(shù)的80%。流動(dòng)相的選擇：GC采用的流動(dòng)相中為有限的幾種“惰性”氣體，只起運(yùn)載作用，對(duì)組分作用??；HPLC采用的流動(dòng)相為液體或各種液體的混合，可供選擇的機(jī)會(huì)多。它除了起運(yùn)載作用外，還可與組分作用，并與固定相對(duì)組分的作用產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)，即流動(dòng)相對(duì)分離的貢獻(xiàn)很大，可通過(guò)溶劑來(lái)控制和改進(jìn)分離。操作溫度：GC需高溫；HPLC通常在室溫下進(jìn)行

4、。結(jié)論：從色譜分析的發(fā)展來(lái)看，HPLC比GC更為有用、更具發(fā)展前途！HPLC與GC的比較HPLC的應(yīng)用應(yīng)用領(lǐng)域分析對(duì)象舉例環(huán)境常見(jiàn)無(wú)機(jī)陰陽(yáng)離子、多環(huán)芳烴、多氯聯(lián)苯、硝基化合物、有害重金屬及其形態(tài)、除草劑、農(nóng)藥、酸沉降成分。農(nóng)業(yè)土壤礦物成分、肥料、飼料添加劑、茶葉等農(nóng)產(chǎn)品中無(wú)機(jī)和有機(jī)成分。石油烴類族組成、石油中微量成分?；o(wú)機(jī)化工產(chǎn)品、合成高分子化合物、表面活性劑、洗滌劑成分、化妝品、染料。材料液晶材料、合成高分子材料。食品無(wú)機(jī)陰陽(yáng)離子、有機(jī)酸、氨基酸、糖、維生素、脂肪酸、香料、甜味劑、防腐劑、人工色素、病原微生物、霉菌毒素、多核芳烴、農(nóng)獸藥殘留。生物氨基酸、肽、蛋白質(zhì)、核糖核酸、生物胺、多糖

5、、酶、天然高分子。醫(yī)藥人體化學(xué)成分、各類合成藥物成分、各種天然植物和動(dòng)物藥物化學(xué)成分。HPLC儀器包括： 1.高壓輸液裝置; 2.進(jìn)樣系統(tǒng); 3.分離系統(tǒng); 4.檢測(cè)系統(tǒng);此外還配有梯度洗脫、自動(dòng)進(jìn)樣、自動(dòng)收集和數(shù)據(jù)處理裝置等。HPLC儀器HPLC儀器高壓輸液系統(tǒng)150350105Pa貯液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶劑過(guò)濾器(Ni合金)，其孔徑約2 m，可防止顆粒物進(jìn)入泵內(nèi)。脫氣：超聲波脫氣或真空加熱脫氣。溶劑通過(guò)脫氣器中的脫氣膜，相對(duì)分子量小的氣體透過(guò)膜從溶劑中除去（氣泡會(huì)影響檢測(cè)）。高壓泵：對(duì)輸液泵的要求：密封性好、輸液流量穩(wěn)定無(wú)脈動(dòng)、可調(diào)范圍寬、耐腐蝕。輸液泵種類：恒壓型和恒流型。 恒壓

6、泵(類似于風(fēng)箱)可迅速獲得高壓，適于柱的勻漿填充。但因泵腔體積大，在往復(fù)推動(dòng)時(shí)，會(huì)引起脈動(dòng)，且輸出流量隨色譜系統(tǒng)阻力（主要是柱填充物）變化而變化，現(xiàn)已較少使用。 恒流型溶劑流量恒定，與柱填充情況無(wú)關(guān)，使用較多。有機(jī)械注射式和機(jī)械往復(fù)式兩種。應(yīng)用最多的是往復(fù)式恒流泵。高壓輸液泵往復(fù)式恒流泵 在進(jìn)行多成分的復(fù)雜樣品的分離時(shí)，經(jīng)常會(huì)碰到前面的一些成分分離不完全，而后面的一些成分分離度太大，且出峰很晚和峰型較差。為了使保留值相差很大的多種成分在合理的時(shí)間內(nèi)全部洗脫并達(dá)到相互分離，往往要用到梯度洗脫技術(shù)。梯度洗脫線性梯度： 在某一段時(shí)間內(nèi)連續(xù)而均勻增加流動(dòng)相強(qiáng)度。階梯梯度： 直接從某一低強(qiáng)度的流動(dòng)相改變

7、為另一較高強(qiáng)度的流動(dòng)相。梯度洗脫時(shí)，流動(dòng)相的輸送就是要將幾種組成的溶液混合后送到分離系統(tǒng)，因此，梯度洗脫裝置就是解決溶液的混合問(wèn)題，其主要部件除高壓泵外，還有混合器和梯度程序控制器。根據(jù)溶液混合的方式可以將梯度洗脫分為高壓梯度和低壓梯度。高壓梯度： 一般只用于二元梯度，即用兩個(gè)高壓泵分別按設(shè)定的比例輸送A和B兩種溶液至混合器，混合器是在泵之后，即兩種溶液是在高壓狀態(tài)下進(jìn)行混合的。高壓梯度系統(tǒng)的主要優(yōu)點(diǎn)是，只要通過(guò)梯度程序控制器控制每臺(tái)泵的輸出，就能獲得任意形式的梯度曲線，而且精度很高，易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化控制。其主要缺點(diǎn)是使用了兩臺(tái)高壓輸液泵，使儀器價(jià)格變得更昂貴，故障率也相對(duì)較高，而且只能實(shí)現(xiàn)二元

8、梯度操作。 高壓梯度低壓梯度低壓梯度： 只需一個(gè)高壓泵，與等度洗脫輸液系統(tǒng)相比，就是在泵前安裝了一個(gè)比例閥，混合就在比例閥中完成。多元梯度泵的流路可以部分空置。 與GC相比，HPLC柱要短得多，因此由于柱本身所產(chǎn)生的峰形展寬相對(duì)要小些。即，HPLC的展寬多因一些柱外因素引起。這些因素包括：進(jìn)樣系統(tǒng)、連接管道及檢測(cè)器的死體積。進(jìn)樣裝置包括兩種。1）隔膜注射進(jìn)樣：使用微量注射器進(jìn)樣。裝置簡(jiǎn)單、死體積小。但進(jìn)樣量小且重現(xiàn)性差。2）高壓進(jìn)樣閥：目前最常用的為六通閥。由于進(jìn)樣量可由樣品管控制，因此進(jìn)樣準(zhǔn)確，重復(fù)性好。進(jìn)樣系統(tǒng)色譜柱 色譜柱的構(gòu)成色譜柱是實(shí)現(xiàn)分離的核心部件，要求柱效高、柱容量大和性能穩(wěn)定。

9、柱性能與柱結(jié)構(gòu)、填料特性、填充質(zhì)量和使用條件有關(guān)。色譜填料： 經(jīng)過(guò)制備處理后，用于填充色譜柱的物質(zhì)顆粒，通常是5-10粒徑的球形顆粒。色譜柱管： 內(nèi)部拋光的不銹鋼管。典型的液相色譜分析柱尺寸是內(nèi)徑4.6mm，長(zhǎng)250mm。色譜柱： 是將色譜填料填充到色譜柱管中所構(gòu)成的,其結(jié)構(gòu)如圖所示。紫外-可見(jiàn)光（UV-VIS）檢測(cè)器原理： 基于Lambert-Beer定律，即被測(cè)組分對(duì)紫外光或可見(jiàn)光具有吸收，且吸收強(qiáng)度與組分濃度成正比。很多有機(jī)分子都具紫外或可見(jiàn)光吸收基團(tuán)，有較強(qiáng)的紫外或可見(jiàn)光吸收能力，因此UV-VIS檢測(cè)器既有較高的靈敏度，也有很廣泛的應(yīng)用范圍。由于UV-VIS對(duì)環(huán)境溫度、流速、流動(dòng)相組成

10、等的變化不是很敏感，所以還能用于梯度淋洗。一般的液相色譜儀都配置有UV-VIS檢測(cè)器。用UV-VIS檢測(cè)時(shí)，為了得到高的靈敏度，常選擇被測(cè)物質(zhì)能產(chǎn)生最大吸收的波長(zhǎng)作檢測(cè)波長(zhǎng)，但為了選擇性或其它目的也可適當(dāng)犧牲靈敏度而選擇吸收稍弱的波長(zhǎng)，另外，應(yīng)盡可能選擇在檢測(cè)波長(zhǎng)下沒(méi)有背景吸收的流動(dòng)相。檢測(cè)器檢測(cè)器二極管陣列檢測(cè)器（diode-array detector, DAD）： 以光電二極管陣列作為檢測(cè)元件的UV-VIS檢測(cè)器。它可構(gòu)成多通道并行工作，同時(shí)檢測(cè)由光柵分光，再入射到陣列式接受器上的全部波長(zhǎng)的信號(hào)，然后，對(duì)二極管陣列快速掃描采集數(shù)據(jù)，得到的是時(shí)間、光強(qiáng)度和波長(zhǎng)的三維譜圖。熒光檢測(cè)器許多有機(jī)

11、物具熒光活性，尤其是芳香族化合物具有很強(qiáng)的活性。熒光檢測(cè)器是一種選擇性很強(qiáng)的檢測(cè)器，其靈敏度比UV檢測(cè)器高23個(gè)數(shù)量級(jí)。檢測(cè)器HPLC組成介紹分配色譜1.原理：根據(jù)各待測(cè)物在互不相溶的兩溶液中的溶解度不同，因而具有不同的分配系數(shù)。在色譜柱中，隨著流動(dòng)相的移動(dòng)，這種分配平衡需進(jìn)行多次，造成各待測(cè)物的遷移速率不同，從而實(shí)現(xiàn)分離的過(guò)程。2. 流動(dòng)相:HPLC分析中，為防止固定相的流失，流動(dòng)相與固定液應(yīng)盡量不互溶，或者說(shuō)二者的極性相差越大越好。因此，根據(jù)流動(dòng)相與固定相極性的差別程度，可將液液色譜分為正相分配色譜（流動(dòng)相極性小于固定相極性，極性小的先流出，適于極性組分分離）和反相分配色譜（流動(dòng)相極性大于

12、固定相極性，極性大的先流出，適于非極性組分分離）。高效液相色譜方法3 固定相原則上，用于GC的固定相也可用于HPLC作固定相。但HPLC固定液易流失，因此常用的只有幾種，按極性由高到低為：,-氧二丙腈(ODPN)、聚乙二醇(PEM)、三甲撐二醇(TMG)、十八烷(C18)、角鯊?fù)?SQ)。根據(jù)涂漬方法的不同，可將固定相分為機(jī)械涂漬型和化學(xué)鍵合型，后者應(yīng)用更為廣泛。1）機(jī)械涂漬固定相：將固定液通過(guò)機(jī)械混合的方法涂漬到表面多孔型(0.5-1.5%涂布量)或全多孔型載體(5-10%涂布量)上形成的液液色譜固定相。2）化學(xué)鍵合固定相 化學(xué)鍵合固定相是通過(guò)化學(xué)反應(yīng)將有機(jī)分子鍵合在載體表面所形成的柱填充劑，具有穩(wěn)定、流失小、適于梯度淋洗等特點(diǎn)。這種固定相分離機(jī)理既不是簡(jiǎn)單的吸附，也不是單一的液液分配，而