微生物實驗教案

1、.：.；微 生 物 實 驗 教 案第一部分 根底性實驗實驗一 顯微鏡油鏡的運(yùn)用和細(xì)菌形狀的察看一、實驗?zāi)康囊匀旧Ｆ盎罹鸀槔?，熟練掌握顯微鏡油鏡的運(yùn)用方法。二、顯微鏡油鏡運(yùn)用的原理1普通光學(xué)顯微鏡的根本構(gòu)造1光學(xué)部分: 接目鏡、接物鏡、照明安裝(聚光鏡、虹彩光圈、反光鏡等)。它使檢視物放大, 呵斥物象。2機(jī)械部分: 鏡座、鏡臂、鏡筒、物鏡轉(zhuǎn)換器、載物臺、載物臺轉(zhuǎn)移器、粗調(diào)理器、細(xì)調(diào)理器等部件。它起著支持、調(diào)理、固定等作用。2顯微鏡的放大倍數(shù)和分辨率1放大倍數(shù)=接物鏡放大倍數(shù)接目鏡放大倍數(shù)2顯微鏡的分辨率：表示顯微鏡辨析物體兩端兩點之間間隔 的才干，可用公式表示為：D=/2nsin(/2 )

2、式中D：物鏡分辨出物體兩點間的最短間隔 。 ：可見光的波長平均0.55mn: 物鏡和被檢標(biāo)本間介質(zhì)的折射率。a：鏡口角即入射角。3油鏡運(yùn)用的原理油鏡，即油浸接物鏡。當(dāng)光線由反光鏡經(jīng)過玻片與鏡頭之間的空氣時，由于空氣與玻片的密度不同，使光線遭到曲折，發(fā)生散射，降低了視野的照明度。假設(shè)中間的介質(zhì)是一層油其折射率與玻片的相近，那么幾乎不發(fā)生折射，添加了視野的進(jìn)光量，從而使物象更加明晰。三、實驗資料 1顯微鏡、香柏油、二甲苯、擦鏡紙、吸水紙、蓋玻片、接種環(huán)、酒精燈等。2細(xì)菌三種形狀的玻片染色標(biāo)本。3培育12-18h的枯草芽孢桿菌。四、實驗方法與步驟1染色細(xì)菌玻片的油鏡觀查1用前檢查：零件能否齊全，鏡頭

3、能否清潔。2調(diào)理光亮度。3低倍鏡察看：先粗調(diào)再微調(diào)至物象明晰。4轉(zhuǎn)入中倍、高倍察看，每一不只需調(diào)微調(diào)旋紐即可看到明晰的物象。5油鏡察看：高倍鏡下找到明晰的物象后，旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)換器，在標(biāo)本中央滴一滴香柏油，使油鏡鏡頭浸入香柏油中，細(xì)調(diào)至看清物象為止。6繪出所察看到的細(xì)菌形狀圖像。7、換片：另換新片察看，必需從3步開場操作。8、用后復(fù)原：察看終了，上懸鏡筒，先用擦鏡紙擦去油鏡頭上的香柏油，然后再用擦鏡紙沾取少量二甲苯擦去殘留的油，最后用擦鏡紙擦去殘留的二甲苯，后將鏡體全部復(fù)原。2、活菌制片察看取一張干凈的載玻片，在其中央滴上一滴干凈的蒸餾水，取培育12-18h的枯草芽孢桿菌一小環(huán)，在水滴上反復(fù)涂抹至菌體

4、充分分散，蓋上蓋玻片，用吸水紙吸去多余的水分，按照油鏡的運(yùn)用步驟，察看草芽孢桿菌形狀，邊察看邊繪圖。五、實驗報告油鏡運(yùn)用的原理 六、思索題1油鏡與普通物鏡在運(yùn)用方法上有何不同？應(yīng)特別留意些什么？2運(yùn)用油鏡時，為什么必需用鏡頭油？3鏡檢標(biāo)本時，為什么先用低倍鏡察看，而不是直接用高倍鏡或油鏡察看？七、實驗本卷須知1不準(zhǔn)擅自裝配顯微鏡的任何部件,以免損壞。2鏡面只能用擦鏡紙擦，不能用手指或粗布，以保證光潔度。3察看標(biāo)本時，必需依次用低、中、高倍鏡，最后用油鏡。當(dāng)目視接目鏡時，特別在運(yùn)用油鏡時，切不可運(yùn)用粗調(diào)理器，以免壓碎玻片或損傷鏡面。4察看時，兩眼睜開，養(yǎng)成兩眼可以輪換察看的習(xí)慣，以免眼睛疲勞，并

5、且可以在左眼察看時，右眼凝視繪圖。5拿顯微鏡時，一定要右手拿鏡臂，左手托鏡座，不可單手拿，更不可傾斜拿。6顯微鏡應(yīng)存放在陰涼枯燥處，以免鏡片繁殖霉菌而腐蝕鏡片。實驗二 細(xì)菌的簡單染色和革蘭氏染色一、實驗?zāi)康?學(xué)習(xí)微生物涂片、染色的根本技術(shù)，掌握細(xì)菌的簡單染色方法及革蘭氏染色。2了解革蘭氏染色法的原理及其在細(xì)菌分類鑒定中的重要性。二、實驗原理1 簡單染色的原理大多數(shù)微生物細(xì)胞質(zhì)是帶負(fù)電荷，簡單染色時采用知的、帶正電荷的堿性染料。染料適用于熱固定的涂片，染料與菌體細(xì)胞質(zhì)黏附使菌體著色。經(jīng)染色后的細(xì)菌細(xì)胞與背景構(gòu)成鮮明對比。2 革蘭氏染色的原理革蘭氏陽性菌的細(xì)胞壁主要有肽聚糖構(gòu)成的網(wǎng)狀構(gòu)造組成，在染

6、色過程中，當(dāng)用95%乙醇處置時，由于脫水而引起網(wǎng)狀構(gòu)造中的孔徑變小，細(xì)胞壁的通透性降低，使結(jié)晶紫-碘復(fù)合物被保管在細(xì)胞壁內(nèi)而不易脫色，因此呈藍(lán)紫色。革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁中肽聚糖含量低，脂類物質(zhì)含量高，當(dāng)用乙醇處置時，脂類物質(zhì)溶解，細(xì)胞壁的通透性添加，使結(jié)晶紫-碘復(fù)合物容易被乙醇抽提出來而脫色，然后又被染上了復(fù)染劑的顏色，因此呈現(xiàn)紅色。三、實驗資料1大腸桿菌24h的斜面培育物。2葡萄球菌24h的斜面培育物。3簡單染色液美藍(lán)染色液、黑色素液或炭素墨水4革蘭氏染色液結(jié)晶紫染液、盧戈氏碘液、95%乙醇、石碳酸復(fù)紅5載玻片、蓋玻片、接種環(huán)、鑷子、酒精燈、火柴、玻璃鉛筆、蒸餾水等。6顯微鏡、香柏油、二甲苯

7、、擦鏡紙、吸水紙等。四、實驗方法和步驟附表1細(xì)菌染色法分類附表2 微生物染色常用染料A酸性染料：如酸性復(fù)紅、剛果紅、伊紅、藻紅、苯胺黑等。B堿性染料：普通有堿性復(fù)紅、中性紅、孔雀綠、番紅、結(jié)晶紫、美蘭、甲基紫等，細(xì)菌易被堿性染料染色。C中性復(fù)合染料：如伊紅、美蘭等，Wright染料和Gimsa染料等常用于細(xì)胞核染色。D單純?nèi)旧哼@類染料物，不溶于水，但溶于脂肪溶劑中，如蘇丹類Sudan b的染料1、簡單染色(1) 涂片:取兩塊干凈的載玻片，各滴一小滴生理鹽水于載玻片中央，用無菌操作分別挑取金黃色葡萄球菌和大腸桿菌于二載玻片的水滴中每一種菌制一片，調(diào)勻并涂成薄膜。留意滴生理鹽水時不宜過多，涂片必

8、需均勻。(2) 枯燥：自然氣干或酒精燈高處悄然加熱。(3) 固定:于火焰上經(jīng)過23次。(4) 染色：在整個涂面上滴加齊氏石炭酸復(fù)紅，染色分鐘。5水洗：傾去染液，用自來水細(xì)流沖洗至流下的水中無染料顏色為止。6枯燥：空氣中自然枯燥或在酒精燈高處悄然加熱。7鏡檢：在油鏡下察看細(xì)菌形狀。2革蘭氏染色1涂片。2初染：在做好的涂面上滴加草酸銨結(jié)晶紫染液，染1分鐘，傾去染液，流水沖洗至無紫色。3媒染：先用新配的盧哥氏碘液沖去殘水，而后用其覆蓋涂面1分鐘，后水洗。4脫色：除去殘水后，滴加95%酒精進(jìn)展脫色約30秒，后立刻用流水沖洗。5復(fù)染：滴加番紅染色液，染1分鐘，水洗后用吸水紙吸干。6鏡檢：察看染色結(jié)果。五

9、、實驗報告1 革蘭氏染色的根本原理和意義2 革蘭氏染色成敗的關(guān)鍵六、思索題1根據(jù)實驗領(lǐng)會，他以為制備染色標(biāo)本時，應(yīng)留意哪些事項？ 2制片為什么要完全枯燥后才干用油鏡察看？3做革蘭氏染色涂片為什么不能過于濃重？其染色成敗的關(guān)鍵一步是什么？4當(dāng)他對一株未知菌進(jìn)展革蘭氏染色時，怎樣能確證他的染色技術(shù)操作正確，結(jié)果可靠?實驗三 細(xì)菌的鞭毛染色及其運(yùn)動察看一、實驗?zāi)康?學(xué)習(xí)并掌握細(xì)菌鞭毛染色的根本方法及察看細(xì)菌鞭毛的著生情況。2用壓滴法察看細(xì)菌的運(yùn)動3用懸滴法察看細(xì)菌的運(yùn)動二、實驗原理鞭毛是細(xì)菌的運(yùn)動“器官，普通細(xì)菌的鞭毛都非常纖細(xì)，其直徑為0.01-0.02m，在普通光學(xué)顯微鏡的分辨力限制以外，故需求

10、用特殊的鞭毛染色法，才干看到。鞭毛染色是借媒染劑和染色劑的沉淀作用，使染料堆積在鞭毛上，以加粗鞭毛的直徑，同時使鞭毛著色，在普通光學(xué)顯微鏡下可以看到。三、實驗資料1 菌種：普通變形桿菌斜面菌種2 鞭毛染色液：A液，B液。3 0.01的美藍(lán)水溶液、無菌水，凹玻片、載玻片，蓋玻片、香柏油、鑷子、酒精燈、擦鏡紙、二甲苯、吸水紙等。四、實驗方法(一) 細(xì)菌鞭毛染色1制片：在載玻片的一端滴一滴蒸餾水，用接種環(huán)挑取少許備用的菌苔，最好從菌落的邊緣取菌苔，在載玻片的水滴中輕沾幾下。將載玻片稍傾斜，使菌液隨水滴緩慢流到另一端，然后平放在空氣中枯燥。2染色：涂片枯燥后滴加A液染3-5分鐘，用蒸餾水沖洗，或?qū)埶?/p>

11、瀝干或用B液沖去殘水留意：一定要充分洗凈A液后再加B液，否那么背景很臟。洗凈A液滴加B液后，將玻片在酒精燈上稍加熱，使其微冒蒸汽且不干，普通染30-60秒鐘。然后用蒸餾水沖洗，自然枯燥。3鏡檢：鏡檢時，如未見鞭毛，應(yīng)在整個涂片上多找?guī)讉€視野，有時只在部分涂片上染出鞭毛。菌體為深褐色，鞭毛為褐色。留意點：染色勝利的關(guān)鍵主要決議于：(a)菌種活化的情況，即要延續(xù)移種幾次；(b)菌齡要適宜，普通在幼齡時鞭毛情況最好，易于染色；(c) 新穎的染色液。d制片時不能加熱固定二細(xì)菌運(yùn)動的察看1 壓滴法(1) 制備菌液：從幼齡普通變形菌斜面上，挑數(shù)環(huán)菌放入裝有1-2mL無菌水的試管中，制成輕度混濁的菌懸液。(

12、2) 取2-3環(huán)稀釋菌液于干凈載玻片個央，再參與一環(huán)0.01的美藍(lán)水溶液，混勻。(3) 用鑷子夾一干凈的蓋玻片，先使其一邊接觸菌液，然后漸漸地放下蓋玻片，這樣可防止產(chǎn)生氣泡。(4) 鏡檢：將光線適當(dāng)調(diào)暗，先用低倍鏡找到察看部位，再用高倍鏡察看。要區(qū)分細(xì)菌鞭毛運(yùn)動和布朗運(yùn)動，后者只是在原處左右擺動，細(xì)菌細(xì)胞間有明顯位移者，才干斷定為有運(yùn)動性。2 懸滴法(1) 取干凈蓋玻片，在周圍涂少許凡士林。(2) 在蓋玻片中央滴一小滴菌液(3) 將凹玻片的凹窩向下，使凹窩中心對準(zhǔn)蓋玻片中央的菌液，悄然地蓋在蓋玻片上，使凹玻片與蓋玻片粘在一同(留意液滴不得與凹玻片接觸)。(4) 小心將玻片翻轉(zhuǎn)過來，使菌液正好懸

13、在窩的中央。再用火柴棒輕壓蓋玻片周圍使封鎖，以防菌液枯燥。(5) 鏡檢：將光線適當(dāng)調(diào)暗，先用低倍鏡找到懸滴的邊緣后，再將菌液移至視野中央，換用高倍鏡察看，留意細(xì)菌是如何運(yùn)動的，它與分子布朗運(yùn)動的不同。五、實驗結(jié)果和報告1繪出他所察看到的細(xì)菌的形狀及鞭毛著生情況。2試描畫他所察看的細(xì)菌有無運(yùn)動性，是如何運(yùn)動的？六、思索題 1制片時為什么不能加熱固定？ 2沒有鞭毛的活細(xì)菌在光學(xué)顯微鏡下完全不動嗎？真實地記錄他察看到的景象，并進(jìn)展解釋。3鞭毛染色的菌種為什么要先延續(xù)傳幾代，并且要采用幼齡菌種?4根據(jù)他的實驗領(lǐng)會，哪些要素影響鞭毛染色的效果?如何控制?5試設(shè)計實驗，如何鑒別某種細(xì)菌能否能運(yùn)功，能否有鞭

14、毛，其鞭毛的著生位置。實驗四 細(xì)菌的芽孢、莢膜染色一、實驗?zāi)康?掌握細(xì)菌的芽孢染色法。2掌握細(xì)菌的莢膜染色法。二、實驗資料1 枯草芽抱桿菌、褐球固氮菌的斜面菌種。2 二甲苯、香柏油、蒸餾水、5孔雀綠水溶液、0.5沙黃水溶液(或0.05堿性復(fù)紅)、繪圖墨水(用濾紙過濾后備用)、95乙醇、石炭酸復(fù)紅染液。3顯微鏡、接種環(huán)、酒精燈、載玻片、蓋玻片、小試管(1x6.5cm)、燒杯(300mL)、滴管、試管夾、擦鏡紙、吸水紙。三、實驗方法和步驟一芽孢染色法1方法1(1) 取37培育18-24h的枯草芽孢桿菌作涂片，并枯燥，固定。(2) 于載片上滴入3-5滴5孔雀綠水溶液。(3) 用試管夾夾住載玻片在火焰

15、上用微火加熱，自載玻片上出現(xiàn)蒸汽時，開場計算時間約4-5min。加熱過程中切勿使染料蒸干，必要時可添加少許染料。(4) 傾去染液，待玻片冷卻后，用自來水沖洗至孔雀綠不再褪色為止。(5) 用05沙黃水溶液(或0.05堿性復(fù)紅)復(fù)染1min，水洗。(6) 制片枯燥后用油鏡察看。芽孢呈綠色，菌體紅色。2 方法2(1) 加1-2滴自來水于小試管中，用接種環(huán)從斜面上挑取2-3環(huán)培育18-24h的枯草芽孢桿菌菌苔于試管中，并充分混勻打散，制成濃稠的菌液。(2) 加5孔雀綠水溶液2-3滴于小試管中，用接種環(huán)攪拌使染料與菌液充分混合。(3)將此試管浸于沸水浴(燒杯)中，加熱15-20min。(4)用接種環(huán)從試

16、管底部挑數(shù)環(huán)菌于干凈的載玻片上，并涂成薄膜，將涂片經(jīng)過微火3次固定。(5)水洗，至流出的水中無孔雀綠顏色為止。(6)加沙黃水溶液，染2-3min后，傾去染液，不用水洗，直接用吸水紙吸干。(7)枯燥后用油鏡察看。芽孢綠色，菌體紅色。(二)莢膜染色法1石炭酸復(fù)紅染色1取培育了72h的褐球固氮菌制成涂片，自然枯燥(不可用火焰烘干)。(2)滴入1-2滴95乙醇固定(不可加熱固定)。(3)加石炭酸復(fù)紅染液染色1-2min，水洗，自然枯燥。(4)在載玻片一端加一滴墨汁，另取一張邊緣光滑的載玻片與墨汁接觸，涂成均勻的薄層，自然枯燥。(5)枯燥后用油鏡察看。菌體紅色，莢膜無色，背景黑色。2背景染色1先加1滴墨

17、水于干凈的玻片上，并挑少量褐球固氮菌與之充分混合均勻。(2)放一清潔蓋玻片于混合液上，然后在蓋玻片上放一張濾紙，向下輕壓，吸收多余的菌液。(3)枯燥后用油鏡察看。背景黑色，菌體較暗。在其周圍呈現(xiàn)一亮堂的透明圈即莢膜。四、實驗報告(一)繪圖1枯草芽孢桿菌的芽孢形狀，芽孢的著生位置。2褐球固氮菌菌體及莢膜的形狀。(二)試制片，但不進(jìn)展染色，察看能否能看到芽孢和莢膜?五、問題和思索1為什么芽孢染色要加熱？為什么芽孢及營養(yǎng)體能染成不同的顏色?2組成莢膜的成分是什么?涂片普通用什么固定方法，為什么?3試設(shè)汁實驗如何鑒定果一產(chǎn)芽孢菌株的芽孢形狀、著生位置及所屬分類位置。實驗五 放線菌的形狀察看一、實驗?zāi)康?/p>

18、1識別放線菌的根本構(gòu)造：營養(yǎng)菌絲、氣生菌絲、孢子絲、孢子的形狀；2用水封片法、玻璃紙法、印片法察看放線菌的形狀特征。二、實驗資料1細(xì)黃鏈霉菌的平皿培育物，棘孢小單孢菌的玻璃紙平皿培育物。2 0.1美藍(lán)染色液、石炭酸復(fù)紅染色液。3蓋玻片、載玻片、鑷子、接種環(huán)、顯微鏡、涂布器、玻璃紙、打孔器。三、實驗方法和步驟(一) 察看自然生長形狀的放線菌用鑷子小心取出用插片法培育的細(xì)黃鏈霉菌皿中的一張蓋玻片，將其反面附著的菌絲體擦干凈，然歷將長有菌的一面向上放在干凈的載玻片上，用低倍鏡、高倍鏡察看。找出3類菌絲及其分生孢子，留意放線菌的基內(nèi)曲絲、氣生菌絲的粗細(xì)和色澤差別。(二) 水封片察看取一滴美藍(lán)染色液置于

19、載玻片中央，將用搭片法培育的棘孢小單孢菌培育皿中的蓋玻片取出，并將有菌的面朝下，放在載玻片上，浸在染色液中。制成水封片，用高倍鏡察看其中個分生孢子及其基內(nèi)菌絲。三 玻璃紙法的鏡檢察看1直接玻璃紙察看 分別用細(xì)黃鏈霉菌和棘孢小單孢菌的玻璃紙制片察看。制片時，于載玻片上放一小滴蒸餾水，將含菌玻璃紙片小心剪下一小塊，移至載玻片上，并使有菌面向上。在玻璃紙與載玻片間不能有氣泡，以免影響察看。將制片于顯微鏡下察看，先用低倍鏡察看菌的立體生長情況、再用高倍鏡仔細(xì)察看。留意區(qū)分黃鏈霉菌的基內(nèi)菌絲、氣生菌絲和彎曲狀或螺旋狀的孢子絲。察看棘孢小單孢菌時留意把視野調(diào)暗，其基內(nèi)菌絲纖細(xì)發(fā)亮，其單個分生孢子發(fā)暗，直接

20、生長在基內(nèi)菌絲長出的小梗上。2 印片染色法察看 用鑷子取干凈載玻片并悄然加熱，然后用這微熱載玻片蓋在長有黃鏈霉菌或棘孢小單孢菌的平皿并悄然壓一下，留意將載玻片垂直放下和取出，以防載玻片程度挪動而破壞放線菌的自然形狀，反轉(zhuǎn)有印痕的載玻片悄然加熱固定，用石炭酸復(fù)紅染色1min，水洗，晾干。用油鏡察看。四、實驗結(jié)果和報告l 繪圖 玻璃紙法、水封片法、印片法及自然生長形狀下察看的；2 試比較細(xì)黃鏈霉菌與棘孢小單孢菌特征的異同。五、問題和思索l 在高倍鏡或油鏡下如何區(qū)分放線菌的基內(nèi)菌絲和氣生菌絲?2用插片法和搭片法如何制備放線菌標(biāo)本，其主要優(yōu)點是什么?實驗六 霉菌的形狀察看一、實驗?zāi)康? 掌握微生物載玻

21、片濕室培育方法。2 曲霉、青霉、根霉、毛霉形狀察看。3 根霉假根的察看。二、實驗資料1 產(chǎn)黃青霉、黑曲霉、黑根霉、總狀毛霉等斜面菌種。2 半固體PDA培育基、乳酸苯酚固定液、棉藍(lán)染色液、20甘油。3 透明膠帶、剪刀、培育皿、載玻片、門形玻棒擱架、蓋玻片、圓形濾紙片、接種環(huán)。三、實驗方法和步驟(一)霉菌的載玻片濕室培育1預(yù)備濕室：在培育皿底鋪一張圓形濾紙片，其上放一“門形載玻片擱架，在擱架上放一塊載玻片和兩塊蓋玻片，蓋上皿蓋，外用紙包扎。經(jīng)12l濕熱滅菌30min后，置60烘箱中烘干，備用。2取菌接種：用接種環(huán)挑取少量待察看的霉菌孢子至濕室內(nèi)的載玻片上，每張載玻片可接同一菌種的孢子兩處。接種時只

22、需將帶菌的接種環(huán)在載玻片上悄然碰幾下即可(務(wù)必記住接種的位置)。3 加培育基 用無菌細(xì)口滴管汲取少量融化約60的培育基，滴加到載玻片的接種處。培育基應(yīng)滴得圓而薄，其直徑約為0.5cm(滴加量普通以1/2小滴為宜)。4加蓋玻片 在培育基未徹底凝固前，用無菌鑷子將皿內(nèi)蓋玻片蓋在瓊脂塊薄層上，用鑷子輕壓。使蓋玻片和載玻片間的間隔 相當(dāng)接近，但不能壓扁否那么不透氣。5 倒保濕劑 每皿倒人約3mL 20的無菌甘油，使皿內(nèi)的濾紙完全光滑，以堅持皿內(nèi)濕度。皿蓋上注明菌名、組別和接種日期；此為制成的載玻片濕室，置28恒溫培育3-5天。(二)黑根霉假根的培育將融化的PDA培育基，冷卻至50倒入無菌平皿，其量約為

23、半皿高度的1/2、冷凝后，用接種環(huán)沾取根霉孢子，在平板外表劃線接種。然后將平皿倒置，在蓋內(nèi)放一無菌載玻片，于28培育2-3天后，可見根霉的氣生菌絲倒掛成胡須狀，有許多菌絲與載玻片接觸，并在載玻片上分化出假根和匍匐菌絲等構(gòu)造。(三)鏡檢察看1 濕室培育霉菌鏡檢載玻片 從培育16-20h開場，經(jīng)過延續(xù)察看，可了解孢子的萌生、曲絲體的生長分化和子實體的構(gòu)成過程。將濕室內(nèi)的載玻片取出，直接置于低倍鏡和高倍鏡下察看曲霉、青霉、毛霉、根霉等霉菌的形狀，重點察看菌絲能否分隔，曲霉和青霉的分生孢子構(gòu)成特點，曲霉的足細(xì)胞，根霉和毛霉的孢子囊和泡囊孢子。2 粘片察看 取一滴棉藍(lán)染色液置于載玻片中央，取一段透明膠帶

24、，翻開霉菌平板培育物取菌體，粘面朝下，放在染液上。鏡檢。3假根察看 將培育根霉假根的平皿翻開，取出皿蓋內(nèi)的載玻片標(biāo)本，在附著菌絲體的一面蓋上蓋玻片，置顯微鏡下察看。只需用低倍鏡就能察看到假根及從根節(jié)上分化出的孢子囊梗、孢子囊、孢囊孢子和兩個假根間的匍匐菌絲，察看時留意調(diào)理焦距以看清各種構(gòu)造。4制成永久裝片 把察看到霉菌形狀較明晰，完好的片子，制成標(biāo)本作較長期保管。制備方法是，悄然揭去蓋玻片，假設(shè)載玻片上有瓊脂，仔細(xì)挑去，然后滴加少量乳酸苯酚固定液，蓋上清潔蓋玻片，在蓋玻片周圍滴加樹膠封固。四、實驗結(jié)果和報告繪制并標(biāo)注鏡幾種霉菌鏡檢形狀圖五、問題和思索1 什么叫載玻片濕室培育，它適用于察看怎樣的

25、微生物，有何優(yōu)點?2 濕室培育時為何用20甘油作保濕劑？3 本實驗中察看假根的設(shè)計原理是什么？此設(shè)計還適宜于培育哪類菌？六、本卷須知載玻片濕室培育時，蓋玻片不能緊貼載玻片，要彼此有極小縫隙。構(gòu)造平行陳列，易于察看。實驗七 酵母形狀察看和大小測定一、實驗?zāi)康?了解自然存在的酵母菌及其形狀構(gòu)造。2了解酵母菌產(chǎn)生子囊泡子的條件及其形狀。3了解酵母菌死活的判別方法。4以酵母菌為例，學(xué)會測微尺的運(yùn)用和計算方法及對微生物細(xì)胞大小的測定方法。二、實驗資料1 釀酒酵母、熱帶假絲酵母斜面菌種。2 PDA培育基、麥?zhǔn)吓嘤姿徕c培育基。3 0.05%美藍(lán)染色液(以pH6.0的0.02%mol/L磷酸緩沖液配制)、

26、碘液、0.04%中性紅染色液、5孔雀綠、0.5%的沙黃液、95乙醇。4 顯微鏡、載玻片、擦鏡紙、孟玻片、接種環(huán)、v形玻璃棒、放置一個三角形玻璃棒支架的培育皿。5 目鏡測微尺、鏡臺測微尺。三、實驗方法與步驟(一)酵母菌形狀察看1酵母菌的活體染色察看及死亡率的測定(1)以無菌水洗下PDA斜面培育的釀酒醉母菌苔，制成菌懸液。(2)取0.05美藍(lán)染色液1滴，置載玻片中央，并用接種環(huán)取酵母菌懸液與染色液混勻，染色3min，加蓋玻片，在高倍鏡下察看酵母菌個體形狀，區(qū)分其母細(xì)胞與芽體，區(qū)分死細(xì)胞(藍(lán)色)與活細(xì)胞(不著色)。2酵母菌液泡系的活體察看 于干凈載玻片中央加一滴中性紅染色液，取少許上述酵母菌懸液與之

27、混合，染色5min，加蓋玻片在膠微鏡下察看。細(xì)胞無色，液泡呈紅色。3 酵母菌細(xì)胞中肝糖粒的察看 將1滴碘液置于載破片中央，接入上述酵母菌懸液，混勻，蓋上蓋玻片，顯微鏡察看，細(xì)胞內(nèi)的貯藏物質(zhì)肝糖顆粒呈深紅色。4 酵母菌子囊孢子的察看挑取產(chǎn)孢菌苔涂片固定染色水洗枯燥鏡檢計數(shù)。(1)活化釀酒酵母：將釀酒酵母按種至新穎的麥芽汁培育基上，置28培育2-3天，然后再移接2-3次。(2)移接產(chǎn)孢培育基：將活化的釀灑酵母移接至醋酸鈉培育基上，置30恒溫培育14天。(3)察看：挑取少許產(chǎn)孢菌苔于載玻片的水滴上，經(jīng)涂片、熱固定后，加數(shù)滴孔雀綠，1min后水洗，加95乙醇30s，水洗，最后用0.5沙黃液復(fù)染30s，

28、水洗去染色液，最后用吸水紙吸干。制片枯燥后，鏡檢，子囊孢子呈綠色，子囊為粉紅色。留意察看子囊孢子的數(shù)目、外形和子囊的構(gòu)成率。(4)計算子囊構(gòu)成的百分率：計數(shù)時隨機(jī)取3個視野，分別計數(shù)產(chǎn)子囊孢子的子囊數(shù)和不產(chǎn)孢子的細(xì)胞，然后按以下公式計算：5 酵母菌假菌絲的察看 取一無菌載玻片浸于溶化的PDA培育基中，取出放在濕室培育的支架上，待培育基凝固后，進(jìn)展酵母菌劃線接種，然后將無菌蓋玻片蓋在接菌線上，培育2-3天后，取出載玻片，擦去載玻片周圍的培育基，在顯微鏡下直接察看?？梢姷窖恐辰湍笜?gòu)成的藕節(jié)狀假菌絲，裂殖酵母那么構(gòu)成竹節(jié)狀假菌絲。酵母菌假菌絲的察看：取出長有假菌絲的載玻片，擦去載玻片周圍的培育基，放

29、在再撥片載玻片上，在顯微鏡下直接察看。二酵母大小的測定l 測微尺的構(gòu)造：顯微鏡測微尺是由目鏡測微尺和鏡臺接物測微尺組成，目鏡測微尺是一塊圓形玻璃片，其中有準(zhǔn)確的等分刻度，在5mm刻尺上分50份。目鏡測微尺每格實踐代表的長度隨運(yùn)用接目鏡和接物鏡的放大倍數(shù)而改動，因此在運(yùn)用前必需用鏡臺測微尺進(jìn)展標(biāo)定。測微尺的構(gòu)造鏡臺測微尺為一公用中央有準(zhǔn)確等分線的載玻片，普通將長為1mm的直線等分成100個小格，每格長0.01mm，是公用于校正目鏡測微尺每格長度的。2目鏡測微尺的標(biāo)定：把目鏡的上透鏡旋開，將目鏡測微尺悄然放入目鏡的隔板上，使有刻度的一面朝下。將鏡臺測微尺放在顯微鏡的載物臺上，使有到度的一面朝上。先

30、用低倍鏡察看，調(diào)焦距，待看清鏡臺測微尺的刻度后，轉(zhuǎn)功目鏡，使目鏡測微尺的刻度與鏡臺測微尺的刻度相平行，并使兩尺左邊的一條線重合，向右尋覓另外一條兩尺相重合的直線。目鏡測微尺的標(biāo)定3計算方法菌體的大小=目鏡測微尺下菌占的格數(shù)目鏡測微尺沒格的標(biāo)定值。4酵母菌大小的測定 將鏡臺測微尺取下，換上釀酒酵母菌玻片標(biāo)本，先在低倍鏡下找到目的物，然后在高倍鏡下用目鏡測微尺丈量菌體的大小。先量出菌體的長和寬占目鏡測微尺的格數(shù)，再以目鏡測微尺每格的長度計算出菌體的長和寬。并詳細(xì)記錄于表中，最后，求出平均值，才干代表該菌的大小。酵母菌大小的測定四、實驗結(jié)果與報告五、問題和思索1 為什么改換不同放大倍數(shù)的目鏡和物鏡時

31、必需重新用鏡臺測微尺對目鏡測微尺進(jìn)展標(biāo)定?2假設(shè)目鏡不變，目鏡測微尺也不變，只改動物鏡，那么目鏡測微尺每格所丈量的鏡臺上的菌體細(xì)胞的實踐長度(或?qū)挾?能否一樣?為什么?六、本卷須知1鏡臺測微尺的玻片很薄，在標(biāo)定油鏡頭時，要格外留意，以免壓碎鏡臺測微尺或損壞鏡頭。2標(biāo)定目鏡測微尺時要留意淮確對正目鏡測微尺與鏡臺測微尺的重合線。目鏡測微尺、鏡臺測微尺的顯微鏡下示范。實驗八 細(xì)菌的生理生化反響一、實驗?zāi)康?了解細(xì)菌鑒定中常用的主要生理生化反響實驗法及其原理。2比較4種菌的V.P反響結(jié)果。3比較4種菌的甲基紅反響結(jié)果。4比較4種菌的吲哚反響結(jié)果。5學(xué)習(xí)運(yùn)用杜氏小管進(jìn)展糖發(fā)酵實驗，并比較3種菌的糖發(fā)酵實

32、驗結(jié)果。二、實驗資料1大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、普通變形桿菌、枯草芽孢桿菌的斜面菌種。2葡萄糖蛋白胨水培育基、蛋白胨水培育基、糖發(fā)酵培育基(葡萄糖、乳糖或蔗糖)。3 40NaOH溶液、肌酸、甲基紅試劑、吲哚試劑、乙醚、1.6溴甲酚紫指示劑。4超凈任務(wù)臺、恒溫培育箱、高壓蒸汽滅菌鍋、試管、移液管、杜氏小套管。三、實驗方法與步驟(一) V.P反響1 試管標(biāo)志：以5支裝有葡萄糖蛋白胨水培育基的試管，分別標(biāo)志大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、普通變形桿菌、枯草芽孢桿和空白對照。2接種培育：以無菌操作分別接種少量菌苔至以上相應(yīng)試管中，空白對照不接菌。置37恒溫培育箱中，培育24-48h。3察看記錄：取出以上試管，振蕩2

33、min。另取5支空試管相應(yīng)標(biāo)志菌名，分別參與3-5mL以上對應(yīng)管中的培育液，再參與40NaOH溶液10-20滴，并用牙簽挑入約0.5-1mg微量肌酸，振蕩試管，以使空氣中的氧溶入，放在37恒溫箱中保溫15-30min后，假設(shè)培育液呈紅色，記錄為V.P.實驗陽性反響(用“+表示)；假設(shè)不呈紅色，那么記錄為V.P.實驗陰性反響(用“-表示)留意：原試管中留下的培育液供作甲基紅實驗用。(二)甲基紅實驗(M.R.實驗)于V.P.實驗留下的培育液中，各參與2-3滴甲基紅試指示劑，留意沿壁參與，仔細(xì)察看培育液上層，假設(shè)培育液上層變成紅色，那么為陽性反響；假設(shè)仍成黃色，那么為陰性反響。(三)吲哚實驗1試管標(biāo)

34、志：取裝有蛋白胨水培育基的試管5支，分別標(biāo)志大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、普通變形菌、枯草芽孢桿菌和空白對照。2接種培育：以無菌操作分別接種少量菌苔到以上相應(yīng)試管中，第5管作空白對照不接種，置37恒溫箱中培育24-48h。3察看記錄：在培育基中參與乙醚1-2ml，經(jīng)充分振蕩使吲哚萃取至乙醚中，靜置片刻后乙醚層浮于培育液的上面，此時沿管壁緩慢參與5-10滴吲哚試劑(參與吲哚試劑后切勿搖動試管，以防破壞乙醚層影響結(jié)果察看)，如有吲哚存在，乙醚層呈現(xiàn)玫瑰紅色，此為吲哚實驗陽性反響。否那么為陰性反響。陽性用“+表示，陰性用“-表示。(四) 糖發(fā)酵實驗原理：可根據(jù)細(xì)菌分解利用糖才干的差別表現(xiàn)出能否產(chǎn)酸產(chǎn)氣作為鑒

35、定菌種的根據(jù)。能否產(chǎn)酸，可在糖發(fā)酵培育基中參與指示劑溴甲酚紫指示劑(即B.C.P指示劑，其pH在5.2以下呈黃色，6.8以上呈紫色)，經(jīng)培育后根據(jù)指示劑的顏色變化來判別能否產(chǎn)氣，可在發(fā)酵培育基中放人倒置杜氏小管察看。1試管標(biāo)志：取分別裝有葡萄糖、蔗糖和乳糖發(fā)酵培育液試管各4支，每種糖發(fā)酵試管中均分別標(biāo)志大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、普通變形菌和空白對照。2接種培育：以無菌操作分別接種少量菌苔至以上相應(yīng)試管中，每種糖發(fā)酵培育液的空白對照均不接菌。將裝有培育液的杜氏小管倒置放入試管中，置37恒溫箱中分別培育24h、48h和72h察看結(jié)果。3察看記錄：與對看管比較，假設(shè)接種培育液堅持原有顏包，其反響結(jié)果為陰

36、性，闡明該種菌不能利用該種糖，記錄用“-表示；如培育液呈黃色，反響結(jié)果為陽性，闡明該菌能分解該種糖產(chǎn)酸，記錄用“+表示。培育液中的杜氏小管內(nèi)有氣泡為陽性反響，闡明該菌分解糖能產(chǎn)酸并產(chǎn)氣記錄用“表示；如杜氏小管內(nèi)沒有氣泡為陰性反響，記錄用“表示。四、實驗結(jié)果和報告1細(xì)菌的生理生化反比實驗測定結(jié)果。2 在V.P.反響中參與NaOH溶液和肌酸，在吲哚實驗中參與乙醚，它們各有什么作用？五、問題與思索1以上生理生化反響能用于鑒別細(xì)菌，其原理是什么?2細(xì)菌生理生化反響實驗中，為什么要設(shè)空白對照?3現(xiàn)分別到一株腸道細(xì)菌，試結(jié)合本實驗學(xué)到的知識設(shè)計一個實驗方案進(jìn)展鑒別。六 演 示1 杜氏小管倒置裝入培育液管中

37、不殘留氣泡的操作過程。2 分別顯示、甲基紅實驗、吲哚實驗和糖發(fā)酵實驗培育液陽性反響和陰性反響結(jié)果的顏色變化情況。七、本卷須知1 V.P反響中參與NaOH溶液和肌酸后要反復(fù)振蕩試管，使空氣中氧溶入培育液中。2甲基紅實驗中，不要過多滴加甲基紅指示別，以免出現(xiàn)假陽性反響。3 吲哚實驗中宜選用色氨酸含量高的蛋白胨(用胰蛋白酶水解酪素，得到的蛋白胨中色氨酸含量較高)配制蛋白胨水培育基，否那么將影響產(chǎn)吲哚的陽性率，在參與吲哚試劑后切勿搖動試管以免破壞乙醚層而影響結(jié)果。4在糖發(fā)酵實驗的培育管中裝入倒置杜氏小管時，留意防止小管內(nèi)有殘留氣泡。滅菌時適當(dāng)延伸煮沸時間可除去管內(nèi)氣泡。實驗九 培育基的配制一、實驗?zāi)康?/p>

38、1學(xué)習(xí)和掌握配制培育基的普通方法和步驟2學(xué)會實驗室滅菌鍋的運(yùn)用方法二、實驗資料1牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、可溶性淀粉、葡萄糖、孟加拉紅、鏈霉素、1mol/LNaOH、1mol/LHCl、KNO3、NaCl、K2HPO43H2O、MgSO47H2O、FeSO4.7H2O。2試管、三角瓶、燒杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、pH試紙、棉花、牛皮紙、記號筆、線繩、紗布。3 滅菌鍋三、實驗方法(一)牛肉膏蛋白胨培育基的配制牛肉膏蛋白胨培育基是一種運(yùn)用最廣泛和最普通的細(xì)菌根底培育基。其配方如下：牛肉膏3g，蛋白胨10gNaCl5g，瓊脂15-20g，水1000mL，pH7.4-7.6。1稱藥品：按實踐用量計算

39、后，按配方稱取各種藥品放入大燒杯中。牛肉膏可放在小燒杯或外表皿中稱量，用熱水溶解后倒入大燒杯；也可放在稱量紙上稱量，隨后放人熱水中，牛肉膏便與稱量紙分別，立刻取出紙片。蛋白胨極易吸潮，故稱量時要迅速。2加熱溶解：在燒杯中參與少于所需求的水量，然后放在石棉網(wǎng)上，小火加熱，并用玻棒攪拌，待藥品完全溶解后再補(bǔ)充水分至所需量。假設(shè)配制固體培育基，那么將稱好的瓊脂放入已溶解的藥品中，再加熱融化，此過程中，需不斷攪拌，以防瓊脂糊底或溢出，最后補(bǔ)足所失的水分。3調(diào)PH：檢測培育基的PH，假設(shè)pH偏酸，可滴加1滴1mol/LNaOH，邊加邊攪拌，并隨時用pH試紙檢測，直至到達(dá)所需pH范圍。假設(shè)偏堿，那么用1m

40、ol/L HCl進(jìn)展調(diào)理。pH的調(diào)理通常放在加瓊脂前。應(yīng)留意pH值不要調(diào)過頭，以免回調(diào)而影響培育基內(nèi)各離子的濃度。4過濾：液體培育基可用濾紙過濾，固體培育基可用4層紗布趁熱過濾，以利結(jié)果的察看。5分裝：按實驗要求，可將配制的培育基分裝入試管或三角瓶內(nèi)。分裝時可用三角漏斗以免培育基沾在管口或瓶口上面呵斥污染。分裝量：固體培育基約為試管高度的15，滅菌后制成斜面。分裝入三角瓶內(nèi)以不超越其容積一半為宜。半固體培育基以試管高度的1/4為宜，滅菌后垂直待凝。6加棉塞：試管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脫脂棉)制造的棉塞。棉塞的外形、大小和松緊度要適宜，周圍緊貼管壁，不留縫隙，才干起到防止雜菌侵入和有利通

41、汽的作用。要使棉塞總長約35塞人試管口或瓶口內(nèi)，以防棉塞零落。有些微生物需求更好的通氣，那么可用8層紗布制成通氣塞。有時也可用試管帽或塑料塞替代棉塞。7包扎：加塞后，將三角瓶的棉塞外包一層牛皮紙或雙層報紙，以防滅菌時冷凝水沾濕棉塞。假設(shè)培育基分裝于試管中，那么應(yīng)先把試管扎成捆后，再于棉塞外包一層牛皮紙。然后用記號筆注明培育基稱號、組別、日期。8滅菌：將上述培育基于121.3濕熱滅菌20min。如因特殊情況不能及時滅菌，那么應(yīng)放人冰箱內(nèi)暫存。9擺斜面：滅菌后，如制斜面，那么需趁熱將試管口端擱在一根長木條上，并調(diào)整斜度，使斜度的長度不超越試管總長度的1/2。10無菌檢查：將滅菌的培育基放入37溫箱

42、中培育24-48h，無菌生長即可運(yùn)用?；騼Υ嬗诒淝鍧嵉臋粌?nèi)，備用。(二) 高氏1號培育基的配制高氏1號培育基是用于分別和培育放線菌的合成培育基。其配方如下：可溶性淀粉20g，KNO31g、NaCl 0.5g、K2HPO4.3H2O0.5g、MgSO47H2O0.5g、FeSO4.7H2O0.01g，瓊脂l5-20g，水1000ml，pH 7.4-7.6。1 稱量和溶解：先計算后稱量，按用量先稱取可溶性淀粉，放入小燒杯中，并用少量冷水將其調(diào)成糊狀，再加至少于所需水量的沸水中，繼續(xù)加熱，邊加熱邊攪拌，至其完全溶解。再參與其他成分依次溶解。對微量成分FeSO47H2O可先配成高濃度的貯備液后再參與

43、。待一切藥品完全溶解后，補(bǔ)充水分到所需的總體積。如要配制固體培育基，其瓊脂溶解過程同牛肉膏蛋白胨培育基配制。2 PH調(diào)理、分裝、包扎、滅菌及無菌檢查同牛肉膏蛋白胨培育基配制。(三)馬丁氏培育基的配制馬丁氏培育基是用于分別真菌的選擇培育基。其配方如下：K2HPO4.3H2O1g、MgSO47H2O0.5g、蛋白胨5g，葡萄糖10g，瓊脂15-20g，水1000ml，自然pH。1稱量和溶解：先計算后稱量，按用量稱取各成分，并將其溶解在少于所需求的水中。待各成分完全溶解后，補(bǔ)充水分到所需體積。再將孟加拉紅配成1的水溶液，在1000ml培育液中加人以上孟加抗紅溶液3.3ml，混勻后，參與瓊脂加熱融化，

44、方法同牛肉膏蛋白胨培育基配制。2分裝、包扎、滅菌及無菌檢查同牛肉膏蛋自胨培育基配制。3鏈霉素的參與：鏈霉素受熱容易分解，所以臨用時，將培育基融化后待溫度降至45左右時才干參與?？上葘㈡溍顾嘏涑?的溶液(配好的鏈霉素溶液保管擴(kuò)-20)，在100mL培育基中加1鏈霉素0.3mL，使每毫升培育基中含鏈霉素30ug。四、實驗結(jié)果和報告記錄本實驗配制培育第的稱號、數(shù)量，并圖講解明其配制過程，指明要點。五、問題和思索1配制培育基有哪幾個步驟?在操作過程中應(yīng)留意些什么問題?為什么?2培育基配制完成后，為什么必需立刻滅菌?假設(shè)不能及時滅菌應(yīng)如何處置？如何進(jìn)展無菌檢查，3試設(shè)計實驗對飲料進(jìn)展無菌檢查。六、演示1

45、培育基的分裝方法。2試管斜面的擱置方法七、本卷須知稱藥品用的牛角匙不要混用，稱完藥品應(yīng)及時蓋緊瓶蓋。調(diào)PH時要小心操作，防止回調(diào)。不同培育基各有配制特點，要留意詳細(xì)操作。實驗十 土壤的稀釋、分別、純化及無菌操作技術(shù)一、實驗?zāi)康暮蛢?nèi)容1學(xué)習(xí)從上壤中分別微生物的方法，學(xué)習(xí)無菌操作技術(shù)。2用稀釋法分別細(xì)菌、放線茵和霉菌。3用平板劃線法分別微生物。4學(xué)習(xí)斜面接種及穿刺接種等無菌操作技術(shù)。二、實驗資料1金黃色葡萄球菌和普通變形菌斜面菌種。2已滅菌的牛肉膏、高氏1號、土豆蔗糖固體培育基各1瓶。3無菌培育皿12套、無菌EP管10支、土壤樣品、天平、稱量紙、藥匙、試管架、記號筆、涂布器、1000ul移液器、2

46、00ul移液器、20ul移液器、1000ul槍頭、200ul槍頭、20ul槍頭。4無菌水(49.5mL、帶玻璃珠) 1瓶、80乳酸、10酚液、95乙醇。三、實驗方法(一)土壤稀釋分別1取土壤：取表層以下5-10ml處的土樣放入滅菌的袋中備用，或放在4冰箱中暫存。2制備稀釋液(1)制備土壤懸液：稱土樣0.5g，迅速倒人帶玻璃珠的無菌水瓶中，振蕩5-10min,使土壤充分打散，即成為10-2的土壤懸液。(2)梯度稀釋：用移液器吸10-2的土壤懸液100ul，放入裝有900ul無菌水的EP管中，上下顛倒數(shù)次，即為10-3的稀釋液，如此反復(fù)，可依次制成10-3-10-8的稀釋液。留意：每一個稀釋度換用

47、一支槍頭。3混菌法測定菌落數(shù)的方法(1)細(xì)菌：取10-7、10-6兩管稀釋液各400ul，分別接入相應(yīng)標(biāo)號的平皿中，每個稀釋度接兩個平皿。然后取冷卻至50的牛肉膏瓊脂培育基，分別倒人以上培育皿中(裝量以鋪滿皿底的23為宜)，迅速悄然搖動平皿，使菌液與培育基充分混勻，但不沾濕平皿的邊緣，待瓊脂凝固即成細(xì)菌平板。倒平板時要留意無菌操作。(2)放線菌：取10-5、10-4兩管稀釋液，在每管中參與10酚液50ul，搖勻，靜置片到，然后分別從兩管中吸出400ul參與相應(yīng)標(biāo)號的平皿中，選用高氏1號培育基，用與細(xì)菌一樣的方法倒入平皿中，便可制成放線菌平板。(3)霉菌：取10-2、10-3兩管稀釋液各400u

48、l，分別接入相應(yīng)標(biāo)號的平皿中，每個稀釋險接兩個平皿。在熔好的土豆蔗糖培育基中，每1000ul參與滅菌的乳酸10ul，悄然搖勻，然后用與細(xì)菌一樣的方法倒入平皿中，便可制成霉菌的平板。4培育：將接種好的細(xì)菌、放線菌、霉菌平板倒置，即皿蓋朝下放置，于28-30中溫培育，細(xì)菌培育1-2d，放線菌培育5-7d，霉菌培育3-5d。可用于察看菌落，用于進(jìn)一步純化分別或直接轉(zhuǎn)接斜面。(二)平板劃線分別微生物1倒平板：按無菌操作要求，在火焰旁操作，取融化并冷卻至不燙手的固體培育基(約50)，倒入無菌培育皿中，倒量以鋪滿皿底為限，平放桌上待其充分凝固，備用。2劃線分別：運(yùn)用接種環(huán)，從待純化的菌落或待分別的斜面菌種

49、中沾取少量菌樣，在相應(yīng)培育基平板中劃線分別，劃線的方法多樣，目的是獲得單個菌落。3培育：方法同“土壤稀釋分別(三)斜面接種和穿刺接種1斜面接種1取新穎斜面固體培育基，分別做好標(biāo)志寫上菌名、接種日期、接種人等，然后用無菌操作方法，把持接菌種接入以上新穎培育基斜面中。2接種的方法是，用接種環(huán)沾取少量待接菌種，然后在新穎斜面上“之字形劃線，方向是從下部開場，不斷劃至上部。留意劃線要輕，不可把培育基劃破。(3)接種后30恒溫培育，細(xì)菌培育48h，放線菌、霉菌培育至孢子成熟方可取出保管。2穿刺接種(1)取兩支新穎半固體牛肉膏蛋白胨柱狀培育基，做好標(biāo)志(寫上菌名、接種日期、接種人等)。分別接入金黃色葡萄球

50、菌和普通變形菌。(2)接種的方法是，用接種針沾取少量待接菌種然后從柱狀培育基的中心穿入其底部(但不要穿透)、然后沿原刺入道路抽出接種針，留意接種針不要挪動。(3)接種后30恒溫培育，24h后察看，比較兩種菌的生長結(jié)果。四、實驗結(jié)果和報告1記錄土壤稀釋分別結(jié)果，并計算出每克土壤中的細(xì)菌、放線曲和霉菌的數(shù)量。計算方法：選擇長出菌落數(shù)30-300之間的培育皿進(jìn)展計數(shù)，技以下公式：總個數(shù)g同一稀釋度幾次反復(fù)的菌落平均數(shù)x稀釋倍數(shù)2分別記錄平板劃線、斜面接種的結(jié)果，并自我評價。3比較兩種細(xì)雨穿刺按種的結(jié)果，并進(jìn)展分析。五、問題和思索1在測定土壤微生物含量中，除混菌法外還可用什么方法?2試設(shè)計實驗，從土壤

51、中分別出酵母菌，并進(jìn)展計數(shù)。3試設(shè)計實驗，從水或者空氣中分別微生物，并進(jìn)展計數(shù)。六、本卷須知1普通土壤中，細(xì)菌最多，放線菌及霉菌次之，而酵母菌主要見于果園及菜園土壤中，故從土壤中分別細(xì)菌時，要取較高的稀釋度，否那么菌落連成一片不能計數(shù)。2在土壤稀釋分別操作中，每稀釋10倍，最好改換一次移液管，使計數(shù)準(zhǔn)確。3放線菌的培育時間較長，故制平板的培育基用量可適當(dāng)增多。實驗十一 厭氧微生物的培育一、實驗?zāi)康? 學(xué)習(xí)培育厭氧微生物的方法，了解厭氧微生物生長的特性。2 掌握深層穿刺法厭氧培育丙酮丁醇梭菌的操作。3掌握厭氧法培育丙酮丁醇梭菌及產(chǎn)氣莢膜梭菌。二、實驗資料1丙酮丁醇梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌。2 RCM培

52、育基(即強(qiáng)化梭菌培育基)、TYA培育基、玉米醪培育基、中性紅培育基、明膠麥芽汁培育基。CaCO3，焦性沒食子酸(即鄰苯三酚)、Na2CO3，10NaOH溶液，0.5美藍(lán)水溶液，6葡萄糖水溶液，鈀粒(A型)，NaBH4，K BH4，Na2HCO3，檸檬酸。3 帶塞或塑料帽玻璃管(直徑18-20mm，長180-200mm)，100mL和250mL血漿瓶，20m1和50mL針筒，250mL三角瓶，試管，厭氧罐，厭氧袋(不透氣的無毒復(fù)適宜明薄膜塑料袋，14cmx32cm)，培育皿，真空泵，帶活塞枯燥器，氮氣鋼瓶。三、實驗方法和步驟一深層穿刺厭氧培育法此法操作簡單，適用于普通厭氧微生物的活化和分別培育，

53、但不能用于擴(kuò)展培育。1接種培育：將玻璃管一頭塞上橡膠塞，裝入培育基(RCM或TYA培育基)的高度為管長的2/3，套上塑料帽或橡皮塞，滅菌并凝固后，將丙酮丁醇梭菌用接種針穿刺接種，置37恒溫箱中培育6-7d。2 察看結(jié)果：察看菌落形狀特征并制片，于顯微鏡下察看菌體的細(xì)胞形狀，并記錄結(jié)果。(二)針筒厭氧培育法此法適于活化厭氧菌和小體積的擴(kuò)展培育。1培育基制備：將滅菌的裝合RCM或TYA培育基的血漿瓶放在沸水浴中加熱10min，在瓶口膠塞上插上2枚針頭排氣，以趕出殘留在培育基內(nèi)的氧氣。隨后將血漿瓶從沸水浴中取出，再用氮氣鋼瓶中的高純氮氣(99.99)經(jīng)過膠塞上的一枚針頭引入血漿瓶中，使血漿瓶內(nèi)充溢氮

54、氣，瓶內(nèi)培育基在冷卻過程中堅持無氧形狀。2針筒裝灌培育基：將滅菌的針筒接上針頭經(jīng)膠塞刺入血漿瓶中，先利用瓶內(nèi)氮氣的壓力將針筒的推桿漸漸推開，待吸入一定體積的氮氣后取下針筒，排盡針筒內(nèi)的氣體，按此反復(fù)操作3次，以排盡針筒內(nèi)的殘留空氣而維持無氧形狀。使血漿瓶口朝下傾斜，利用瓶內(nèi)壓力將培育液緩慢灌入針筒內(nèi)，然后取下針筒，用經(jīng)滅菌的帶孔橡皮塞迅速把針筒頭部塞住。3接種培育：采用無菌操作以菌種液針筒將菌穿刺接入培育液針筒中，置37恒培育，用于菌種活化可培育16-18h，用于測定菌體生長可培育6-7d。4察看結(jié)果：取菌制片察看。四、實驗結(jié)果和報告1實驗中選用厭氧培育法的培育結(jié)果。2試比較以上厭氧培育方法的

55、優(yōu)缺陷，并分析其勝利的關(guān)鍵。五、問題和思索1請設(shè)計一個實驗方案，如何從土壤中分別、純化和培育出厭氧菌。2試舉例闡明研厭惡氧菌的實踐意義。六、本卷須知1培育需求CO2的厭氧菌時，須在厭氧小環(huán)境中供應(yīng)CO2。2選用枯燥器、針筒、厭氧罐或厭氧袋時，應(yīng)事先仔細(xì)檢查其密封性能，以防漏氣。3已制備滅菌的培育基在接種前應(yīng)在沸水浴中煮沸10min，以消除溶解在培育基中的氧氣。4針筒培育液刃天青指示劑出現(xiàn)紅色，闡明有殘留氧氣。厭氧袋和厭氧罐中美藍(lán)厭氧度指示劑變成藍(lán)色，闡明除氧不夠。5產(chǎn)氣莢膜梭菌為條件致病菌，防止進(jìn)入口中和沾上傷口。實驗十二 環(huán)境條件對微生物生長的影響一、實驗?zāi)康?了解營養(yǎng)元素的種類及含量對微生

56、物生長的影響。2了解氧氣、溫度、pH、鹽等環(huán)境要素對微生物生長的影響。二、實驗原理環(huán)境條件會影響微生物的生長，不同的微生物在生長時需求不同的環(huán)境條件。微生物按其對環(huán)境條件的需求可以分為好氧、厭氧微生物、嗜酸堿中性微生物和中溫耐高溫耐低溫微生物等多種類型。溫度、酸堿度可以影響微生物細(xì)胞的穩(wěn)定性及催化反響的酶的活性，從而影響微生物的活力和生長情況。微生物生長對浸透壓也有要求，除了一些嗜鹽微生物需求在有高濃度的鹽存在的條件下才干生存外，普通微生物都只能在一定的鹽濃度下生長。對好氧微生物來講，氧氣作為呼吸電子傳送鏈的末端電子受體，是其生長所必需的。但對厭氧微生物來講，由于氧的存在會使其體內(nèi)產(chǎn)生具有破壞

57、作用的自在基，氧氣對這些微生物是一種有毒物質(zhì)。因此，對于一個給定微生物必需經(jīng)過多種實驗來確定其最正確的生長條件。三、實驗資料1、菌種：大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鹽桿菌。2、培育基：牛肉膏蛋白胨培育基、無碳無氮根底鹽培育基、淀粉、葡萄糖、硫酸銨、硝酸鉀。3、儀器設(shè)備：721分光光度計、可控溫?fù)u床。四、實驗方法和步驟一環(huán)境條件對微生物生長的影響1通氣條件對微生物生長的影響1將牛肉膏蛋白胨液體培育基分裝至250ml的三角瓶中，分裝成30ml、50ml、100ml、150ml和180ml裝液量，共5瓶，121滅菌30min備用。2將大腸桿菌按5%的接種量種子液預(yù)先培育接種上述培育基。3將接種好的三角瓶置

58、于200r/min的37搖床上培育8h。4從不同裝液量的搖瓶中取樣，用721分光光度計測定其OD600的值，根據(jù)其濁度的大小可以判別微生物的生長情況，從而確定大腸桿菌在好氧培育時對氧氣的需求量。2 溫度條件對微生物生長的影響1將牛肉膏蛋白胨液體培育基分裝至試管中，4ml管，共12管，121滅菌30min備用。2將大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鹽桿菌按1%接種量接種液體試管培育基，每個菌種接種4管，分別標(biāo)上20、28、37、45標(biāo)志。3按標(biāo)志，將各試管置于相應(yīng)溫度的搖床中培育20h，轉(zhuǎn)速為180r/min。(4) 取出察看各菌的生長情況，并測OD600的值，確定每種微生物生長的最正確生長溫度。3 pH

59、對微生物生長的影響1將牛肉膏蛋白胨液體培育基分裝至試管中，4ml管，共12管，121滅菌30min備用。2將大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鹽桿菌按1%接種量接種液體試管培育基，每個菌種接種4管，分別標(biāo)上pH5.0、pH6.0、pH7.0、pH8.0標(biāo)志。3將大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鹽桿菌分別置于37、28和37的搖床中培育20h,轉(zhuǎn)速為180r/min。4取出察看各菌的生長情況，并測OD600，確定每種微生物的最正確生長pH。二微生物的耐鹽性1在無碳無氮根底鹽培育基中參與葡萄糖和硫酸銨，配置根底鹽培育基，并參與NaCl,分別配置終濃度為0.2、0.5、1、2mol/L的含鹽培育基。并分裝試管。每個濃

60、度梯度配9管，121滅菌，備用。滅菌后測pH，保證pH不低于7.0。2將大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鹽桿菌斜面種用生理鹽水懸浮，分別按1%的接種量接種至不同鹽濃度培育基中。每個梯度3個反復(fù)。3將大腸桿菌、枯草的和芽孢桿菌、鹽桿菌分別置于37、28和37的搖床中培育20h,轉(zhuǎn)速為180r/min。4取出察看各菌的生長情況，并測OD600，確定每種微生物的最高耐鹽才干。五、實驗結(jié)果和報告以柱狀圖方式記錄上述環(huán)境因子對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鹽桿菌的影響。六、問題與思索1記錄不同條件下大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鹽桿菌的生長情況。2試從實際和實際上闡明環(huán)境條件對微生物的影響。第二篇 應(yīng) 用 性 實 驗實驗一