檢測(cè)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)-精選.

1、in vivo :在體內(nèi) in vitro :在體外word.一、檢測(cè)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用 FRET 技術(shù)（in vivo ）FRET, Fluorescence resonance energy transfer ,即熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)。該技術(shù)的原理是用一種波長的光激發(fā)某種熒 光蛋白后，它釋放的熒光剛好又能激發(fā)另一種熒光蛋白，使其釋放另一波長的熒光，如下圖所示：530 nm以下圖為例，若要利用 FRET檢測(cè)兩種蛋白是否有相互作用，需將兩種蛋白的基因分別與這兩種熒光蛋白的基因融合,并在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)出兩種融合蛋白。然后只需用紫外光對(duì)CFP進(jìn)行激發(fā)，并檢測(cè) GFP是否放出綠色熒光。如果能檢測(cè)到綠

2、色熒光，那么可以說明這兩種蛋白可能有相互作用；反之，則是這兩種蛋白沒有相互作用。轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)fOp/UAS報(bào)告基因91幅白聶相互作用掾芻美光蛋臼被激發(fā).檢刈到 綠色熒光酵母雙、三雜交技術(shù)（in vivo ）酵母雙雜交系統(tǒng)主要用于考察兩種蛋白是否有相互作用，其原理是典型的真核生長轉(zhuǎn)錄因子，如GAL4、GCN4等都含有二 個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域，即AD和BDo這些轉(zhuǎn)錄因子只有同時(shí)具有這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域時(shí)才能起始轉(zhuǎn)錄。由此，設(shè)計(jì)不同的兩個(gè)載體，一個(gè) 含有AD基因（假設(shè)為A載體）,另一個(gè)含有BD基因（假設(shè)為B載體）。一般將一個(gè)已知蛋白的基因連在 B載體上，彳為誘餌（Bait）,將未知蛋白的基因連在 A載體上，將這兩個(gè)載

3、體都轉(zhuǎn)到特定的 酵母細(xì)胞內(nèi)，看未知蛋白與已知蛋白是否有相互作用。如果兩者有相互作用，那么就可以啟動(dòng)報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄，從而使這個(gè)酵 母細(xì)胞能在選擇培養(yǎng)基上顯現(xiàn)出來或者生存下來；如果兩者無相互作用，那么報(bào)告基因就無法表達(dá)，那么這個(gè)酵母細(xì)胞就無法 在擇培養(yǎng)基上顯現(xiàn)出來或者生存下來，如下圖所示:醉性雙雜交系統(tǒng)UAS：上游激活序列BDt DNA結(jié)介結(jié)構(gòu)域AD.轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域因此又發(fā)展出了分離泛素酵母雙雜由于酵母雙雜交系統(tǒng)不能鑒定膜蛋白間的相互作用, 交系統(tǒng)。該系統(tǒng)的原理如下圖所示：無轉(zhuǎn)錄無轉(zhuǎn)錄例錄后動(dòng)如圖所示，將泛素蛋白拆分為兩個(gè)片段，即 C端段(Cub)和N端段(NubG),并在C端段的N端接上一個(gè)Le

4、xA-VP16轉(zhuǎn)錄因子，此時(shí)它并不能激活基因轉(zhuǎn)錄(因?yàn)樗幌拗圃诹薈端段上，不能進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮作用)。將IC端段連到一個(gè)膜蛋白上，將 N端段連接到另一個(gè)膜蛋白上。若兩個(gè)膜蛋白有相互作用，那么兩個(gè)膜蛋白在相互靠近時(shí)會(huì)使泛素蛋白的N端段和C端段靠近結(jié)合，形成一個(gè)完整的泛素蛋白。此時(shí)泛素蛋白酶體會(huì)將這一段被泛素標(biāo)記的片段降 解，那么連接C端段的LexA-VP16轉(zhuǎn)錄因子掉落，即可進(jìn)入細(xì)胞核啟動(dòng)標(biāo)記基因的表達(dá)。酵母三雜交的原理與雙雜交一樣，只是它研究的是兩個(gè)蛋白和第三個(gè)成分間的相互作用，通過第三個(gè)成分使兩個(gè)蛋白相互靠近。第三個(gè)成分可以是：蛋白、RNA或小分子，如下圖所示：如上圖所示，在加入第三種成分前

5、，蛋白 X與蛋白丫之間并無直接相互作用，因此無法使 BD和AD靠近，報(bào)告基因不能 表達(dá)；當(dāng)加入第三種成分后，蛋白 X與蛋白Y的距離被拉近，BD和AD靠近，報(bào)告基因表達(dá)，從而可以被檢測(cè)到。Pulldown 技術(shù)(in vitro )Pulldown ,即蛋白沉降技術(shù)，它是建立在蛋白質(zhì) 親和層析的基礎(chǔ)上的一種檢測(cè)蛋白質(zhì)間相互作用的分析方法。親和層析的 原理如下圖所示，不同蛋白對(duì)配體的親和程度不同，因此可以先將非特異結(jié)合的蛋白用低濃度緩沖液給清洗出去，只剩目的蛋 白與層析柱結(jié)合，然后再用洗脫液將目的蛋白洗脫下來，達(dá)到純化目的蛋白的作用。高通度選股液洗脫液】Pulldown技術(shù)利用的是親和層析技術(shù)以及

6、特異的配體（如 GSH或者鎮(zhèn)）。以下圖為例，將 GST的基因與蛋白X的基因融合，表達(dá)出融合蛋白。將該融合蛋白的溶液過帶有GSH配體的層析柱，那么這一融合蛋白就能結(jié)合在配體上，然后將待測(cè)蛋白的溶液過柱，并讓其與融合蛋白反應(yīng)一段時(shí)間。接著開始進(jìn)行洗脫。如果待測(cè)蛋白與蛋白X無相互作用，那么在開始清洗的時(shí)候就會(huì)被洗下來；如果在用洗脫液洗脫后才能在收集到的樣品中發(fā)現(xiàn)待測(cè)蛋白（以及蛋白X）,說明待測(cè)蛋白與蛋白X可能有相互作用。用再提演將運(yùn)一直日復(fù)合悻 懿現(xiàn)下東,甘濟(jì);亍杵桐融合蛋白與宸折住上帶生的KhM*空白加與愛日工耳相互在r的If Far western blot (in vitro )Far wes

7、tern blot是基于western blot發(fā)展而來，其原理如下圖所示。將樣品蛋白用 非變性的PAGE膠分離，然后轉(zhuǎn)膜、封HRP）的待測(cè)蛋白的抗體反應(yīng),閉、洗膜，加入待測(cè)蛋白，使其與已在膜上的樣品蛋白進(jìn)行相互作用。接著加入帶有標(biāo)記（如 最后進(jìn)行顯色（如加入 HRP的底物），觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。1,用非受住PAGE將蜚自i 工擇品分離開與泳后的宣日道行轉(zhuǎn)臏工封閉腹用靜A或脫脂蝸 粉),送后洗膜將瞳與那F的底棱一起脖也得膜與目的范白的抗體如加入律楣素白，讓它育.迸行顯色.獲得結(jié)(含HRP標(biāo)記)-同進(jìn)行與已在腹上的進(jìn)果騰有行相互作用HF.?.肄根亡氧化物酶 免疫共沉淀(Co-IP) (in vivo)

8、免疫共沉淀是探測(cè)活體細(xì)胞內(nèi)蛋白間的相互作用的一門技術(shù)。它的原理是當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時(shí)，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白X的抗體免疫沉淀 X,那么與X在體內(nèi)有相互彳用的蛋白 Y也能沉淀下來。Co-IP的原理如下圖所示，首先從細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)，獲得蛋白提取液，并將其與抗體孵育，使抗體與蛋白 X結(jié)合。將預(yù)處理過的 protein G瓊脂糖珠(Sepharose )加入到抗體 與蛋白提取液的孵育液中反應(yīng)，使抗體與protein G結(jié)合。通過離心將瓊脂糖珠沉降到管底， 去除上清液，然后再用緩沖液將瓊脂糖珠沖洗數(shù)次，最后用 western blot (或SDS

9、) 進(jìn)行檢測(cè)。:、檢測(cè)蛋白質(zhì)與DNA相互作用 DNA foot printing (in vitro )DNA foot printing的原理如下圖所示。將DNA的一個(gè)3端用32P標(biāo)記，然后將DNA分成兩份，一份直接用DNase I進(jìn)行不完全酶切；另一份先與待測(cè)蛋白混合反應(yīng)一段時(shí)間，然后再用DNase I進(jìn)行不完全酶切。然后將兩份樣品用 變性的PAGE膠進(jìn)行電泳，觀察電泳結(jié)果。下圖中，由于待測(cè)蛋白與DNA結(jié)合的部位無法被DNase I酶切降解，因此它的電泳結(jié)果中與直接用DNase I進(jìn)行處理的樣品相比，會(huì)缺少一段；如果待測(cè)蛋白與DNA無相互作用，那么這兩組的電泳結(jié)果應(yīng)當(dāng)一致。 EMSAEMS

10、AIt 11 Jll liO特異至臺(tái)的墨白隔行市.冰可察室呆.3a喝記的片段(in vitro ),Electrophoretic Mobility Shift Assay,又稱凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)。其原理是與蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA在Native 膠（非變性膠）上比沒有結(jié)合蛋白的 DNA移動(dòng)速率要慢，因此通過電泳即可看到DNA的變化，如下圖所示。無曲口tnsnS Screen a Phage cDNA-library by DNA probe (in vitro )該方法又成為原位篩選法，用于檢測(cè)cDNA文庫中的蛋白與DNA探針之間的相互作用。其原理和實(shí)驗(yàn)流程如下圖所示，首先是用噬菌體（phage）侵染大

11、腸桿菌，然后將這些大腸桿菌涂到平板上。接著進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，將膜泡于IPTG水溶液中數(shù)小時(shí)，然后將該膜放于平板上，培養(yǎng)數(shù)小時(shí)（IPTG能誘導(dǎo)大腸桿菌表達(dá)文庫蛋白）。將膜取出，進(jìn)行變性、復(fù)性和封閉（過夜），然后與 放射性標(biāo)記的DNA探針進(jìn)行反應(yīng)，最后洗膜、晾干并用膠片曝光。如果膠片上出現(xiàn)了條帶，說明該文庫蛋白與DNA探針有相互作用；反之則說明兩者無相互作用。Phage cDHA-lIbrarv,彘導(dǎo)耙這：大胸桿菌的感染和爰白合成的誘導(dǎo)+轉(zhuǎn)膜：1PTG水溶液中浸泡硝酸纖維放射性標(biāo)記DN A探素膜放在平根上面，培養(yǎng)小時(shí)）針的制備含有噬茵斑的硝酸纖維素膜變性.復(fù)姓和封閉（過夜）結(jié)合反應(yīng)：將述膜放進(jìn)含有放射性標(biāo)記DNA探針的結(jié)合蝮沖液中，4T;下溫和振藩至少1小時(shí).+；光展后，晾干；膠片麟光酵母單雜交系統(tǒng)（in vivo ）酵母單雜交系統(tǒng)的原理與雙雜交一樣，不同的是它主要用于考察cDNA文庫中的蛋白與DNA （即特異的已知靶因子）是否有相互作用。其原理如下圖所示。首先需要構(gòu)建一段序列（黑框），它含有至少3個(gè)拷貝的特異的已知靶因子以及報(bào)告基因的序列。將該序列整合到酵母的基因組中，得到重組