用MEGA構(gòu)建進(jìn)化樹

1、如何用MEGA構(gòu)建進(jìn)化樹MEGA3.1是一個(gè)關(guān)于序列分析以及比較統(tǒng)計(jì)的工具包，其中包括有距離建樹法和MP 建樹法；可自動(dòng)或手動(dòng)進(jìn)行序列比對(duì)，推斷進(jìn)化樹，估算分子進(jìn)化率，進(jìn)行進(jìn)化假設(shè)測驗(yàn)， 還能聯(lián)機(jī)的Web數(shù)據(jù)庫檢索。下載后可直接使用，主要包括幾個(gè)方面的功能軟件：i）DNA 和蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)的分析軟件ii）序列數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)變成距離數(shù)據(jù)后，對(duì)距離數(shù)據(jù)分析的軟件。iii） 對(duì)基因頻率和連續(xù)的元素分析的軟件。iv）把序列的每個(gè)堿基/氨基酸獨(dú)立看待（堿基/氨基酸 只有0和1的狀態(tài)）時(shí)，對(duì)序列進(jìn)行分析的軟件。v）繪制和修改進(jìn)化樹的軟件，進(jìn)行網(wǎng)上 blast搜索。用MEGA構(gòu)建進(jìn)化樹有以下步驟：1. 16S rD

2、NA測序和參考序列選取從環(huán)境中分離到單克隆，去重復(fù)后擴(kuò)增16S rDNA序列并測序，然后與數(shù)據(jù)庫 HYPERLINK /blast/Blast.cgi%e6%af%94%e5%af%b9%ef%bc%8c%e6%89%be%e5%88%b0%e7%9b%b8%e4%bc%bc%e5%ba%a6%e6%9c%80%e9%ab%98%e7%9a%84%e5%87%a0%e4%b8%aa%e5%ba%8f%e5%88%97%ef%bc%8c%e7%a1%ae%e5%ae%9a%e4%b8%80%e4%b8%8b%e4%bd%a0%e5%88%86 /blast/Blast.cgi比對(duì)，找到相似度最高

3、的幾個(gè)序列，確定一下你分 離的細(xì)菌大約屬于哪個(gè)科哪個(gè)屬，如果相似度達(dá)到百分之百那基本可以確定你分離得到的就 是Blast到的那個(gè)，然后找一到兩個(gè)同科的，再找一到兩個(gè)同目的，再找一到兩個(gè)同綱的細(xì) 菌，把序列全部下下來，以FSATA形式整合在TXT文檔中，如TS1GCAGTCGAACGATGAAGCCCAGCTTGCTGGGTGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAA CACGTGGGTGATCTGCCCTGCACTTCGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCG GATAGGACCTCGGGATGCATGTTCCGGGGTGGAAAGGTTTTCCGGTGCAGGAT

4、GGGCCgi|117572706|gb|EF028124.1| Rhodococcus sp. Atl25 16S ribosomal RNA gene, partial sequence CGATTAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAA GTCGAACGATGAAGCCCAGCTTGCTGGGTGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACAC GTGGGTGATCTGCCCTGCACTTCGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATTS2TGCAAGTCGAGCGAATGGATTAAGAG

5、CTTGCTCTTATGAAGTTAGCGGCGGACGGGTG AGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAA TACCGGATAACATTTTGAACTGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTgi|56383044|emb|AJ809498.1| Bacillus cereus partial 16S rRNA gene, strain TMW 2.383 GATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGAATGGATTAAGAGCTTG CTCTTA

6、TGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGAC TGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTTGAACYGCATGGTTC參考序列選擇有幾個(gè)原則：a，不選非培養(yǎng)（unclutured）微生物為參比；b，所選參考序列要正 確，里面無錯(cuò)誤堿基；c，在保證同屬的前提下，優(yōu)先選擇16S rDNA全長測序或全基因組 測序的種；d，每個(gè)種屬選擇一個(gè)參考序列，如果自己的序列中同一屬的較多，可適當(dāng)選擇 兩個(gè)參考序列。2,序列比對(duì)將整理好的序列導(dǎo)入clustalx1.83，如圖 ClustalX (1.83)Fi

7、le Edit Alignment Trees Colors Quality HelpMultiple Alignment ModeFont Size：可成 QTGgBTEGTG；電 HlUgGGGgGTfgCgflCTTCGGGGGTACACGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTGATCTGCCCTGCACTCGTCGAACGATGAAGCCCAGCTTGCTGGGTGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGCGTTAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCTTCAACGG3GGT

8、TTGTCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCTGCAAGTCGAGCGAATGGATTAAGAGCTTGCTCTTATGA|GTTAGCGGCGGACGGGTGAGGTCGAGCGAACTGATTAGAAGCTTGCTTCTATGACGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAGCAAGTCGAGCGAACTGATTAGAAGCTTGCTTCTATGACGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTCTTTATCGGAGAGTT

9、TGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCGATGACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGAATGGATTAiSGGCTTGCTATGAGAGGAGCTTGCTCCTTGATTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCTCGAGCGGATGAGTGGAGCTTGCTCCATGATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGTGCAAGTCGAGCGGATGAGTGGAGCTTGCTCCATGACTCAGCGGCGGA|GGGTG1GTAATTGCGTCGAGCGGAAGA

10、AGGGAGCTTGCTCCCGGATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAACAATGCAAGTCGAGCGGATGAGGGGAGCTTGCTCCCTGATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCAAGTCGAGCGGATGAGAGGAGCTTGCTCCTTGATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATATCATGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGATGACGGAACTGAAGAGTTTGATCATGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAATS1TS21LY1EF02812

11、4NC_0082e.8TS2TS27LY2C1NC_OLIO964NC_OLI3997TSETS9TS4 4SY4SY6SY7NC_002947 NC_009439rulerFile C:Documents and SettingsAdministrator桌面、精簡進(jìn)化樹序列總.txt接著 CLustalX (1.83)Do Complete AlignmentProduce Guide Tree Only Do Alignment from Guide TreeAlignment Trees Colors Quality HelpRealign Selected SequencesReal

12、ign Selected Residue RangeAlign Profile 2 to Profile 1Align Profiles from Guide TreesAlign Sequences to Profile 1Align Sequences to Profile 1 from TreeAlignment Pa r a meters 5.3ve Log FileOutput Format Options103AACGATi；GGTACAiJGATGAAi.GgjGg翌 GBTGGGTG望 HGTGGBHJGGG日 GT*1:GAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGG

13、GTGTCTGCCCTGCACTi:CCCAGCTTGCTGGGTGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTi_ :GGjyGAGTTTGTCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGi rCGAGCGAATGGATTAAGAGCTTGCTCTTATGAGTTAGCGGCGGACGGGTGAi jGAACTGATTAGAAGCTTGCTTCTATGACGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAAC. 7CGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGT.TGCAAGTi TGSGTO

14、ATGCAAG TGCAAGTi ATCATGGi GAACTGA.：GGAG.:GCTGiGAGC；GATG.C.:AGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGi ；GCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCi :TTGCTCCTTGATTTAGCGGCGGACGGGTG.:AGTGGAiGCGGAT-iCGGATQGATTGA.GTTTGATCATGi；CTTGCTCCATGATTCAGCGGCGG.GTGGAGCTTGCTCCATGACTCAGi,GGGAGCTTGCTCCCGGgTTCAGCi:AGGGGAGCTTGCTCCCTGATTCAi|GBGGaG

15、：CTTGCTCCTTGATTCAGiiCAGGCCTAACACATiiATTGAACGCTGGCGi:CGGCGTGCCTAATACATi iAATGGATTAAGAGCTTGi .GTAATG ；|GGGTi ：CGGCGG.:GGCGGAi IgIGGIG- ;cggcgg. GCAAGTi:CTGGAATCT1AGTAATGCCT.:GGGTGgGTAAC. ；ACGGGTGAGTA. .CGGGTGAGTAA :GAGCGGATGAO :TAACACATGCA.ruli=!r1102030 4 0 5060=File C:Documents and SettingsAdministr

16、ator桌面、精簡進(jìn)化樹序列總.txt程序自動(dòng)運(yùn)行，得出結(jié)果，自動(dòng)輸出.aln和.dnd為后綴的兩個(gè)文件。序列比對(duì)也可以直接用MEGA來做。3,打開程序MEGA，如下圖所示：4. MEGA3.1只能打開meg格式的文件，但是它可以把其他格式的多序列比對(duì)文件轉(zhuǎn)換過來， 用.aln格式（Clustal的輸出文件）轉(zhuǎn)換.meg文件。點(diǎn)File:Convert to MEGA Format，打開轉(zhuǎn) 換文件對(duì)話框，從目的文件夾中選中Clustal對(duì)比分析后所產(chǎn)生的.aln文件，點(diǎn)擊打開。5.轉(zhuǎn)換好的meg文件，會(huì)彈出一個(gè)提示信息，點(diǎn)擊ok。查看meg序列文件最后是否正常，若存在clustal. *行，即

17、可刪除。點(diǎn)存盤保存meg文件， meg文件會(huì)和aln文件保存在同一個(gè)目錄。關(guān)閉轉(zhuǎn)換窗口，回到主窗口，現(xiàn)在點(diǎn)面板上的。: me to activate a data file”打開剛才的meg文件。如果為蛋白質(zhì)序列，選擇“protein sequence”，電擊“OK”，得到以下圖示，數(shù)據(jù)輸入之后 的樣子，窗口下面有序列文件名和類型。J3J lcilcculfl.r Evol-uticnary Genetxcs JiLalysisj VcrsianFile Da*. Ilist.FlL 0 gsny Pat learn.licit jM l jrjTiQ3ti Windows HeLp1A_ji

18、 4銘Tutorial on Hdw 1口 Use MEGA.Click mje 們 activate h dat。illeCft旅 WTOA is 口曲而相曰Go比血 REGA 期疽 p：呻而在另外一個(gè)窗口內(nèi)，出現(xiàn)以下數(shù)據(jù)文件點(diǎn)擊選擇和編輯數(shù)據(jù)分類圖標(biāo)，可對(duì)所選擇的序列進(jìn)行編輯，完成后點(diǎn)擊close即可。Imisanac-n DaI a Hxpln-rnr眈“ KfU i gLl j4.L3li.Ea |11蕓斃L* MG-VI1I-FI*iDILLKi-D0-VIIIKVL1IDILiabwiivi(rriiatELL LC I*IQITI!4CiIEbPIS SmEi，。好 t TfKB

19、 如*1蛆點(diǎn)擊J 可選擇要分析 的序列序列編輯完成后，漢主,可出行序列名可進(jìn)行保存，點(diǎn)擊保存后出現(xiàn)以下界面，點(diǎn)擊ok即可。 等 p y %曾W H斗1 w * * R 1 F1瞄1i 4 I4 L H b F烈土I *1 4 11 A EMS C 1 1!。財(cái)D C H r *事 QasKTE Wj 1i 4 *b c h v r1 rk r1 1 津V bT # H 7 4 1* 4 H F F 0 F W T Fr a-941s1 指I1M* n r p八Ff,a V寸W* 4 h f P訴曲*A FV W W1 1h ti I. 1 Pt 山11 V1 11 A U, n r pV的T-

20、# p FE *1 1-% 廿* c ? r1 fl 1v a iI 1 h L P1 E 11 h 1V B 4Jt e n r r1 1V呼嘩i c h r f如*H W-1 -* * b *Wiuhil9丁wV c -wA C R 4 A1 FJB叩U耳1fl S H P Ffl r11V * -Mt 4 F I f! 7 - -Ma.p i PIfiib.i i，北 l.E |mQA| a-Proteobacteria (5 isolates, 2 genera)P-Proteobacteria (15 isolates, 6 genera) Actinobacteria(11 iso

21、lates, 7 genera)y-Proteobacteria (22 isolates, 6 genera) Firmicutes(5 isolates, 2 genera)68TS12 (20 mM, arsB/ACR3(2)卜 Deltlia tsuruhatensis ATCC BAA-554 (ABO75O17)-1 TS30 18 mM, arsB/ACR3(2)1 TS40 5 mM1001TS37(21 mM, arsB TS38 26 mM, arsB SY5 (19 mM, arsB1 Comamonas testosteroni strain WAB1945 (AM 1

22、84284) Comamonas deni tri ficans strain 110 (AF233876) r TS24 8 mM, arsBTS32 7 mM, ACR3(2) TS35 7 mM, ACR3(2) TS7 10 mM, ACR3(2) Acidovorax a venae citrull i AAC00-1 (NC_OO8752) SY8 13 mM, aoxB/ACR3(2) Achromobacter xylosoxiduns strain A19 (AF439314) Hcrminiimonas arsenicoxydans (NC 009138)981TS3 4

23、mM, arsB Janthinobactcrium sp. IC161 (AB 196254)100 TS4 16 mMThaucra aromatica strain LG356 (AJ3I5680)TS23 (21 mM, ACR3(1)Stenotrophomonas sp. ICI93 (AB 196256)r SY1 (20 mM, ACR3(1VACR3(2)TS15 (21 mM, ACR3(/)_ Stenotrophomonas sp. Toyama-1 (AB180662) 10() TS28 (12 mM, ACR3(1)/ACR3(2)SY2 (16 mM, ACR3

24、(1)/ACR3(2)87i TS26 16 mM, ACR3(IYACR3(2)f TS36 9 mM, ACR3(1YACR3(2)100L Aeromonas hydrophila ATCC 7966 0C 008570)1001Escherichia coli K12 (NC 000913)IQOr TS34 9 mM, arsB)*- Klebsiella pneumoniae MGH 78578 (NC_009648) 100iTS29 (12 mM, arsB/ACR3(2)L Shewanella sp. ANA-3 (NC_OO8577)TS96mM, ACR3(2)TS44

25、 (23 mM, aoxB/ACR3(l)/ACR3(2) 79rCjP SY6 3 mM, arsB1TS5 (9 mM99 SY7 (7 mM, arsB/ACR3(l) Pseudomonas putida KT2440 (NC 002947)Pseudomonas fluorescens Pf-5 (NC_004129)SY4 5 mM, arsB/ACR3(2)90r TS626mM-TS42 (32 mM)Acinetobactcr sp. PD12 (AY673994)-TS11 (10 mM)-TS10 15 mM TS25 23 mM, ACRJ(/)TS39 8 mM)Acinetobacter baumannii ATCC 17978 (NC 009085)8? TS14(21 mM100i TS16 4 mM, ACR3(2)Ensifcr adhacrcns strain ATCC 33499 (EFl98418)Agrobacterium tumefa