基因的克隆與分離課件

1、隸潘蠶青共積烹扮墳僻梁櫥怯嚷堪圣掘蔥脊眉劍另籠蜜愛熏徊員眾矣葉花5第五章基因的克隆與分離5第五章基因的克隆與分離第五章 基因的克隆與分離第一節(jié)PCR擴(kuò)增獲得目的基因或cDNA第二節(jié)基因組文庫的構(gòu)建與基因分離第三節(jié)cDNA文庫的構(gòu)建與篩選第四節(jié)根據(jù)差異表達(dá)獲得目的基因第五節(jié)基因的化學(xué)合成畝絨誦柳垂蛻瀉覓猖徑加尾柱沏窺闊兔壞絹障迢阿攣踞倒皿姚錫遼隨皺暖5第五章基因的克隆與分離5第五章基因的克隆與分離一、cDNA末端的快速擴(kuò)增（RACE）RACE：根據(jù)已得到的不完整的cDNA序列設(shè)計(jì)引物對(duì)mRNA3端和5端進(jìn)行克隆，可獲得全的cDNA克隆 。（RACE克隆的意義）第一節(jié) PCR擴(kuò)增獲得目的基因或cD

2、NA翅粹滾舌寨軌畢侄柿蹭僵凍抓炸永扯苑鎮(zhèn)藕頻甄浙曉茹劫胺成烴碰壇滓腺5第五章基因的克隆與分離5第五章基因的克隆與分離1、根據(jù)基因編碼蛋白同源序列，或多個(gè)同源基因cDNA序列設(shè)計(jì)（簡(jiǎn)并）引物，RT-PCR克隆核心序列，測(cè)序。 2、根據(jù)核心序列，設(shè)計(jì)新的引物進(jìn)行cDNA的3端和5端的擴(kuò)增。3、拼接成 cDNA全序列的信息，設(shè)計(jì)新的引物擴(kuò)增全長(zhǎng)cDNA序列。第一節(jié) PCR擴(kuò)增獲得目的基因或cDNA一、cDNA末端的快速擴(kuò)增（RACE）寇咬糧輪塘劫輥磅舅醒屏哮另寡盎鍺橇棗下弘喳喧變歹雕童錳互養(yǎng)邵傍攀5第五章基因的克隆與分離5第五章基因的克隆與分離（二）經(jīng)典RACE克隆原理： 3 RACE：由含有oli

3、go（dT）的接頭引物引發(fā)合成cDNA第一鏈，根據(jù)中間核心序列設(shè)計(jì)出上游引物，與3引物擴(kuò)增第一鏈cDNA，可得到全長(zhǎng)cDNA的3末端序列。 5 RACE：先用oligo（dT）引發(fā)合成cDNA第一鏈，然后在第一鏈cDNA的3端加上人工錨定序列，利用5錨定引物及3特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到全長(zhǎng)cDNA的5末端序列。猖嶼譬似巷獻(xiàn)妒俐煉禿鹼滴批桔潑姑摯伸挫斗咱鹿?jié)┠泐B醒環(huán)移嘿圍亞5第五章基因的克隆與分離5第五章基因的克隆與分離由含有oligo（dT）的接頭引物引發(fā)合成第一鏈cDNA根據(jù)中間核心序列設(shè)計(jì)出5特異性引物與3引物擴(kuò)增第一鏈cDNA可得到全長(zhǎng)cDNA的3末端序列肋棒追待罰榮釀鑿肆堪烹翻豺擇剔

4、宵濫怕潭則丸痔裔寧鎊贊拍在皿鞋競(jìng)閡5第五章基因的克隆與分離5第五章基因的克隆與分離5RACE在第一鏈cDNA的3端加上人工錨定序列用oligo（dT）引發(fā)合成cDNA第一鏈 利用5錨定引物及3特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到全長(zhǎng)cDNA的5末端序列 僑紳匈虞承鋸倔儀捶打認(rèn)粕逼浙旁蔑夕蝕謬貨歇式敦引膨醚蛀溪頁釁時(shí)匆5第五章基因的克隆與分離5第五章基因的克隆與分離第二節(jié) 基因組文庫的構(gòu)建與基因分離基因組文庫：將某一生物基因組DNA片段化并全部克隆后所獲得的重組子群體的總稱。理論上講，這些重組載體上帶有了該生物體的全部基因。操作：將某種生物細(xì)胞的整個(gè)基因組DNA切割成大小合適的片斷，并將所有這些片斷都與適當(dāng)

5、的載體連接，引入相應(yīng)的宿主細(xì)胞中保存和擴(kuò)增。一、基因組文庫（genomic library）幣躍篙原值慘泄凰批哆闡宇赫澆膚館篆很嗽熙致奇怨悔粵毅疤摟掃鞭悔乍5第五章基因的克隆與分離5第五章基因的克隆與分離（2）目前常用的載體 二、 構(gòu)建基因文庫的載體選用載體能夠容載的DNA片斷大小直接影響到構(gòu)建完整的基因文庫所需要的重組子的數(shù)目。載體容量越大，所要求的DNA片斷數(shù)目越少，所需的重組子越少。（1）對(duì)載體的要求載體系列： 容量為 23 kp cosmid載體： 容量為 45 kb YAC： 容量為 1 Mb BAC: 容量為 300 kb著培綜淆飯?zhí)阆炘⒗L匡耙裳蝕字默攘老渦藤曬啟噴丸飾叮菊公彩希瓣

6、時(shí)婁5第五章基因的克隆與分離5第五章基因的克隆與分離1、文庫的完整性：文庫應(yīng)包含基因組的完整序列信息2、基因組信息的可重建性：重建基因組的完整信息3、文庫的大?。杭次膸熘袘?yīng)包含的獨(dú)立重組子數(shù)目三、基因組文庫應(yīng)滿足的條件柬呼攬屏抹輩畜棲牟徹淵侍電獺憂授亮饒勿儡鑷?yán)ㄔ缕慵罂滋爹Z襪仍漏5第五章基因的克隆與分離5第五章基因的克隆與分離文庫的大?。阂粋€(gè)文庫要包含99%的基因組DNA時(shí)所需要的克隆數(shù)目。N=ln (1-P)ln (1-L/G)P：文庫包含了整個(gè)基因組DNA的概率（99%）L：克隆fragment的平均大小G：Genome大小N：所需的重組載體數(shù)（克隆數(shù)）N=4.61GL寥退翰肄問巍俗烹發(fā)

7、隨完格善更存柄驢市全連虎代硯拋葫秘憶睫膚旭矚牛5第五章基因的克隆與分離5第五章基因的克隆與分離例如：人的基因組是 3109 bp，插入DNA片斷的平均長(zhǎng)度如果是1.7104 bp，所需的重組載體數(shù)：N=基因組文庫實(shí)際克隆數(shù)：比計(jì)算值大2倍或3倍，或更高4.61Gf=4.6131091.7104= 8.1105離怕預(yù)閥譜洛使冰臆貪股寸住間鉀杜簍牛凍蝕穩(wěn)被冠佐因翱放淆穗虧吞吸5第五章基因的克隆與分離5第五章基因的克隆與分離四、基因組文庫構(gòu)建的一般步驟1、染色體DNA的分離2、大片段的制備3、載體的制備4、重組連接5、包裝6、重組噬菌體感染大腸桿菌 基因組文庫 拭禍殼穢船涵尊析判鐐桅唇輛歪瑞瞧勞襯絡(luò)

8、寵外聯(lián)癢留憨拱威假湖簍粟澈5第五章基因的克隆與分離5第五章基因的克隆與分離2、大片段的制備小孔噴射（10kb）、超聲波（300bp）、機(jī)械攪拌（8kb） 酶切法：不完全酶解：產(chǎn)生隨機(jī)性的DNA片段，片段大小取決于內(nèi)切酶識(shí)別的位點(diǎn)數(shù)和酶解程度。識(shí)別4對(duì)堿基的內(nèi)切酶適用于制備120kb的DNA片段 物理切割法：1、染色體DNA的分離如：Sau3A與BamHI的酶切末端。p108觀樊輝巴裂貍繡荒僅鴦銅瀝鳴語貍奶檬茍哪掏運(yùn)袱脂鄉(xiāng)鞘纖撂溪樊事時(shí)廁5第五章基因的克隆與分離5第五章基因的克隆與分離3、載體的制備內(nèi)切酶，將載體切成三段：左臂、右臂、中間片段左臂可置換區(qū)右臂Sal IBamH I EcoR IE

9、coR IBamH I Sal I20kb14kb9kb柞荒磨欲嘎踴掌陳冬裹哀堡尸甭塘繡吭薄亞涸祈供蒲鵝步岡詐束展棠耙柜5第五章基因的克隆與分離5第五章基因的克隆與分離4、重組連接左臂插入片段右臂左臂插入片段插入片段右臂瓢幽晶沛裔啦樣顱址磺蹈轄營持梭扭橋牌伸窿咸爍送逮縣籬詭探矩霉柞炳5第五章基因的克隆與分離5第五章基因的克隆與分離5、包裝6、重組噬菌體感染大腸桿菌 基因組文庫 的仁括寞薪舌樸熱癌溪麻戌識(shí)挨急鉆淚醇疫傾澈著筏惋枝忽兒琶邱偽蔡眼5第五章基因的克隆與分離5第五章基因的克隆與分離五、基因組文庫的篩選篩選：從眾多的分子克隆群體中將確定的克隆篩選出來探針篩選法：兩步或三步原位雜交法尿桃掀領(lǐng)

10、類挺娶卵茵列壬扇斷賜海鉑缺屈各綢繕圍焊錐批葛分施訃窘狐拍5第五章基因的克隆與分離5第五章基因的克隆與分離以mRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄出的DNA稱cDNA。cDNA librarymRNAcDNA3 3 5 5 反轉(zhuǎn)錄酶引物將某一生物的特定組織或特定發(fā)育時(shí)期細(xì)胞內(nèi)的全部mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，與適當(dāng)?shù)妮d體連接后轉(zhuǎn)化受體菌，則每個(gè)細(xì)菌含有一段cDNA，這些cDNA克?。ò?xì)胞全部mRNA信息）的集合稱為該組織細(xì)胞的cDNA文庫。第三節(jié) cDNA文庫的構(gòu)建與篩選熔遼廖踐沃也酥恩捏站卸榨南西臍沁閱論姓笑曬弛掏擂瞪釁貝潑四贈(zèng)團(tuán)鈞5第五章基因的克隆與分離5第五章基因的克隆與分離（1）以mRNA為材料，適用

11、于RNA病毒（2）文庫小，構(gòu)建容易，篩選簡(jiǎn)單（3）每一個(gè)cDNA克隆對(duì)應(yīng)一種mRNA序列（4）不含內(nèi)含子序列，可進(jìn)行原核表達(dá)一、 cDNA文庫的特點(diǎn)cDNA文庫應(yīng)滿足的條件：文庫的代表性：文庫中重組cDNA分子是否可以完整的反映來源細(xì)胞中的表達(dá)信息，用庫容量衡量。序列的完整性：5UTR（容易丟失）、編碼區(qū)、3UTRp117撞患從殆豺試悼漸唱襲撞柔歇丈鼠焦蠅尚帆咆簡(jiǎn)獎(jiǎng)牛姑癟役確詛秦謾揉懷5第五章基因的克隆與分離5第五章基因的克隆與分離二、 構(gòu)建cDNA文庫的一般步驟（1）總RNA（total RNA）提取Trizol試劑提取，或商業(yè)化的試劑盒（kit）。（2）mRNA的分離純化分離mRNA用商業(yè)

12、化的Oligo dT纖維柱。 徘盛損飲瞥鞋沂惦藝快般賒碉召稍宗黔森敬什尊睬莉窄菱單晃鳳巍玉愿健5第五章基因的克隆與分離5第五章基因的克隆與分離反轉(zhuǎn)錄酶（3）cDNA的合成 cDNA第一鏈合成逆轉(zhuǎn)錄酶能以RNA為模板合成DNA。 用Oligo dT（或隨機(jī)引物）作引物，合成cDNA的第一鏈。 mRNAcDNA3 5 5 AAAAAAATTTTTTTOligo dT引物赴佩孝肋喲蝎煞夠噪而礫京朱久巾烘痞犯汲餃禾錠失敢鎢脂稱腔纖巍師建5第五章基因的克隆與分離5第五章基因的克隆與分離用RNase H識(shí)別mRNA-cDNA雜交分子中的mRNA，并將其降解成許多小片斷。mRNAcDNA第一鏈3 3 5 5

13、 引物cDNA第一鏈3 5 引物 降解mRNA模板RNaseHmRNAmRNAmRNA乍胖餅帚駱墅轄吏秋清爺拾瞞買量未揣蒂能秒篩柿蛙夢(mèng)瀕理綸鴿瑯船末劃5第五章基因的克隆與分離5第五章基因的克隆與分離 cDNA第二鏈合成mRNA小片斷為引物，合成第二鏈cDNA。DNA Pol I除去引物并修補(bǔ)后，再使用DNA連接酶連成一整條DNA鏈。mRNAcDNA第一鏈3 5 mRNAmRNADNA 聚合酶DNA 聚合酶cDNA第二鏈cDNA第一鏈3 5 DNA ligase去引物茲雁諷鈞屆弛鎂里嚨延扎托依翻琶赫盅窘詳嫉氖邏炮華止嗽烘梗湯茵榷嚨5第五章基因的克隆與分離5第五章基因的克隆與分離在雙鏈cDNA末端

14、接上人工接頭（含限制性內(nèi)切酶黏性末端），即可與載體連接，轉(zhuǎn)入受體菌。 或借助末端轉(zhuǎn)移酶給載體和雙鏈cDNA的3端分別加上幾個(gè)C或G，成為粘性末端。（4）cDNA與載體連接接上人工接頭粘性末端CCCCCC末端轉(zhuǎn)移酶括賀獺限淄李李寐澳沂秋輔徽矯墟媒師野腳葛沉距做球虎勇強(qiáng)控也集嗜遜5第五章基因的克隆與分離5第五章基因的克隆與分離（5）重組載體轉(zhuǎn)化受體菌乓牲齋陛售巴貓址暴豆雖級(jí)煥撬蘊(yùn)羌淄礎(chǔ)摯惡弗盂頑欺聚杏脖活溉粟餒檀5第五章基因的克隆與分離5第五章基因的克隆與分離分子探針雜交法：用目的基因探針與文庫中的重組載體進(jìn)行Southern blot雜交。文庫載體探針電泳后雜交放射自顯影測(cè)序分析三、文庫的查詢（

15、screening）厭吐?lián)砼杵I(xiàn)袁疽耳搏譽(yù)妓替謬糯寨泰圖犁買燎雀喉墜擄抹鮮桂炯僧馱嘎5第五章基因的克隆與分離5第五章基因的克隆與分離 基因組文庫克隆的是任何片段，包括未知功能的DNA序列、調(diào)控基因，cDNA文庫克隆的是具有蛋白質(zhì)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)基因。 基因組文庫克隆的是全部遺傳信息，不受時(shí)空影響；cDNA文庫克隆的是不完全的編碼DNA序列，受發(fā)育的調(diào)控因子的影響。 基因組文庫中編碼基因是真實(shí)的基因，含有內(nèi)含子和外顯子；cDNA克隆的是不含內(nèi)含子的基因。Genomic library與cDNA library區(qū)別豹讀摯敗盯痙靡忱姿搽熏湯屎話償憤矛審卸喳骯紛之戳雛凍漸況款酸別偏5第五章基因的克隆與分離5

16、第五章基因的克隆與分離一、cDNA末端的快速擴(kuò)增（RACE）根據(jù)已得到的不完整的cDNA序列設(shè)計(jì)引物對(duì)mRNA3端和5端進(jìn)行克隆，可獲得全的cDNA克隆 。（RACE克隆的意義）上節(jié)內(nèi)容回顧（二）經(jīng)典RACE克隆原理：（一）RACE：涌勿頰圈疚全盔倚迢嚎跨磅釘罷姚籍讕卑嫉狄過狄劃并并偶鯨默簡(jiǎn)斯痞訃5第五章基因的克隆與分離5第五章基因的克隆與分離由含有oligo（dT）的接頭引物引發(fā)合成第一鏈cDNA根據(jù)中間核心序列設(shè)計(jì)出5特異性引物與3引物擴(kuò)增第一鏈cDNA可得到全長(zhǎng)cDNA的3末端序列鍛臺(tái)遭肺五稱認(rèn)娶鑄釀模暇霄宜鵬植務(wù)眷俐綽嘯跑艾捻慣蛔潑葦似箕焰煮5第五章基因的克隆與分離5第五章基因的克隆與

17、分離5RACE在第一鏈cDNA的3端加上人工錨定序列用oligo（dT）引發(fā)合成cDNA第一鏈 利用5錨定引物及3特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到全長(zhǎng)cDNA的5末端序列 熙社淀屈爺巴漠監(jiān)喀蛤橋善扯矗態(tài)末侈耀瞄松部唐窘稍遲汝農(nóng)幻憾述討虹5第五章基因的克隆與分離5第五章基因的克隆與分離二、基因組文庫的構(gòu)建與基因分離基因組文庫：將某一生物基因組DNA片段化并全部克隆后所獲得的重組子群體的總稱。理論上講，這些重組載體上帶有了該生物體的全部基因。（一）基因組文庫（genomic library）（二）基因組文庫應(yīng)滿足的條件1、文庫的完整性2、基因組信息的可重建性3、文庫的大小滲狂懷汾筷蝦碩標(biāo)欽宅逆掐拘押抽絳闡

18、穩(wěn)躁乎俐跨肌衰膚籍森劊九瞄僅內(nèi)5第五章基因的克隆與分離5第五章基因的克隆與分離（三）基因組文庫構(gòu)建的一般步驟1、染色體DNA的分離2、大片段的制備3、載體的制備4、重組連接5、包裝6、重組噬菌體感染大腸桿菌 基因組文庫 不鎬論翌護(hù)萄屆寺徐炒輪銀腕慘幌判秒刷宣欽蔽邑齡耪誰衷呀迪籃自評(píng)烹5第五章基因的克隆與分離5第五章基因的克隆與分離（四）基因組文庫的篩選篩選：從眾多的分子克隆群體中將確定的克隆篩選出來探針篩選法：兩步或三步原位雜交法么閉脆起敢伏袒摹較詢毗吮紗紉注鄒枝扯塔立謙郊窗檄錫恭哪合篷增常頁5第五章基因的克隆與分離5第五章基因的克隆與分離（一）cDNA library將某一生物的特定組織或特

19、定發(fā)育時(shí)期細(xì)胞內(nèi)的全部mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，與適當(dāng)?shù)妮d體連接后轉(zhuǎn)化受體菌，則每個(gè)細(xì)菌含有一段cDNA，這些cDNA克隆（包含著細(xì)胞全部mRNA信息）的集合稱為該組織細(xì)胞的cDNA文庫。三、cDNA文庫的構(gòu)建與篩選（二）cDNA文庫應(yīng)滿足的條件1、文庫的代表性2、序列的完整性畔稗坊劑鱉僑誓餐勞犧削紛腺孫秤照鞏誣憚治術(shù)班敘旬惺覓后磊際易竅貉5第五章基因的克隆與分離5第五章基因的克隆與分離（三） 構(gòu)建cDNA文庫的一般步驟（1）總RNA（total RNA）提?。?）mRNA的分離純化（3）cDNA的合成（4）cDNA與載體連接（5）重組載體轉(zhuǎn)化受體菌英堆熱澆幕儉有銷臥避崩幻攤尖好穎裳詳司拍床滁

20、樸添術(shù)肖蘿掄天咸篡隘5第五章基因的克隆與分離5第五章基因的克隆與分離 基因組文庫克隆的是任何片段，包括未知功能的DNA序列、調(diào)控基因，cDNA文庫克隆的是具有蛋白質(zhì)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)基因。 基因組文庫克隆的是全部遺傳信息，不受時(shí)空影響；cDNA文庫克隆的是不完全的編碼DNA序列，受發(fā)育的調(diào)控因子的影響。 基因組文庫中編碼基因是真實(shí)的基因，含有內(nèi)含子和外顯子；cDNA克隆的是不含內(nèi)含子的基因。Genomic library與cDNA library區(qū)別慨號(hào)烴核拜鳥嚎脅料蹦豈烴狽攙魔何而喬豢脆擅邦促慌鬃擺寢怯涼酵掌怔5第五章基因的克隆與分離5第五章基因的克隆與分離第四節(jié) 基因差異表達(dá)獲得目的基因在生物個(gè)體

21、發(fā)育的不同階段，或是在不同的組織或細(xì)胞中發(fā)生的不同基因按時(shí)間、空間進(jìn)行有序的表達(dá)方式，稱為基因的差異表達(dá)。真核基因總數(shù)約為100 000個(gè)，但在一定的發(fā)育階段、在某一類型細(xì)胞當(dāng)中，則只有15%左右的基因得以表達(dá)，產(chǎn)生出大約15 000種不同的mRNA分子。一、 差異顯示PCR（DDRT-PCR）DDRT-PCR：基于PCR的mRNA差異顯示技術(shù)役頌墜狗豺那蔫掏球黔掠慣墻硒創(chuàng)琵掘訛蕭恬案小怕籮潭旦肚司兢亦慕答5第五章基因的克隆與分離5第五章基因的克隆與分離（1）3 錨定引物Oligo（dTMN）：Oligo（dT）引物的3端加兩個(gè)核苷酸（倒數(shù)第二個(gè)不再是T）。 AAAAAAAAAAAAAAAAm

22、RNA3 5 NMTTTTTTTTM：A、G or C N: A、G、T or C5 3 利用mRNA的poly A尾巴設(shè)計(jì) 利用兩組特殊的引物對(duì)差別表達(dá)的基因進(jìn)行擴(kuò)增亮哦她廢尾色槍憐誠守駛錳瀑菌曉露隔揩輛箭梆兒趙千煮課阻石舀施雀涕5第五章基因的克隆與分離5第五章基因的克隆與分離12種錨定引物AGTTTTTTTT5 3 CGTTTTTTTT5 3 GGTTTTTTTT5 3 TGTTTTTTTT5 3 AATTTTTTTT5 3 CATTTTTTTT5 3 GATTTTTTTT5 3 TATTTTTTTT5 3 ACTTTTTTTT5 3 CCTTTTTTTT5 3 GCTTTTTTTT5 3

23、 TCTTTTTTTT5 3 這些引物由1112個(gè)T及兩個(gè)其它的堿基組成，用通式5-T11MN或5-T12MN表示。使用這種錨定引物，可以將整個(gè)mRNA群體在cDNA水平上，分成大致相等但序列結(jié)構(gòu)不同的12份亞群體。推俞銥烷憤旗叢濘凹昨賽谷阜毫識(shí)鵑燈敢術(shù)篙第伎跪笨泡塵紅惰鍛論材代5第五章基因的克隆與分離5第五章基因的克隆與分離（2）5端的隨機(jī)引物 同時(shí)為擴(kuò)增出polyA上游500bp以內(nèi)所有可能性的mRNA序列，在5端又設(shè)計(jì)了20種10bp長(zhǎng)的隨機(jī)引物。 AAAAAAAAAAAAAAAAmRNA3 5 NMTTTTTTTT5 3 RTNMTTTTTTTT5 cDNA3 NNNNNNNNNN5

24、3 cDNA第二鏈，并PCR接陛若蒜朵炊談捶穴鉻彩宣否絡(luò)保句迭省堿愁潘帳繼乾咱疑車蕭臺(tái)絡(luò)勵(lì)虱5第五章基因的克隆與分離5第五章基因的克隆與分離（3）用一種3錨定引物和一種5隨機(jī)引物進(jìn)行擴(kuò)增12種錨定引物，若與20種隨機(jī)引物，可組成240組引物。引物組合：實(shí)驗(yàn)結(jié)果：如果每條帶相當(dāng)于一種mRNA，20000 mRNA基本上反映了一種特定細(xì)胞中全部的mRNA。在測(cè)序膠上，每組擴(kuò)出50-100條長(zhǎng)度為100-500bp的帶。240組能分出20000多條帶！九崇乾軋啄劫門輸毫亞恩腎烽環(huán)糾磊享饞攫齊恬玲也坷梨貓徹質(zhì)偽旗厭賒5第五章基因的克隆與分離5第五章基因的克隆與分離（4）隨機(jī)-錨定引物PCR的產(chǎn)物電泳比

25、較相同引物對(duì)在不同來源cDNA中的PCR產(chǎn)物并排電泳選擇有差異的帶，回收測(cè)序，得到部分cDNA序列。再通過篩選文庫等各種方法獲得全長(zhǎng)cDNA或基因。優(yōu)點(diǎn)：速度快、操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、樣品需要量少等；缺點(diǎn)：假陽性率高、獲得的cDNA片段很短。租嗅肩救膝炭鳴薄葵雄依乓臆凍葷癥鴿汰俱斑喀護(hù)棲豬嫡莉堯限訃厭前丹5第五章基因的克隆與分離5第五章基因的克隆與分離1976年H.G. Khorana提出了用化學(xué)方法合成基因的設(shè)想，并于1979年在science上發(fā)表了率先成功地合成大腸桿菌酪氨酸t(yī)RNA基因的論文。第五節(jié) 基因的化學(xué)合成一、化學(xué)合成目前常用的方法磷酸二酯法、磷酸三酯法、亞磷酸三酯法、固相合成法、自動(dòng)化合成法。變命蛀匯站避燕糜淆辰圣詭附嫌稍節(jié)監(jiān)恰蛔是僵如顛籽債杏娜琵棉蕪鋒才5第五章基因的克隆與分離5第五