(醫(yī)學(xué))生物化學(xué)第10章復(fù)制課件

1、第三篇基因信息的傳遞及其調(diào)控Transmission and regulation of genetic information第1頁，共81頁。DNA是遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)1996年克隆羊多莉的誕生1981年由我國科學(xué)家童第周研制的克隆魚第2頁，共81頁?；虻母拍钆c發(fā)展1944年，Avery首次證實基因的化學(xué)本質(zhì)是DNA。1953年提出了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型。1958 Crick提出遺傳信息傳遞的中心法則。60年代 RNA研究取得大發(fā)展（操縱子學(xué)說,遺傳密碼,逆轉(zhuǎn)錄酶）。Jacod和Monod研究細(xì)菌基因調(diào)控時發(fā)現(xiàn)基因是可分的，功能上是有差別的。70年代：建立DNA重組技術(shù)，改變了分子生物學(xué)的面

2、貌，并導(dǎo)致生物技術(shù)的興起。80年代：RNA研究出現(xiàn)第二次高潮：ribozyme、反義RNA、“RNA世界”假說等等。90年代以后，實施人類基因組計劃（HGP）, 開辟了生命科學(xué) 新紀(jì)元。生命科學(xué)進(jìn)入后基因時代第3頁，共81頁?；?因: 指編碼蛋白質(zhì)多肽鏈或各種RNA的DNA功能片段，以及該片段上下游的調(diào)控序列。基因組: 一個細(xì)胞或病毒顆粒所含全部遺傳信息的總和。基因的概念與發(fā)展第4頁，共81頁。中 心 法 則1958年Crick提出遺傳信息傳遞的方式-中心法則.1970年Temin和Baltimore發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象,補(bǔ)充了中心法則.第5頁，共81頁。基因表達(dá)第6頁，共81頁。第十一章 DNA的

3、生物合成(復(fù)制)DNA Biosynthesis，Replication第7頁，共81頁。本章主要內(nèi)容復(fù)制的基本規(guī)律DNA復(fù)制的酶學(xué)和拓?fù)鋵W(xué)變化DNA生物合成過程逆轉(zhuǎn)錄和其他復(fù)制方式DNA損傷（突變）與修復(fù)第8頁，共81頁。復(fù)制(replication)是指遺傳物質(zhì)的傳代，以母鏈DNA為模板合成子鏈DNA的過程。親代DNA子代DNA復(fù)制第9頁，共81頁。第一節(jié) 復(fù)制的基本規(guī)律半保留復(fù)制(semi-conservative replication)復(fù)制的高保真性(high fidelity)雙向復(fù)制(bidirectional replication)半不連續(xù)復(fù)制(semi-discontinu

4、ous replication)第10頁，共81頁。一、半保留復(fù)制DNA復(fù)制時，母鏈DNA解開為兩股單鏈，各自作為模板按堿基配對規(guī)律，合成與模板互補(bǔ)的子鏈。子代細(xì)胞的DNA，一股單鏈從親代完整地接受過來，另一股單鏈則完全重新合成。兩個子細(xì)胞的DNA都和親代DNA堿基序列一致。這種復(fù)制方式稱為半保留復(fù)制。（一）概念:第11頁，共81頁。AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGT

5、GACC+母鏈DNA 復(fù)制過程中形成的復(fù)制叉子代DNA 1953年,Waston 和Crick即已提出DNA半保留復(fù)制的假設(shè)第12頁，共81頁。子鏈繼承母鏈遺傳信息的幾種可能方式 全保留式 半保留式 混合式 （二）半保留復(fù)制的實驗依據(jù)第13頁，共81頁。1958年Messelson和Stahl進(jìn)行密度梯度實驗證實了半保留復(fù)制假說. 含重氮-DNA的細(xì)菌培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液 第一代繼續(xù)培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液 第二代梯度離心結(jié)果普通DNA重DNA普通DNA普通DNA重DNA重DNA第14頁，共81頁。半保留復(fù)制的意義遺傳的保守性，是物種穩(wěn)定性的分子基礎(chǔ)，但不是絕對的。半保留復(fù)制保證親代的遺傳特征完整無誤的傳

6、遞給子代，體現(xiàn)了遺傳的保守性,保證了物種的延續(xù)和遺傳的穩(wěn)定。第15頁，共81頁。原核生物復(fù)制時，DNA從起始點(origin)向兩個方向解鏈，形成兩個延伸方向相反的復(fù)制叉，稱為雙向復(fù)制。 復(fù)制中的放射自顯影圖像二、雙向復(fù)制復(fù)制叉：DNA雙鏈解開成為兩股單鏈，各自作為模板，子鏈沿模板延長所形成的Y字形結(jié)構(gòu)。第16頁，共81頁。A. 環(huán)狀雙鏈DNA及復(fù)制起始點B. 復(fù)制中的兩個復(fù)制叉C. 復(fù)制接近終止點(termination, ter)oriterA B C第17頁，共81頁。原核生物只有一個復(fù)制的起始點，是單復(fù)制子完成復(fù)制。真核生物每個染色體有多個起始點，是多復(fù)制子 的復(fù)制。 第18頁，共81

7、頁。53oriorioriori535533復(fù)制子5533 習(xí)慣上把兩個相鄰起始點之間的距離定為一個復(fù)制子。復(fù)制子是獨(dú)立完成復(fù)制的功能單位。第19頁，共81頁。三、復(fù)制的半不連續(xù)性3355解鏈方向35335領(lǐng)頭鏈隨從鏈崗崎片斷解螺旋酶第20頁，共81頁。順著解鏈方向生成的子鏈，復(fù)制是連續(xù)進(jìn)行的，這股鏈稱為領(lǐng)頭鏈(leading strand)。另一股鏈因為復(fù)制的方向與解鏈方向相反，不能順著解鏈方向連續(xù)延長，這股不連續(xù)復(fù)制的鏈稱為隨從鏈(lagged strand) 。復(fù)制中的不連續(xù)片段稱為岡崎片段(okazaki fragment)。 領(lǐng)頭鏈連續(xù)復(fù)制而隨從鏈不連續(xù)復(fù)制，就是復(fù)制的半不連續(xù)性。

8、第21頁，共81頁。參與DNA復(fù)制的物質(zhì) 1.底物: dATP,dGTP,dCTP,dTTP2.聚合酶: 依賴DNA的DNA聚合酶，簡寫為DNA-pol3.模板: 解開成單鏈的DNA母鏈4.引物: 提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合 5.其他的酶和蛋白質(zhì)因子第二節(jié) DNA復(fù)制的酶學(xué)第22頁，共81頁。一、復(fù)制的化學(xué)反應(yīng) (dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPi GAT第23頁，共81頁。1.DNA 新鏈生成需引物和模板； 2.新鏈的延長只可沿53方向進(jìn)行。3.新鏈的合成遵循堿基互補(bǔ)配對規(guī)律。聚合反應(yīng)的特點:第24頁，共81頁。二、DNA聚合酶酶活性：1. 53的聚合活性

9、 2. 核酸外切酶活性 全稱：依賴DNA的DNA聚合酶 (DNA-dependent DNA polymerase)簡稱：DNA-pol53外切酶活性-能切除突變的DNA片段。35外切酶活性-能辨認(rèn)錯配的堿基對,并將其水解。第25頁，共81頁。（一）原核生物的DNA聚合酶第26頁，共81頁。5 A G C T T C A G G A T A 3 | | | | | | | | | | |3 T C G A A G T C C T A G C G A C 5 3 5外切酶活性 5 3外切酶活性?能切除突變的 DNA片段。能辨認(rèn)錯配的堿基對，并將其水解。 核酸外切酶活性 第27頁，共81頁。5 核

10、酸外切酶活性DNA聚合酶活性 5核酸外切酶活性木瓜蛋白酶大片段/Klenow 片段604aa 小片段323aa原核生物DNA聚合酶的功能DNApol 對復(fù)制中的錯誤進(jìn)行校讀，對復(fù)制和修復(fù)中出現(xiàn)的空隙進(jìn)行填補(bǔ)。Klenow片段是實驗室合成DNA，進(jìn)行分子生物學(xué)研究中常用的工具酶。 第28頁，共81頁。DNA-pol 1. DNA-pol II基因發(fā)生突變，細(xì)菌依然能存活。 2. 它參與DNA損傷的應(yīng)急狀態(tài)修復(fù)。 是原核生物復(fù)制延長中真正起催化作用的酶。 DNA-pol 第29頁，共81頁。（二）真核生物的DNA聚合酶延長子鏈的主要酶，有解螺旋酶活性。DNA-pol 起始引發(fā)，有引物酶活性。參與低

11、保真度的復(fù)制 。在復(fù)制過程中起校讀、修復(fù)和填補(bǔ)缺口的作用。在線粒體DNA復(fù)制中起催化作用。DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol 第30頁，共81頁。復(fù)制按照堿基配對規(guī)律進(jìn)行，是遺傳信息能準(zhǔn)確傳代的基本原理。復(fù)制保真性的酶學(xué)機(jī)制：（一）DNA-pol的核酸外切酶活性和及時校讀 （二）復(fù)制的保真性和DNA-pol對堿基選擇三、復(fù)制保真性的酶學(xué)依據(jù)第31頁，共81頁。A：DNA-pol的外切酶活性切除錯配堿基；并用其聚合活性摻入正確配對的堿基。B：堿基配對正確， DNA-pol不表現(xiàn)活性。（一）DNA-pol的核酸外切酶活性和及時校讀第32頁，共81頁。 DNA聚合酶靠其大

12、分子結(jié)構(gòu)協(xié)調(diào)非共價（氫鍵）與共價（磷酸二酯鍵）鍵的有序形成。 嘌呤的化學(xué)結(jié)構(gòu)能形成順式和反式構(gòu)型，與相應(yīng)的嘧啶形成氫鍵配對，嘌呤應(yīng)處于反式構(gòu)型。 （二）復(fù)制的保真性和聚合酶對堿基選擇第33頁，共81頁。DNA復(fù)制的保真性至少要依賴三種機(jī)制 1.遵守嚴(yán)格的堿基配對規(guī)律； 2.聚合酶在復(fù)制延長時對堿基的選擇功能； 3.復(fù)制出錯時DNA-pol的及時校讀功能。第34頁，共81頁。四、復(fù)制中的分子解鏈及DNA分子拓?fù)鋵W(xué)變化 （一）解螺旋酶、引物酶和單鏈DNA結(jié)合蛋白第35頁，共81頁。解螺旋酶(helicase) 利用ATP供能，作用于氫鍵，使DNA雙鏈解開成為兩條單鏈。引物酶(primase) 復(fù)制

13、起始時催化生成RNA引物的酶。單鏈DNA結(jié)合蛋白(single stranded DNA binding protein, SSB) 在復(fù)制中維持模板處于單鏈狀態(tài)并保護(hù)單鏈的完整。 第36頁，共81頁。（二）DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶10 8 局部解鏈后第37頁，共81頁。拓?fù)洚悩?gòu)酶作用特點既能水解 、又能連接磷酸二酯鍵分 類 拓?fù)洚悩?gòu)酶 拓?fù)洚悩?gòu)酶切斷DNA雙鏈中一股鏈，使DNA解鏈旋轉(zhuǎn)不致打結(jié)；適當(dāng)時候封閉切口，DNA變?yōu)樗沙跔顟B(tài)。反應(yīng)不需ATP。切斷DNA分子兩股鏈，斷端通過切口旋轉(zhuǎn)使超螺旋松弛。利用ATP供能，連接斷端， DNA分子進(jìn)入負(fù)超螺旋狀態(tài)。第38頁，共81頁。第39頁，共81頁。五、D

14、NA連接酶連接DNA鏈3-OH末端和相鄰DNA鏈5-P末端，使二者生成磷酸二酯鍵，從而把兩段相鄰的DNA鏈連接成一條完整的鏈。 DNA連接酶作用方式:第40頁，共81頁。HO5335DNA連接酶ATPADP5353第41頁，共81頁。 DNA連接酶在復(fù)制中起最后接合缺口的作用。 在DNA修復(fù)、重組及剪接中也起縫合缺口作用。 也是基因工程的重要工具酶之一。DNA連接酶的生理功能第42頁，共81頁。一、原核生物的DNA生物合成 復(fù)制的起始復(fù)制的延長復(fù)制的終止第三節(jié) DNA生物合成過程第43頁，共81頁。（一）復(fù)制的起始需要解決兩個問題：1. DNA解開成單鏈，提供模板。2. 合成引物，提供3-OH

15、末端。第44頁，共81頁。E.coli復(fù)制起始點 oriC GATTNTTTATTT GATCTNTTNTATT GATCTCTTATTAG. 1 13 17 29 32 44 TGTGGATTA-TTATACACA-TTTGGATAA-TTATCCACA58 66 166 174 201 209 237 245 串聯(lián)重復(fù)序列 反向重復(fù)序列53531. DNA解鏈第45頁，共81頁。解鏈過程主要由DnaA, DnaB（解螺旋酶）, DnaC這三種蛋白質(zhì)共同參與完成.DnaADnaBDnaC第46頁，共81頁。2. 引發(fā)體的生成和引物引發(fā)體: 在復(fù)制起始階段，形成的含有解螺旋酶（DnaB） 、D

16、naC蛋白、引物酶（DnaG）和DNA復(fù)制起始區(qū)域的復(fù)合結(jié)構(gòu)。 Dna B、 Dna CDNA拓?fù)洚悩?gòu)酶SSB3535引物酶第47頁，共81頁。引物：是由引物酶催化合成的短鏈RNA分子，長度一般為十幾個至數(shù)十個核苷酸，合成方向為53。 3535引物3 HO5引物酶引物酶引物酶55第48頁，共81頁。（二）復(fù)制的延長復(fù)制的延長指在DNA-pol催化下，底物dNTP以dNMP的方式逐個加到引物或延長中的子鏈上，其化學(xué)本質(zhì)是磷酸二酯鍵的不斷生成。 第49頁，共81頁。dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTP 5 353OH3DNA-polDNA-pol第50頁，共81頁。領(lǐng)頭

17、鏈的合成第51頁，共81頁。隨從鏈的合成第52頁，共81頁。復(fù)制過程簡圖第53頁，共81頁。原核生物基因是環(huán)狀DNA，雙向復(fù)制的復(fù)制片段在復(fù)制的終止點(ter)處匯合。oriterE.coli8232 ori terSV40500（三）復(fù)制的終止第54頁，共81頁。 隨從鏈上不連續(xù)性片段的連接555RNA酶OHP5DNA-pol dNTP55PATP ADP+Pi55DNA連接酶第55頁，共81頁。逆轉(zhuǎn)錄(reverse transcription): RNA指導(dǎo)下的DNA合成過程, 催化此反應(yīng)的酶為逆轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcriptase).一、逆轉(zhuǎn)錄病毒和逆轉(zhuǎn)錄酶第四節(jié) 逆轉(zhuǎn)錄

18、和其他復(fù)制方式第56頁，共81頁。逆轉(zhuǎn)錄病毒細(xì)胞內(nèi)的逆轉(zhuǎn)錄過程RNA模板逆轉(zhuǎn)錄酶DNA-RNA雜化雙鏈RNA酶活性單鏈DNADNA作模板的dNTP聚合酶活性雙鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄酶有三種活性：RNA或DNA作模板的dNTP聚合酶活性和RNase活性。第57頁，共81頁。逆轉(zhuǎn)錄酶 AAAAAA TTTTTTAAAAAASI核酸酶 DNA聚合酶堿水解 TTTTTT分子生物學(xué)研究可應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄酶，作為獲取基因工程目的基因的重要方法之一，此法稱為cDNA法。 以mRNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成的與mRNA堿基序列互補(bǔ)的DNA鏈。 cDNA complementary DNA試管內(nèi)cDNA合成*第58頁，共81頁。

19、二、逆轉(zhuǎn)錄研究的意義 逆轉(zhuǎn)錄酶和逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象，是分子生物學(xué)研究中的重大發(fā)現(xiàn)。 逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象說明：至少在某些生物，RNA同樣兼有遺傳信息傳代與表達(dá)功能。對逆轉(zhuǎn)錄病毒的研究，拓寬了20世紀(jì)初已注意到的病毒致癌理論。逆轉(zhuǎn)錄酶和逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象，作為獲取基因工程中目的基因的重要方法之一。第59頁，共81頁。突變(mutation)：遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變而引起的遺傳信息改變，均可稱為突變。從分子水平來看，突變就是DNA分子上堿基的改變。在復(fù)制過程中發(fā)生的DNA突變稱為DNA損傷(DNA damage)。第五節(jié) DNA損傷（突變）與修復(fù)第60頁，共81頁。一、突變的意義（一）突變是進(jìn)化、分化的分子基礎(chǔ)（二）突變導(dǎo)致基

20、因型改變（三）突變導(dǎo)致死亡（四）突變是某些疾病的發(fā)病基礎(chǔ)第61頁，共81頁。二、引發(fā)突變的因素1.物理因素 紫外線、各種輻射。 UV第62頁，共81頁。2.化學(xué)因素稠環(huán)芳香烴硝基胺和芳香胺某些藥物變質(zhì)食物無機(jī)物第63頁，共81頁?；瘜W(xué)因素第64頁，共81頁。三、突變的分子改變類型錯配 (mismatch)缺失 (deletion)插入 (insertion)重排 (rearrangement)框移(frame-shift) 第65頁，共81頁。DNA分子上的堿基錯配稱點突變(point mutation)。發(fā)生在同型堿基之間，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。 1. 轉(zhuǎn)換發(fā)生在異型堿基之

21、間，即嘌呤變嘧啶或嘧啶變嘌呤。 2. 顛換（一）錯配第66頁，共81頁。同義突變：密碼子第三位核苷酸的堿基改變而不改變密碼子的意義（仍為相同氨基酸的密碼子）。 轉(zhuǎn)換和顛換可能引起的突變效應(yīng)有:CGACGC精氨酸精氨酸第67頁，共81頁。誤義突變：堿基置換使一種氨基酸密碼子變成另一氨基酸密碼子。 無義突變：一個堿基的置換使代表氨基酸的密碼子變成無義密碼（即終止密碼）CAACGA谷氨酰胺精氨酸終止密碼CGAUGA精氨酸第68頁，共81頁。鐮形紅細(xì)胞貧血病人Hb (HbS) 亞基N-val his leu thr pro val glu C 肽鏈CAC GTG基因正常成人Hb (HbA)亞基N-va

22、l his leu thr pro glu glu C 肽鏈CTC GAG基因第69頁，共81頁。HbA：N Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-LysHbS： N Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys鐮狀紅細(xì)胞貧血癥正常紅細(xì)胞第70頁，共81頁。（二）缺失、插入和框移缺失：一個堿基或一段核苷酸鏈從DNA大分子上消失。插入：原來沒有的一個堿基或一段核苷酸鏈插入到DNA大分子中間。缺失或插入都可導(dǎo)致框移突變 ?？蛞仆蛔兪侵溉?lián)體密碼的閱讀方式改變，造成蛋白質(zhì)氨基酸排列順序發(fā)生改變。 第71頁，共81頁。缺失和插入可引起框移突變谷 酪 蛋 絲5 G C A G U A C A U G U C 丙 纈 組 纈正常5 G A G U A C A U G U C 缺失C第72頁，共81頁。（三）重排DNA分子內(nèi)較大片段的交換，稱為重組或重排。 第73頁，共81頁。