醫(yī)學專題血清總膽紅素及結(jié)合膽紅素測定

1、血清總膽紅素及結(jié)合膽紅素測定 重氮反應法測定總膽紅素和結(jié)合膽紅素【實驗原理】 血清中結(jié)合膽紅素可直接與重氮試劑反應，產(chǎn)生偶氮膽紅素；非結(jié)合膽紅素須有加速劑咖啡因-苯甲酸鈉-醋酸鈉作用，其分子內(nèi)氫鍵破壞后才能與重氮試劑反應，也產(chǎn)生偶氮膽紅素。本法重氮反應pH6.5，最后加入堿性酒石酸鈉使紫色偶氮膽紅素(吸收峰530nm)轉(zhuǎn)變成藍色偶氮膽紅素，在600nm波長比色，使檢測靈敏度提高?！緳z驗原理】 總膽紅素在pH3.0附近，在釩酸鹽和表面活性劑存在下，可以被氧化成膽綠素。與此同時，膽紅素特有的黃色也隨之消失。測定膽紅素氧化前后吸光度的差，可以計算出樣品中總膽紅素的濃度?！驹噭?咖啡因-苯甲酸鈉試劑

2、 2堿性酒石酸鈉溶液 372.5mmol/L亞硝酸鈉溶液428.9mmol/L對氨基苯磺酸溶液5重氮試劑 65.0g/L疊氮鈉溶液。7膽紅素標準液 【操作步驟】1.樣品的測定 取3支試管，按下表程序操作. 混勻后，波長600nm，對照管調(diào)零，讀取吸光度，在標準曲線上查出相應的膽紅素濃度。2.標準曲線制作 取5支試管，分別編號，然后按表稀釋膽紅素儲存液配制膽紅素標準液。 混勻(不可產(chǎn)生氣泡)，按總膽紅素測定法操作。每一濃度作3個平行管，并分別做標準對照管，用各自的標準對照管調(diào)零，讀取標準管的吸光度。配制標準液用的溶劑血清中尚有少量膽紅素，同樣測定后得一吸光度值。每個標準管的吸光度值均應減去此吸光

3、度，然后與相應膽紅素濃度繪制標準曲線 【參考范圍】 血清總膽紅素：5.119mol/L(0.31.1mg/dl)； 血清結(jié)合膽紅素：1.76.8mol/L(0.10.4mg/dl)。【臨床意義】 1血清總膽紅素測定的意義(1) 有無黃疸及黃疸程度的鑒別。(2) 肝細胞損害程度和預后的判斷 膽紅素濃度明顯升高反映有嚴重的肝細胞損害。但某些疾病如膽汁淤積型肝炎時，盡管肝細胞受累較輕，血清膽紅素卻可升高。(3) 新生兒溶血癥 血清膽紅素有助于了解疾病嚴重程度。(4) 再生障礙性貧血及數(shù)種繼發(fā)性貧血(主要見于癌或慢性腎炎引起)，血清總膽紅素減少。2血清結(jié)合膽紅素測定的意義 結(jié)合膽紅素與總膽紅素的比值可

4、用于鑒別黃疸類型。(1) 比值20% 溶血性黃疸，陣發(fā)性血紅蛋白尿，惡性貧血，紅細胞增多癥等。(2) 比值40%60% 肝細胞性黃疸。(3) 比值60% 阻塞性黃疸。但以上幾類黃疸，尤其是(2)、(3)類之間有重疊?！九R床意義】誰是動名詞？doing膽紅素氧化酶法測定總膽紅素和結(jié)合膽紅素 【原理】 膽紅素呈黃色，在450nm附近有最大吸收峰。膽紅素氧化酶(BOD)催化膽紅素氧化，隨著膽紅素被氧化，A450nm下降，下降程度與膽紅素被氧化的量相關(guān)。在pH8.0條件下，未結(jié)合膽紅素及結(jié)合膽紅素均被氧化，因而檢測450nm吸光度的下降值可反映總膽紅素含量；加入SDS及膽酸鈉等陰離子表面活性劑可促進其

5、氧化。在pH3.74.5緩沖液中，BOD催化單葡萄糖醛酸膽紅素(mBc)、雙葡萄糖醛酸膽紅素(dBc)及大部分膽紅素氧化，非結(jié)合膽紅素(Bu)在此pH條件下不被氧化。用配制于人血清中的二?；撬崮懠t素(ditaurobilirubin，DTB)作標準品，檢測此條件下450nm吸光度的下降值可反映結(jié)合膽紅素的含量?！驹噭?0.1mol/LTris-HCl緩沖液(pH8.2) 稱取三羥甲基氨基甲烷(Tris)1.211g，膽酸鈉172.3mg,十二烷基硫酸鈉(SDS)432.6mg，溶于去離子水90ml中，在室溫(2530)用1mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH至8.2(約用6ml)，再加蒸餾水至100ml，

6、置冰箱保存，此液含4mmol/L膽酸鈉、15mmol/L SDS。20.2mol/L磷酸鹽緩沖液(pH4.5)。3BOD溶液 如系凍干品，按說明書要求復溶，但復溶后冰箱保存不宜過長(約可保存1周)，如系液體(可能含有甘油)，置4冰箱可保存較長時間，BOD貯存溶液的酶活性一般在數(shù)千至1萬2萬U/L，BOD工作液酶活性可按反應液中BOD終濃度達0.31.0U/ml計算。4總膽紅素標準液(342mol/L) 按膽紅素測定J-G法中方法配制，或市售合乎要求的標準液。5結(jié)合膽紅素標準液 將DTB配于膽紅素濃度可忽略不計的人血清中，或用凍干品按說明書要求重建。配制后分裝于聚丙烯管內(nèi)，70保存，可穩(wěn)定6個月。凍干品未重建前置低溫中，至少穩(wěn)定1年。【操作步驟】 總膽紅素和結(jié)合膽紅素測定分別按表標準管進行。取4支試管，標明標準空白管，測