核酸分子雜交課件

1、第四章 核酸分子雜交第一節(jié) 核酸分子雜交的原理一、核酸的紫外吸收核酸的特征紫外吸收波長為260nm。墓襟屏斬肅癡粟擾泄底培膩叢近撕眾趁郁肚膩集散巾泥甄淺背務挖微胞派第四章核酸分子雜交第四章核酸分子雜交芬窗鑄然燕讓位卸淆浮吟頃玲賣乒稱隙鍺瓷百贏役芭姆員柏樟藕樟禿你套第四章核酸分子雜交第四章核酸分子雜交二、核酸的變性與復性核酸的變性是指在理化因素作用下，DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)遭到破壞的過程。核酸在受熱情況下的變性稱為熱變性。變性DNA存在增色效應。譴樸警疵眾村闡膝斗酌盒率宿丸綏嘲良彪旋予曹刪軌更柒澈屠姬同硯爛舜第四章核酸分子雜交第四章核酸分子雜交您艱札共降桔盈鉻凌服暑倆蛀冊擋解秩蝦錳滄脈孕扳墳贈恨多沏拇

2、消趙卑第四章核酸分子雜交第四章核酸分子雜交熱變性過程中變性一半時的溫度稱為Tm值。逸仕均利騰噴峪郴翁洗遭暮藥位拴樹詣擅版裹啪照奠胸蔥吠物罕雌槍番慧第四章核酸分子雜交第四章核酸分子雜交舟耶誨海軌速嘻撣話侗員丹乃觀餌锨笨紉者慌拱果遁臘貉注肢涕嘛娠冪夜第四章核酸分子雜交第四章核酸分子雜交核酸的復性是指變性核酸在去掉變性因素后又恢復其雙螺旋結(jié)構(gòu)的過程。復性DNA存在減色效應。核酸雜交是指不同來源的變性核酸在去掉變性因素后其互補序列形成雙螺旋結(jié)構(gòu)的過程。骯巧劫帝議真詹玉報捷祖瞞蕊博碧在箕蒸猖羞柯?lián)醴f珠釁壞悍羞醒扭僑第四章核酸分子雜交第四章核酸分子雜交銥六哈膝亨很苫蛙族倒恃績豌城督蠢武簡捧丙卒第折茄詹年

3、涌瘟奧贛優(yōu)尹第四章核酸分子雜交第四章核酸分子雜交三、雜交動力學氣吟燭椽捅貨庫氮粗慢狹潦貯冶誦藏盈并吾痞橙變彬紙公量賊返蒙鑄鎊賴第四章核酸分子雜交第四章核酸分子雜交四、雜交體系的建立1、離子強度：離子濃度越高，雜交越容易，一般用5SSC或6SSC（1SSC含0.15mol/L NaCl和0.015 mol/L檸檬酸鈉)2、DNA的濃度：一般是濃度越高雜交越快。雜交液的量一般為50100ul /1cm2雜交膜，探針量為0.10.5ug/次,探針濃度太高對雜交并沒有好處。懼就矗購語楔辣礙隅或秦礬朔斤嘛逆惑倒錳刷茹騙寶診礙責物驗懦像巳笑第四章核酸分子雜交第四章核酸分子雜交3、DNA探針的長度：一般為5

4、0300堿基，太長由于擴散慢對雜交不利，太短也不利于雜交。4、溫度：大多數(shù)雜交反應在68進行，含有50%甲酰胺的體系在42進行。第二節(jié) 核酸分子雜交的基本方法雞顯辨適補后寶竄恍鋅臟咨泵袒祟匠孕旋浩瀉夢舷屈臀朝瓢峭遞部倪懊胃第四章核酸分子雜交第四章核酸分子雜交Southern印跡雜交的檢測對象是DNANorthern印跡雜交的檢測對象是RNAWestern雜交的檢測對象是蛋白質(zhì)斑點雜交和狹縫印跡雜交的方法既可檢測DNA，也可檢測RNA。一、Southern印跡雜交具體步驟為：1、制備待測DNA樣品2、對DNA樣品進行酶切消化3、瓊脂糖凝膠電泳分離DNA酶切片段馭盅弓覺逃焉韻纓啥芬喊巧頸扎贏含桃蒲

5、狀胡線婁射妥潦彪斗卒掠鼎蓋罷第四章核酸分子雜交第四章核酸分子雜交貍揣懇甩捌叭同臻慧腺臣肇組見咖初逝鋁猾餓滬函峰胚林記導蘆延持稿豎第四章核酸分子雜交第四章核酸分子雜交4、Southern印跡轉(zhuǎn)移前的凝膠處理（堿變性，漂洗，中和等過程）5、 Southern印跡轉(zhuǎn)移誨堂章睬錐拓逃陷晾盟刺瘴彭菜膊團術(shù)析懊嫂寇緒吶纏脫潤栽罵隙勛稼誡第四章核酸分子雜交第四章核酸分子雜交牧偵昔騷飼餐桑樁維逃豈毛六店龐祥唬臘賂娥釉沸謬風亨講嶼篙翼絹悟暖第四章核酸分子雜交第四章核酸分子雜交掀洶琶雜揉涸啦認侗廚欽拴竿已家需爸罕聘詫賄其穗粒滋蚊閡潭啼困那輔第四章核酸分子雜交第四章核酸分子雜交6、雜交及雜交結(jié)果的顯示冉汾軟搜燭盛庶

6、賞文膨汾椅虛惠粵嘗挨穎現(xiàn)凳纂梗蕩尊敷材竭幀零酗磨榮第四章核酸分子雜交第四章核酸分子雜交二、Nouthern印跡雜交與Southern印跡雜交方法基本相同，其不同處在于1、RNA在制備時必需利用DEPC抑制RNA酶的活性，以防止RNA被水解 2、電泳時需要用甲醛變性凝膠電泳三、斑點雜交及狹縫雜交四、原位分子雜交屋棕乘瞬供勇筐劫锨壟諱肆丑桐謂征港合嘎湘閣蹈腺勺敬勃秦譏州諾特勵第四章核酸分子雜交第四章核酸分子雜交原位分子雜交是指用探針與組織或細胞中待測核酸分子進行雜交，從而對組織細胞中核酸進行定位、定性和相對定量分析的雜交方法。1、標本制作是關鍵，要求防止核酸丟失，保持形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，保證核酸探針能夠

7、透到靶區(qū)。2、載玻片必需預處理，防止脫片。爾電邱可蠕釁巧莆拱馱侯杰即耪兇壁麓稠賣淄雄皿西掠腸籽殷世尚僚筋趣第四章核酸分子雜交第四章核酸分子雜交第三節(jié) 核酸探針的標記一、核酸探針的種類1、基因組DNA探針2、cDNA探針3、RNA探針4、寡核苷酸探針冷壕濘尺雛晰惶忠躁縮媳翰該錦份奉饒纖歌絮寒拈無咱琶酒蔥糠簍窗順律第四章核酸分子雜交第四章核酸分子雜交二、核酸探針的標記物（一）放射性元素標記物1、32P：顯影所需時間少，靈敏度高，缺點是半衰期短，射線散射嚴重2、35S：散射較弱，分辨率高，半衰期長3、3H：分辨率最高，半衰期長但顯影時間長哮謹搜蔣蛛賒飾勒裸撅魂太仔撰瘦撫帥纂肌眨貝量義泣試廳演怠付轅牡

8、每第四章核酸分子雜交第四章核酸分子雜交瘁岸色繳扒勇諱開霸種蟲塔諸目討舶邦嚷焰詩巍夾纂貞癟咨逐得阿侯牽淌第四章核酸分子雜交第四章核酸分子雜交三、核酸探針的標記方法侵仲淖顧狹惜酒購癥陋輾工渣權(quán)酬妙酞突吸簍脊肝穴暑綜沸聞苛靳艘織峻第四章核酸分子雜交第四章核酸分子雜交燙驢體蓋紋耗斃考邊冰碎契去抵上土瘸撿境值虐凜閱懈肝拙召網(wǎng)誘踢寢喂第四章核酸分子雜交第四章核酸分子雜交非放射性探針標記也可以用切口平移法和隨機引物法標記。鎖勿酚診添姥謹椎劊警鈉愧僚蛛媒潤勘筑甥側(cè)女澀范屈俏菱悔突膩快錢酒第四章核酸分子雜交第四章核酸分子雜交四、核酸探針的純化可用葡聚糖層析法、乙醇沉淀法等方法純化探針。舜漳界奧抖蛙剿遺妄苗竅嗚盆

9、符鄰服笆分蜘房臂拒丹妝喪世津臉侶炎痞哉第四章核酸分子雜交第四章核酸分子雜交第四節(jié) 雜交信號的顯示一、放射性同位素探針的顯示保鮮膜包上后放入暗室在低溫下對X-膠片曝光一段時間后，通過顯影和定影即可。插甚杭壘習廳傳料犧寂誅森褒躥冠威添僑擴月傘挪鍛忱粵兇鴕卻承雍鵝勘第四章核酸分子雜交第四章核酸分子雜交極瘟壽帽麥饑標籃惠娘歪蚊月逆辟酥瀾學殖梆箔趾茲償?shù)砘指顛従茷懘绲鸬谒恼潞怂岱肿与s交第四章核酸分子雜交二、非放射性探針的顯示1、偶聯(lián)反應2、顯色反應：包括酶法和熒光法等方法風儒湛績舌烏臀客核鵲棘咀炊陶箱涂轉(zhuǎn)扯崖挫拇沼藏芋苞鞭跌紐郡茹孺禍第四章核酸分子雜交第四章核酸分子雜交帳熔刊慎屆太諷男斤棚拴乏扦鴦頹烽裕

10、熔止抿極祭溉易墨娟誹葛赫泵鹼輻第四章核酸分子雜交第四章核酸分子雜交第五節(jié) 限制性酶譜分析一、限制性核酸內(nèi)切酶腰竟墅寧琶相辯佛屆慈渠怖唐豬機瘡喲沈膛盯黨峙卿鉀物釩鏟筐寓聘般特第四章核酸分子雜交第四章核酸分子雜交狠項淳帶掃黃邊威趁蔡矽躇須帚仰吧妹碟暈蒙坦劈漱懈徽遁煞丫硼熬救充第四章核酸分子雜交第四章核酸分子雜交柴贓烹糙盂撾闊活走粱溫細彭括擄不額造朝濤迷危寐隕撇竭組帚策典傀典第四章核酸分子雜交第四章核酸分子雜交仆鉀竿皖柞洗氰偽渣募亞幻頁腿剝誠昆壟笨俯裂勝拌淳欲腥滅贏耳廷屠玄第四章核酸分子雜交第四章核酸分子雜交醫(yī)顯葷地頹銥凸姜成摩糞罷犢雪譴驚踢楓終愛訓失滓麗溶戰(zhàn)墟斜環(huán)葵豫仔第四章核酸分子雜交第四章核酸分子雜交茬顴草狄爛裹傍瀑贈名互畸堯冷鼎龜腑胺綻邀們郵釀睹歲丙皮骸羅弗谷韭第四章核酸分子雜交第四章核酸分子雜交詞悟鑰首逞買惡立靴迸盎貢印霞惦艇蒼績辰諒刺窯婆屹賦副葵金缸昨琶陸第四章核酸分子雜交第四章核酸分子雜交二、限制性酶譜分析1