關(guān)于抗菌材料的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)-楊茜

1、根據(jù)上海市第九人民醫(yī)院院感科出示的細(xì)菌藥敏檢測報(bào)告，院內(nèi)感染目前最常見的病原菌為：銅綠假單胞菌，鮑曼不動(dòng)桿菌，肺炎克雷伯菌，金黃色葡萄球菌、白色念珠菌以及大腸桿菌。（按順序，標(biāo)本以痰液、分泌物以及血液為主）物理性能測試：力學(xué)性能測試：將干態(tài)和濕態(tài)的樣品按GB/T634-1996切成標(biāo)準(zhǔn)樣條，在美國Instron5567萬能力學(xué)試驗(yàn)機(jī)上測定試樣的拉伸強(qiáng)度。吸水率的測試、相對保濕率的測試：參照文獻(xiàn)1。透氣率的測試：參照文獻(xiàn)2?？紫缎蚊灿^察：將試樣充分干燥后，在掃描電鏡上觀察海綿的孔隙結(jié)構(gòu)，加速電壓為10kV。表面形貌測試：掃描電鏡測定（包括細(xì)菌被破壞前和破壞后的形態(tài)）細(xì)胞毒性測試：1、以成纖維細(xì)胞

2、測試方法一：選用L929小鼠成纖維細(xì)胞進(jìn)行毒性試驗(yàn)：設(shè)置空白組，對照組，實(shí)驗(yàn)組。37C下，將材料分別浸沒在培養(yǎng)基中過夜，種植細(xì)胞濃度為2.5x109L-1的L929細(xì)胞20pL（達(dá)到5x104細(xì)胞/孔），平行數(shù)為5,分別培養(yǎng)1,3,7,14d后將培養(yǎng)基小心地從培養(yǎng)板移除。用PBS沖洗3遍，每個(gè)孔加入400pL的培養(yǎng)基,然后在無光下再添加100pL的5g/L的MTT/PBS溶液。用鋁箔將培養(yǎng)板裹緊，37C下孵化4h；用移液管移除培養(yǎng)基和MTT，每個(gè)孔添加200pL二甲基亞砜，混合幾分鐘；從每個(gè)孔移除100pL混合液，加入96孔板中；在490nm波長下，用ELISA對孔板的溶液進(jìn)行檢測，記錄吸光度

3、值。方法二：選用L929小鼠成纖維細(xì)胞進(jìn)行體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞培養(yǎng)、傳代與計(jì)數(shù)：傳代培養(yǎng)48h后，棄去培養(yǎng)液，在生長旺盛的L929細(xì)胞加入0.25%胰蛋白酶（pH7.8）液于37C消化2.03.0min，棄去消化液，加入RPMI1640液以吸管反復(fù)吹打，使細(xì)胞分散均勻，制備成6x107L-1濃度細(xì)胞懸液。細(xì)胞形態(tài)觀察及分析標(biāo)準(zhǔn)：將空白組（RPM11640培養(yǎng)液），實(shí)驗(yàn)組，對照組6.4%苯酚溶液）各3mL,分別置于35mm細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)，加入6x107L-1濃度L929細(xì)胞懸液3mL,置于37C、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2、100%濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h及72h，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及生長情況，

4、細(xì)胞形態(tài)分析標(biāo)準(zhǔn)如下：細(xì)胞形態(tài)分析標(biāo)準(zhǔn)：毒性細(xì)胞形態(tài)無毒形態(tài)1E常，呈按形或不規(guī)則三角形，貼壁生長良好輕度貼壁生長好.可見少數(shù)細(xì)胞圓縮，偶見懸浮細(xì)胞中度貼壁生長不佳.細(xì)胞圓貓達(dá)1/3以上，見懸浮死細(xì)胞重度基本不貼壁，90%以上為懸浮死細(xì)胞注：MTT比色法：參照ISO10993.5-2009進(jìn)行。具體步驟：將濃度為6x10/L-1的細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100pL,置于37C、含體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h，觀察細(xì)胞貼壁后棄原液，用PBS洗滌2次。將3板隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組、陰性對照組和陽性對照組，實(shí)驗(yàn)組加入受試材料浸提液，空白組（RPMI1640培養(yǎng)液），實(shí)驗(yàn)組，對照組（6.4%

5、苯酚溶液），每組10孔，每孔均為100pL。將處理后的96孔板置于37C、含體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24,48,72h。于各觀察點(diǎn)末期棄原培養(yǎng)液，加入20pLMTT(質(zhì)量濃度為5g/L),37C、含體積分?jǐn)?shù)為5%CO2孵育4h后終止培養(yǎng)。吸去上清液，每孔加入二甲基亞砜100ML,600r/min振蕩10min，用酶標(biāo)儀在490nm測定吸光度(A)值，記錄結(jié)果。計(jì)算相對增殖率(relativegrowthrate,RGR)。進(jìn)行顯著性分析：采用SPSS13.0軟件完成統(tǒng)計(jì)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x_s表示，P0.05為差異有顯著性意義。3、以小鼠紅細(xì)胞測試：即體外溶血試驗(yàn)材料：家兔/小鼠、離心機(jī)

6、、水浴鍋、試管、離心管、蒸餾水、生理鹽水，供試材料。試驗(yàn)過程：取家兔1只自耳靜脈采血(或心臟采血)10ml，置放有玻璃珠的三角瓶中，輕微攪拌去除纖維蛋白。將血移入有5-10ml生理鹽水的離心管中，混勻后2500r/min離心5min，棄去上清液，如此方法用生理鹽水反復(fù)洗3-4次至上清液呈無色透明為止。將洗滌好的紅細(xì)胞用生理鹽水配制成2%的紅細(xì)胞懸液，備用。項(xiàng)目P試管號1相2相&牛供試藥液(ml)，0.10.2中0.3p0牛0.5pq生理鹽水(ml)心2.42.3p2.2p2.U202.5p4蒸謂水(ml屛相相相相252樂紅細(xì)胞懸液(ml)2.5p2.5p2.5p252.5p2.5p25結(jié)果p表

7、1溶血試驗(yàn)設(shè)計(jì)注：+為溶血，一為丕溶血結(jié)果判斷：全溶血：溶液澄明紅色，管底無紅細(xì)胞殘留；部分溶血：溶液澄明或棕色，管底有少量紅細(xì)胞殘留；無溶血：紅細(xì)胞全部下沉，上層液體無色澄明；凝集：不溶血，紅細(xì)胞在試管底部凝集，振搖后細(xì)胞不能分散。4、以小鼠淋巴細(xì)胞(有核細(xì)胞)測試：取小鼠脾臟細(xì)胞根據(jù)功能和表面標(biāo)志物分選出T/B淋巴細(xì)胞(cytotoxicCD8+Tcells、cytotoxicCD8+Tcells)invitro:樣品材料與小鼠血樣配制100mg/mL進(jìn)行體外培養(yǎng)，培養(yǎng)方式基本同成纖維細(xì)胞，以流式細(xì)胞儀分選小鼠脾內(nèi)淋巴細(xì)胞并計(jì)數(shù)。invivo:按10mg/kg給予小鼠血靜脈注射樣品溶液，以

8、流式細(xì)胞儀分選小鼠脾內(nèi)淋巴細(xì)胞并計(jì)數(shù)5、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)測定炎性反應(yīng)：樣品如制成導(dǎo)管類(如導(dǎo)尿管、深靜脈置管等)可以設(shè)計(jì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)比較非抗菌材料和抗菌材料對機(jī)體產(chǎn)生的局部炎性反應(yīng)程度，HE染色觀察臨近細(xì)胞形態(tài)、不同時(shí)間點(diǎn)血清IL-10和TNF-a的變化(反映炎癥反應(yīng)程度)?？捎媒y(tǒng)計(jì)學(xué)的方法分析。1)兔腫瘤壞死因子Q定量檢測：按試劑盒說明書操作，酶標(biāo)儀讀值，波長為450nm。2)白介素10(ILlO)定量檢測：按試劑盒說明書操作，酶標(biāo)儀讀值，波長為450nm?？咕阅軠y試：取金黃色葡萄球菌(ATCC6538)、大腸桿菌(8099)、(霉菌代表)白色念珠菌(ATCC10231)銅綠假單胞菌(ATCC1544

9、2)、傷寒沙門菌的斜面新鮮培養(yǎng)物，將菌液進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，并用稀釋液(含1%蛋白胨的0.03mol/LPBS(pH7.27.4)配制成含菌量均為5x10510 x106cfu/mL的菌懸液?；静牧峡咕阅軠y試：將樣本分別放入無菌平皿中，加菌懸液50吐于各樣本上記錄各管加菌時(shí)間，分別于加菌后2,5,10,20,60min間隔時(shí)間，接種血平板，同時(shí)將樣本放入5mL營養(yǎng)肉湯管內(nèi)。將接種細(xì)菌的血平板及肉湯管放37T培養(yǎng)48h，觀察初步結(jié)果，在無菌生長管繼續(xù)培養(yǎng)至第7天。若肉湯管渾濁及血平板有菌生長，記為陽性，以(+)表示；如第7天仍澄清，視為無菌生長，以(-)表示。瓊脂擴(kuò)散法測抑菌圈：將試驗(yàn)菌種加入已滅

10、菌的培養(yǎng)皿中，細(xì)菌液濃度約為5x10510 x106cfu/mL/3x108CFU/mL,真菌約為5CFU/mL,然后將溶化后的瓊脂培養(yǎng)基冷卻至50C左右，以無菌手法傾注入培養(yǎng)皿中,每個(gè)內(nèi)徑9cm的平皿傾注15mL,混合均勻后，取直徑10mm的濾紙片沾取抗菌劑溶液置于培養(yǎng)基平板上，細(xì)菌于37C恒溫培養(yǎng)16h18h,真菌于28C恒溫培養(yǎng)48h,觀察并量取抑菌圈大小。抑菌圈大小按下式計(jì)算:W=T-D式中:W抑菌圈尺寸(mm);T抑菌圈(包括濾紙片)直徑(mm);D濾紙片直徑(mm)。結(jié)果判斷：由于濾紙圓片所吸附的藥液慢慢向四周擴(kuò)散，因此在濾紙片的周圍就出現(xiàn)清晰的抑菌圈(加入抑菌劑對供試菌有抑制效果

11、)。抑菌圈的大小代表藥劑抗菌力的高低。在一定的藥劑濃度范圍內(nèi)，藥劑的濃度越高則抑菌圈的直徑越大。此法同樣適合于測定單個(gè)菌的抗菌效果。連續(xù)稀釋法測定MIC:將抗菌劑原液稀釋至200ug/mL,然后進(jìn)行對倍稀釋，直至0.39ug/mL,得到10個(gè)遞減的濃度，將不同濃度的抗菌劑分別混入培養(yǎng)基中，按(2)的方法制成平板，然后將試驗(yàn)菌點(diǎn)種于平板上，直徑9cm的培養(yǎng)皿各點(diǎn)種10株試驗(yàn)菌(細(xì)菌液濃度為104CFU/mL105CFU/mL,真菌約為5CFU6mL),同時(shí)進(jìn)行無藥平板對照，培養(yǎng)，并觀察記錄不同樣品對不同菌種的最低抑菌濃度(MIC,ug/mL)。注：連續(xù)稀釋法一般進(jìn)行幾何系列稀釋，用恒定比例通常是

12、2倍，將液體從一試管轉(zhuǎn)移到另一試管的稀釋方法，由于誤差是積累的，稀釋小于4倍無意義。該方法可定量測定抗菌劑的最低抑菌濃度MIC。試管液體培養(yǎng)基稀釋法是最為常用的。消毒技術(shù)規(guī)范.2002)中2.1.8.4采用此方法。吸光度法：若上清液中菌濃迅速降低并超出吸光度法的檢測下限為此，可采用氯化三苯基四氮(TTC)顯色法來考察抗菌材料的抗菌行為.TTC是一種小分子物質(zhì)，可以通過細(xì)胞壁和細(xì)胞膜被活菌攝取，在脫氫酶作用下轉(zhuǎn)化為紅色的三苯基甲(TF),因此測定TTC的攝取量即可作為衡量細(xì)胞活性的一個(gè)重要指標(biāo).很據(jù)下式:抑茵率(%)對照繭揪吸光度含樣品菌槪吸光度|2|-対照歯液吸光度*抗菌實(shí)效的測定？：同一樣品

13、進(jìn)行多次瓊脂擴(kuò)散法測抑菌圈，以測定樣品的抑菌實(shí)效？注：不要混淆殺菌和抑菌的概念殺菌作用的評價(jià)和抑菌作用的評價(jià)是不同的抑菌作用評價(jià)包括(1)連續(xù)稀釋法(2)擴(kuò)散法殺菌作用是由于微生物和抗菌劑接觸后，產(chǎn)生了一些不可逆的致死過程。殺細(xì)菌，真菌試驗(yàn)是使大量微生物與抗菌劑接觸，培養(yǎng)不同時(shí)間后，測定活菌數(shù)，是一種定量方法。殺菌作用評價(jià)試驗(yàn)的終點(diǎn)定為全部殺死或無菌并不科學(xué)，殺死細(xì)菌百分?jǐn)?shù)為99.9%定義為殺菌作用的終點(diǎn)更為合理。在GB159811995消毒與滅菌效果的評價(jià)方法與標(biāo)準(zhǔn)中是菌殺滅率99.9%作為消毒和滅菌效果的判定值。而GB15979.2002一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，對一次性使用衛(wèi)生用品殺菌

14、效果要求定為90%,主要是由于產(chǎn)品屬非殺菌，消毒劑指標(biāo)略有放寬?？咕w維的吸附動(dòng)力學(xué)和吸附選擇性：穿透曲線測定：調(diào)整E.Coli菌液濃度為A600=1.500，使該濃度菌液向上通過含有一定質(zhì)量抗菌纖維的薄層柱。為了保證薄層柱填充的均勻性，一定質(zhì)量的抗菌纖維在去離子水中充分溶脹，然后在特定模具內(nèi)真空過濾，將濾餅填充到薄層柱中采用部分收集器收集泵驅(qū)動(dòng)流出液。用空白體系測定裝置柱前死體積為0.85柱體積，此參數(shù)用于吸附穿透曲線的數(shù)據(jù)校正。參考文獻(xiàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果：首先測定抗菌材料的吸附動(dòng)力學(xué)，在100mL、菌濃為109CFU/mL的菌液中加入0.8g抗菌材料,5min內(nèi)菌濃即可降低到102CFU/mL,即

15、降低7個(gè)數(shù)量級.30min后檢測不到活菌.在所有的情形下，加入抗菌纖維后初期菌濃迅速下降，然后趨緩，這表明抗菌纖維的抗菌過程可能是由兩個(gè)不同階段組成的，前者可能是快速吸附階段，而后者則可能是殺菌階段.抗菌材料的抗菌過程觀測采用掃描電鏡對抗菌材料和其表面的菌體進(jìn)行觀察：分別采用靜態(tài)和動(dòng)態(tài)吸附法考察聚陽離子型表面接觸抗菌材料對大腸桿菌的吸附性能，測定吸附在材料表面菌體TTC-脫氫酶(or其他表面標(biāo)志物？)的活性和菌體呼吸活性以揭示材料的抗菌作用機(jī)理，并采用電鏡觀察抗菌纖維表面菌體形態(tài)隨時(shí)間的變化.HeLZ丄iuY,YangD.YaowuShengwuJishu.2006;13(1):45-48何蘭

16、珍，劉毅，楊丹殼聚糖-明膠海綿狀傷口敷料的制備及性能研究J.藥物生物技術(shù),2006,13:45-48.DingY,ZhangWQ.ZhongguoYiyaoGongyeZazhi.200&39(7):517-519.丁曄,張文清殼聚糖復(fù)合海綿材料的制備及性能J.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志,2008,39(7):517-519.ISO10993-5-2009.醫(yī)療器械生物學(xué)評價(jià)第5部分ISO10993.12-2009“醫(yī)療器械生物學(xué)評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)第12部分問題：1、是否需要設(shè)計(jì)測定物理性能的實(shí)驗(yàn)？2、是否需要設(shè)計(jì)測定分子量、紅外光譜分析的實(shí)驗(yàn)？3、樣品的特性(固體、液體or凝膠)對實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的影響？是否可以選擇？

17、上海市第九人民醫(yī)院整形外科楊茜附:文獻(xiàn)參考(1)抗菌實(shí)驗(yàn)所用試劑和培養(yǎng)基的配制如下:營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基蛋白胨20g牛肉膏3g氯化鈉5g營養(yǎng)瓊脂15g蒸餾水加至1000ml除瓊脂外其它成分溶解于蒸餾水tfl,調(diào)整pH值至7.27.4,加入瓊脂，加熱溶解、分裝，于12lC壓力蒸汽滅菌20mill備用。營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基蛋白胨20g牛肉啻3g氯化鈉5g蒸餾水加至1000ml將各成分溶解于蒸餾水，調(diào)整pH值至7.27.4,分裝，于12lC壓力蒸汽滅菌20min備用菌懸液的制備用接種環(huán)將第四代大腸桿菌(ArllCC8739)菌種以劃線法接種到營養(yǎng)瓊脂平皿上，在37C的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,取平皿上典型的菌落移種到盛有營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的三角燒瓶中，在37C的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基進(jìn)行10倍稀釋，制成(15)X103/ml量級的菌液待用?？咕阅艿臏y試步驟如下：將培養(yǎng)皿、試管及移液管等在高壓水蒸氣的條件下滅菌消毒，并將固體狀的營養(yǎng)瓊脂加熱至液體狀。將適量的液態(tài)瓊脂加到兩個(gè)培養(yǎng)皿中，使其將培養(yǎng)皿底部全部覆蓋，冷卻待用。使用經(jīng)滅菌處理的藥棉將菌液(5X103/m1)均勻涂在培養(yǎng)皿中的營養(yǎng)瓊脂上，室溫條件下干燥5min。取改性前的天然乳膠一小塊(陰性對照試樣)、改性