《病理學(xué)》免疫組化講課原理及方法課件

1、免疫組織化學(xué)技術(shù)的原理及方法第1頁(yè)，共73頁(yè)。免疫組織化學(xué)技術(shù)的原理及其方法一. 基本知識(shí)二. 基本原理三. 方法四. 結(jié)果的判斷及異常著色原因分析和對(duì)策第2頁(yè)，共73頁(yè)。一、免疫組化技術(shù)的基本知識(shí)第3頁(yè)，共73頁(yè)。一、 免疫組化技術(shù)的基本知識(shí)免疫組化的基本概念 利用抗原-抗體特異性結(jié)合原理檢測(cè)抗原或抗體一般是用抗體檢測(cè)抗原抗原 兩個(gè)主要屬性：免疫原性及特異反應(yīng)性，蛋白質(zhì)具有抗原性抗體 與抗原能特異性結(jié)合生物學(xué)結(jié)合是免疫球蛋白Ig第4頁(yè)，共73頁(yè)。免疫球蛋白的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其模式圖免疫球蛋白根據(jù)重鏈結(jié)構(gòu)命名 IgG(), IgA()，IgD(), IgE(), IgM() 五種免疫球蛋白只有兩種類(lèi)

2、 型的輕連，即： Kappa()和Lambda() 每個(gè)抗體分子的輕鏈必須相同；某一單獨(dú)的抗體分子 決不可能既有鏈又有鏈。這一點(diǎn)在免疫組化的淋巴瘤診斷中十分重要。第5頁(yè)，共73頁(yè)。免疫球蛋白的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其模式圖Fc(Fragment crystalline) 是免疫球蛋白的羧基端，意為結(jié)晶片段，因其純化時(shí)呈結(jié)晶狀態(tài)而名之，該片段與抗原特異性有關(guān) Fab(Fragment antigen bingding) 該端是抗體與抗原特異性結(jié)合的部位，每分子Ig能結(jié)合2個(gè)抗原分子 Fc Fab Ag第6頁(yè)，共73頁(yè)。多克隆抗體與單克隆抗體及其產(chǎn)生多克隆抗體：多株B細(xì)胞針對(duì)多個(gè)抗原決定簇產(chǎn)生的抗體單克隆抗體

3、：針對(duì)某一抗原決定簇，由單株淋巴細(xì)胞（克隆）所產(chǎn)生的抗體多克隆抗體單克隆抗體第7頁(yè)，共73頁(yè)。多克隆抗體與單克隆抗體及其產(chǎn)生多克隆抗體的產(chǎn)生以純化的抗原免疫動(dòng)物而獲得，實(shí)際上是針對(duì)多個(gè)抗原決定簇的多個(gè)抗體組成，檢測(cè)范圍廣。在病理診斷中，有利劃歸腫瘤的基本類(lèi)型。常用的多克隆抗體一般在兔身上產(chǎn)生，國(guó)外產(chǎn)品目錄上常以RaH（Rabbit against Human）表之。多克隆抗體亦可產(chǎn)生于羊、豬、豚、鼠等。弄清一抗多克隆抗體的動(dòng)物來(lái)源種類(lèi)，對(duì)后繼抗體的選用至關(guān)重要。第8頁(yè)，共73頁(yè)。多克隆抗體與單克隆抗體及其產(chǎn)生 單克隆抗體的產(chǎn)生 應(yīng)用細(xì)胞融合的雜交瘤技術(shù)（Hybridization），以針對(duì)單一

4、抗原決定簇的小鼠與小鼠骨髓瘤細(xì)胞（腫瘤性B細(xì)胞）融合形成雜交瘤，其特點(diǎn)是既能產(chǎn)生特異性抗體，又能在體外無(wú)限地增殖。將瘤細(xì)胞在體外培養(yǎng)或注入小鼠腹腔內(nèi)而獲單克隆抗體，由此產(chǎn)生的小鼠抗人（抗原）的抗體常以MaH表示，現(xiàn)在亦有兔的單克隆抗體第9頁(yè)，共73頁(yè)。免疫小鼠Mouse第10頁(yè)，共73頁(yè)。抗原的制備：傳統(tǒng)用蛋白提純近來(lái)可應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)：已知抗原的基因結(jié)構(gòu)，用其合成多肽，作為抗原，如ER、PR抗原的制備現(xiàn)有兔的單抗第11頁(yè)，共73頁(yè)。多克隆抗體和多克隆抗體的選用單克隆抗體的制備比多克隆抗體復(fù)雜，價(jià)格更貴；在應(yīng)用中不一定比多克隆抗體好。單克隆抗體的特異性強(qiáng)，多克隆抗體則敏感性高，為何使用完全決

5、定于使用的目的性第12頁(yè)，共73頁(yè)。市售抗體的種類(lèi)某些抗體既有多克隆抗體也有單克隆抗體，如角蛋白，一些抗原只有多克隆抗體，如-胰蛋白酶有些抗體的抗原來(lái)自動(dòng)物，利用動(dòng)物與人抗原之間的共同抗原性使該種抗體能應(yīng)用于人的檢測(cè)。如Desmin來(lái)源于雞的肌肉近年來(lái),市售單克隆抗體除小鼠源性外，還有兔源性第13頁(yè)，共73頁(yè)。標(biāo)記抗體在抗體上用化學(xué)方法聯(lián)接某種標(biāo)記物，目的是使抗原抗體的結(jié)合能用肉眼觀察到標(biāo)記物種類(lèi)：熒光素：異硫氰酸熒光素或羅丹明 酶：辣根過(guò)氧化酶，鹼性磷酸酶 金屬離子：膠體金顆粒標(biāo)記的方法：化學(xué)性結(jié)合將降低抗體效價(jià)及標(biāo)記物的活性，從而使染色敏感性降低第14頁(yè)，共73頁(yè)。酶 抗酶抗體復(fù)合物通過(guò)免

6、疫反應(yīng)而不是化學(xué)方法，將酶結(jié)合到抗體上，形成具酶活性的免疫復(fù)合物。如PAP復(fù)合物（Peroxidase AntiPeroxidase Complex），PAP復(fù)合物屬非標(biāo)記性，保護(hù)了酶的活性，比免疫熒光法敏感上千倍。第15頁(yè)，共73頁(yè)。親和素生物素復(fù)合物（ Avidin-Biotin Complex ABC ）親和素有四個(gè)生物素分子特異性結(jié)合部位，其結(jié)合力強(qiáng)，不可逆，還可和辣根過(guò)氧化酶或熒光素等結(jié)合親和素-生物素復(fù)合物是一個(gè)三維空間的結(jié)構(gòu)，它利用親和素為中介，一端通過(guò)生物素化的抗體聯(lián)接第一抗體，另一端通過(guò)生物素化酶與顯色系統(tǒng)相連接，產(chǎn)生多級(jí)放大，從而提高此生物反應(yīng)的敏感性和特異性AB復(fù)合物多用

7、于ABC法的免疫組化中第16頁(yè)，共73頁(yè)。 酶標(biāo)親和素（Labelled streptavidin）在AB復(fù)合物中，酶是標(biāo)記在生物素上，而后與親和素合成復(fù)合物。在標(biāo)記的親和素-生物素方法中是將辣根過(guò)氧化酶直接標(biāo)記在親和素上，辣根過(guò)氧化酶與親和素間有極強(qiáng)的結(jié)合力，因此LSAB法比ABC法更敏感第17頁(yè)，共73頁(yè)。多聚物載體一步法及二步法載體試劑，可分別稱DAKO EPOS及DAKO Envision試劑核心是一種柔韌的多聚物，它能結(jié)合一抗和酶分子，起到載體的作用一步法多聚物載體試劑是多聚物結(jié)合特異性一抗和辣根過(guò)氧化酶，二步法多聚物載體試劑是一種能與二抗相聯(lián)結(jié)的由HRP標(biāo)記的多聚物第18頁(yè)，共73

8、頁(yè)。一步法：EPOS tissue antigen dextran backbone primary antibody enzyme molecule 第19頁(yè)，共73頁(yè)。二步法：EnVision第20頁(yè)，共73頁(yè)。葡萄球菌蛋白A （Staphylococcal protein A, SPA）第21頁(yè)，共73頁(yè)。二、免疫過(guò)氧化物酶染色技術(shù)的基本原理第22頁(yè)，共73頁(yè)。免疫過(guò)氧化酶染色技術(shù)的基本原理第23頁(yè)，共73頁(yè)。識(shí)別系統(tǒng)特異性抗體識(shí)別組織或細(xì)胞中的靶抗原。特異性抗體具有識(shí)別并結(jié)合靶抗原的功能，這是本技術(shù)的理論依據(jù)所在特異性抗體品種繁多，應(yīng)根據(jù)待檢測(cè)抗原的要求選用特異性抗體有的屬單抗，有的屬

9、多抗，有的既有單抗又有多抗，可根據(jù)不同染色要求而選用識(shí)別系統(tǒng)的組成比較恒定，識(shí)別功能由特異的第一抗完成第24頁(yè)，共73頁(yè)。顯示系統(tǒng)也是顯色系統(tǒng)。抗體抗原的結(jié)合是肉眼看不見(jiàn)的，顯示系統(tǒng)的目的就是使這種看不見(jiàn)的反應(yīng)變?yōu)榭吹靡?jiàn)，從而確定抗原的存在及其定位顯色系統(tǒng)由酶、底物加上顯色劑組成，最終可在標(biāo)記位點(diǎn)形成有色分子的終末產(chǎn)物，若顯色劑為DAB，則出現(xiàn)棕褐色細(xì)顆粒沉淀 E(酶)+S(底物) ES(酶底物復(fù)合物) P(反應(yīng)產(chǎn)物) + E(酶) 循環(huán)使用第25頁(yè)，共73頁(yè)。顯示系統(tǒng)辣根過(guò)氧化酶的免疫組化染色的反應(yīng)過(guò)程: HRP + H2O2 HRPH2O2 有色分子終末產(chǎn)物 + HRP DAB（電子供體）

10、 HRP：酶 H2O2：底物 HRPH2O2：酶底物復(fù)合物 第26頁(yè)，共73頁(yè)。免疫過(guò)氧化酶染色的多種方法中，其主要的不同點(diǎn)在于顯色系統(tǒng)的差異：間接酶標(biāo)法：利用標(biāo)記于橋聯(lián)抗體的酶PAP法： 利用PAP復(fù)合物ABC法： 利用AB復(fù)合物L(fēng)SAB法: 利用直接標(biāo)記于親和素的酶EPOS一步法及EnVision二步法：多聚物載體 其目的都是設(shè)法提高免疫組化染色的敏感性顯示系統(tǒng)第27頁(yè)，共73頁(yè)。聯(lián)結(jié)系統(tǒng)聯(lián)結(jié)或橋聯(lián)抗體（一般為第二抗體）按免疫學(xué)要求將識(shí)別系統(tǒng)與顯色系統(tǒng)聯(lián)結(jié)成為統(tǒng)一體應(yīng)采用何種聯(lián)結(jié)抗體決定于特異性第一抗體是多克隆還是單克?。喝粢豢故嵌嗫寺】贵w，則二抗是羊或其它動(dòng)物的抗兔血清；若一抗是單克隆抗

11、體，則二抗常是兔抗鼠的血清有的聯(lián)結(jié)抗體既能聯(lián)結(jié)多抗，亦能聯(lián)結(jié)單抗第28頁(yè)，共73頁(yè)。三、免疫組化染色方法的類(lèi)別第29頁(yè)，共73頁(yè)。免疫組化染色方法的類(lèi)別直接法間接法PAP法ABC法LSAB法一步法（EPOS）兩步法（Envision）第30頁(yè)，共73頁(yè)。直接法將熒光、酶、金直接標(biāo)記在一抗上進(jìn)行顯色，沒(méi)有聯(lián)結(jié)系統(tǒng)、未用橋抗體。優(yōu)點(diǎn)：特異性高、非特異染色輕。缺點(diǎn)：敏感性低，要求抗體濃度高。每種一抗均需用酶來(lái)標(biāo)記第31頁(yè)，共73頁(yè)。第32頁(yè)，共73頁(yè)。間接法將標(biāo)記物標(biāo)記在橋聯(lián)抗體上（即二抗、三抗）一抗往往是兔身上產(chǎn)生的多克隆抗體，其酶標(biāo)抗體必須是針對(duì)兔優(yōu)點(diǎn)：敏感性高，只需少數(shù)幾種動(dòng)物的二抗就可以和所

12、有一抗相匹配缺點(diǎn)：特異性差第33頁(yè)，共73頁(yè)。Primary AntibodySecondary AntibodySubstrate-chromogenesolution第34頁(yè)，共73頁(yè)。PAP法（Peroxidase-AntiPeroxidase，過(guò)氧化酶-抗過(guò)氧化酶法）組成：一抗是針對(duì)靶抗原的特異性抗體二抗是聯(lián)結(jié)抗體，一面聯(lián)結(jié)一抗，另一面聯(lián)結(jié)PAP復(fù)合物三抗是以過(guò)氧化物酶為抗原，在與一抗同種動(dòng)物身上誘發(fā)產(chǎn)生的抗體，并與辣根過(guò)氧化物酶形成復(fù)合物（PAP）第35頁(yè)，共73頁(yè)。PAP法（Peroxidase-AntiPeroxidase，過(guò)氧化酶-抗過(guò)氧化酶法）優(yōu)點(diǎn)：PAP復(fù)合物中含酶更多，且

13、是一種非標(biāo)記的免疫組化方法，敏感性更高PAP復(fù)合物常來(lái)自兩種不同的動(dòng)物（鼠、兔），鼠PAP用于一抗為單克隆抗體的染色，兔PAP多用于一抗為多克隆抗體的染色可用于福爾馬林固定的石蠟切片第36頁(yè)，共73頁(yè)。PAPPrimary AntibodySecondary AntibodyPeroxidase-anti-PeroxidaseSubstrate-chromogenesolution第37頁(yè)，共73頁(yè)。ABC法（Avidin-Biotin Complex，親和素-生物素法）組成：一抗、生物素化的二抗、ABC復(fù)合物（親和素+酶標(biāo)生物素）優(yōu)點(diǎn)：親和素和生物素有強(qiáng)大親和力，使其比直接和間接酶標(biāo)法更敏感

14、，也超過(guò)PAP法。能用于常規(guī)石蠟切片。第38頁(yè)，共73頁(yè)。親和素生物素復(fù)合物（ Avidin-Biotin Complex ABC ）親和素有四個(gè)生物素分子特異性結(jié)合部位，其結(jié)合力強(qiáng)，不可逆，還可和辣根過(guò)氧化酶或熒光素等結(jié)合親和素-生物素復(fù)合物是一個(gè)三維空間的結(jié)構(gòu)，它利用親和素為中介，一端通過(guò)生物素化的抗體聯(lián)接第一抗體，另一端通過(guò)生物素化酶與顯色系統(tǒng)相連接，產(chǎn)生多級(jí)放大，從而提高此生物反應(yīng)的敏感性和特異性AB復(fù)合物多用于ABC法的免疫組化中第39頁(yè)，共73頁(yè)。ABC法（Avidin-Biotin Complex，親和素-生物素法）第40頁(yè)，共73頁(yè)。一抗二抗ABCDABABC第41頁(yè)，共73頁(yè)

15、。ABC與PAP 法的比較第42頁(yè)，共73頁(yè)。LSAB（SP）法（labelled streptavidin biotin method）標(biāo)記的鏈霉親和素-生物素法特點(diǎn)：將HRP直接標(biāo)記于鏈霉親和素上優(yōu)點(diǎn)：更快速：空間結(jié)構(gòu)更小更敏感：鏈霉親和素的親和性更強(qiáng)，更易于到達(dá)深部位點(diǎn)非特異背景更少：鏈霉親和素空間結(jié)構(gòu)特殊，不易與高荷電的組織成分（膠原纖維、結(jié)締組織）聯(lián)結(jié)第43頁(yè)，共73頁(yè)。 酶標(biāo)親和素（Labelled streptavidin）在AB復(fù)合物中，酶是標(biāo)記在生物素上，而后與親和素合成復(fù)合物。在標(biāo)記的親和素-生物素方法中是將辣根過(guò)氧化酶直接標(biāo)記在親和素上，辣根過(guò)氧化酶與親和素間有極強(qiáng)的結(jié)合

16、力，因此LSAB法比ABC法更敏感第44頁(yè)，共73頁(yè)。SPPrimary AntibodyBiotinylatedSecondary AntibodyEnsyme-conjugatedStreptavidinSubstrate-chromogensolution第45頁(yè)，共73頁(yè)。ABC與LSAB(SP)法的比較第46頁(yè)，共73頁(yè)。一步法（EPOS）及兩步法（Envision）特點(diǎn)以多聚體為載體，聯(lián)結(jié)了酶和一抗（一步法）或二抗的Fab段和酶（二步法）優(yōu)點(diǎn)操作簡(jiǎn)便，省時(shí)提高了敏感性和特異性減少了背景著色避免內(nèi)源性生物素的干擾第47頁(yè)，共73頁(yè)。多聚物載體一步法及二步法載體試劑，可分別稱DAKO

17、EPOS及DAKO Envision試劑核心是一種柔韌的多聚物，它能結(jié)合一抗和酶分子，起到載體的作用一步法多聚物載體試劑是多聚物結(jié)合特異性一抗和辣根過(guò)氧化酶，二步法多聚物載體試劑是一種能與二抗相聯(lián)結(jié)的由HRP標(biāo)記的多聚物第48頁(yè)，共73頁(yè)。一步法：EPOS tissue antigen dextran backbone primary antibody enzyme molecule 第49頁(yè)，共73頁(yè)。二步法：EnVision第50頁(yè)，共73頁(yè)。一步法（EPOS）及兩步法（Envision）比較第51頁(yè)，共73頁(yè)。Substrate-chromogensolutionEPOS一步法第52頁(yè)，

18、共73頁(yè)。Primary AntibodyPolymer complexSubstrate-chromogensolutionEnVision二步法第53頁(yè)，共73頁(yè)。四、免疫組化染色結(jié)果的判斷及異常著色的原因分析及其對(duì)策第54頁(yè)，共73頁(yè)。特異性著色具備特點(diǎn) 特定的組織特定的定位 特定的細(xì)胞 特定的細(xì)胞內(nèi)的部位 分布上的不均一著色的不均一性 著色強(qiáng)度的不均一顆粒性顯色：DAB顯色劑應(yīng)為棕黃到棕褐色免疫組化染色結(jié)果的判斷第55頁(yè)，共73頁(yè)。CK染色，結(jié)腸腺癌細(xì)胞膜特異性著色第56頁(yè)，共73頁(yè)。Kappa 胞漿著色第57頁(yè)，共73頁(yè)。TdT染色，胞核著色第58頁(yè)，共73頁(yè)。PR 胞核著色第59頁(yè)，共73頁(yè)。ER 胞核著色第60頁(yè)，共73頁(yè)。免疫組化染色結(jié)果的判斷對(duì)照的設(shè)置空白對(duì)照陽(yáng)性對(duì)照吸收試驗(yàn)對(duì)照替代對(duì)照自身對(duì)照第61頁(yè)，共73頁(yè)。異常著色（假陽(yáng)性）原因及對(duì)策異常著色原因內(nèi)源酶及內(nèi)源性生物素抗體本身原因切片制作不當(dāng)沖洗不充分DAB顯色產(chǎn)生背景著色抗原的丟失抗原的遮蔽抗體試劑因素操作不當(dāng)假陰性的原因第62頁(yè)，共73頁(yè)。內(nèi)源酶及內(nèi)源生物素非特異性著色原因及對(duì)策滅活過(guò)氧化物酶-3%H2O2滅活內(nèi)源性生物素-蛋清封閉或更換不含生物素的染色系統(tǒng)滅活堿性磷酸酶De