發(fā)酵工程3培養(yǎng)基

1、第3章培養(yǎng)基1培養(yǎng)基是什么?培養(yǎng)基（Medium）是供微生物、植物和動物組織生長和維持用的人工配制的養(yǎng)料，一般都含有碳水化合物、含氮物質(zhì)、無機鹽（包括微量元素）以及維生素和水等。有的培養(yǎng)基還含有抗菌素和色素，用于單種微生物培養(yǎng)和鑒定。2天然培養(yǎng)基指一類利用動、植物或微生物體包括其提取物制成的培養(yǎng)基。如牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基等。 組合培養(yǎng)基又稱為合成培養(yǎng)基或綜合培養(yǎng)基，是一類按微生物的營養(yǎng)要求精確設(shè)計后用多種高純化學試劑配制成的培養(yǎng)基。如葡萄糖銨鹽培養(yǎng)基、淀粉硝酸鹽培養(yǎng)基等。 半組合培養(yǎng)基指一類主要以化學試劑配制，同時還加有某種或某些天然成分的培養(yǎng)基。例如，馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基。 3一、發(fā)

2、酵工業(yè)培養(yǎng)基的基本要求1、必須提供合成微生物細胞和發(fā)酵產(chǎn)物的基本成分。2、有利于減少培養(yǎng)基原料的單耗，即提高單位營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化率。3、有利于提高產(chǎn)物的濃度，以提高單位容積發(fā)酵罐的生產(chǎn)能力。4、有利于提高產(chǎn)物的合成速度，縮短發(fā)酵周期。5、盡量減少副產(chǎn)物的形成，便于產(chǎn)物的分離純化。46、原料價格低廉，質(zhì)量穩(wěn)定，取材容易。7、所用原料盡可能減少對發(fā)酵過程中通氣攪拌的影響，利于提高氧的利用率，降低能耗。8、有利于產(chǎn)品的分離純化，并盡可能減少產(chǎn)生“三廢”物質(zhì)。51、碳源作用：提供微生物營養(yǎng)所需的碳元素，同時又提供能源。最適碳源CHO型。常用碳源：糖蜜、淀粉、葡萄糖、蔗糖、乳糖。有些微生物可利用油脂（豆油

3、、菜油、葵花子油等）、有機酸（乳酸、檸檬酸、乙酸等）、烴和醇類（正1418碳烷烴、乙醇等）。二、培養(yǎng)基的成分與來源62、氮源作用：用于構(gòu)成菌體細胞物質(zhì)（氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸等）和含氮代謝產(chǎn)物。有機氮源：花生餅粉、黃豆餅粉、棉子餅粉、玉米漿、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、魚粉、尿素、酒糟等。無機氮源：銨鹽（氯化銨、硫酸銨、硝酸銨、磷酸銨）、硝酸鹽（硝酸鈉、硝酸鉀）、氨水等。異氧微生物對氮源的利用順序：NCHO或NCHOX類、NH類、NO類、N類。73、無機鹽及微量元素主要無機元素：磷、硫、鉀、鈉、鈣、鎂、鐵等。微量無機元素：鉬、鋅、鈷、銅、硼、溴等。磷、硫是構(gòu)成細胞物質(zhì)的重要成分，鉀、鈉、鎂主要是

4、調(diào)節(jié)和控制原生膠的膠體狀態(tài)、維持膜的透性并激發(fā)某些酶的活性。微量無機元素量微，但往往會強烈刺激微生物的生長發(fā)育。8無機鹽酶的激活劑（Cu2、Mn2、Zn2等）特殊分子結(jié)構(gòu)成分（Mo-固氮酶、Co維生素B12）微量元素滲透壓的維持（Na等）細胞內(nèi)一般分子成分（P、S、Ca、Mg、Fe等）生理調(diào)節(jié)物質(zhì)大量元素一般功能特殊功能化能自養(yǎng)菌能源（S、Fe2、NH4等）無氧呼吸時氫受體（NO3-、SO4- 等）酶的激活劑（Mg2等）pH的穩(wěn)定94、生長因子生長因子是微生物生長發(fā)育過程中不可缺少而需要量又極少的一類特殊營養(yǎng)物質(zhì)。它包括了維生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶類堿基等。營養(yǎng)物質(zhì)中的酵母膏、玉米漿或麥芽浸出

5、物等都含有豐富的生長輔助物質(zhì)。105、發(fā)酵的前體與促進劑前體：指某些化合物加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，能直接被微生物在生物合成過程中結(jié)合到產(chǎn)物分子中去，而其自身的結(jié)構(gòu)沒有多大的變化，但產(chǎn)物的產(chǎn)量卻因加入前體而有較大的提高。如青霉素G的發(fā)酵中加入苯乙酸。11發(fā)酵過程中所用的一些前體物質(zhì)12促進劑：加入后，能使生產(chǎn)菌株大幅度提高目標生產(chǎn)能力的物質(zhì)。如Met或Leu促進頭孢菌素C的生物合成；聚乙烯醇衍生物防止菌絲結(jié)球，提高糖化酶的產(chǎn)量；添加表面活性劑，可增加底物和產(chǎn)物的滲透性，促使固體物分散，強化傳質(zhì)和傳氧，從而促進產(chǎn)物的生產(chǎn)。13三、微生物的培養(yǎng)基類型141.天然培養(yǎng)基(natural medium) 凡

6、利用生物的組織、器官及其抽取物或制品配成的培養(yǎng)基，稱為天然培養(yǎng)基。優(yōu)點是配制方便、經(jīng)濟、營養(yǎng)豐富，但是，它的化學成分不清楚或不穩(wěn)定(受產(chǎn)地、品種、保存加工方法等因素影響)。常見的天然培養(yǎng)基成分有：麥芽汁、肉浸汁、魚粉、麩皮、玉米粉、花生餅粉、玉米漿及馬鈴薯等。15用于天然培養(yǎng)基的原料(玉米淀粉等原料)往往需要進行去雜、粉碎等處理，然后進行過篩、輸送至發(fā)酵罐。16表 幾種天然培養(yǎng)基原材料的特性原材料制作特點營養(yǎng)價值牛肉膏瘦牛肉加熱抽提并濃縮而成的膏狀物主要提供碳水化合物(有機酸、糖類)，有機氮化物(氨基酸、嘌呤、胍類)，無機鹽(鉀，磷)和水溶性維生素(主要為B族)蛋白胨酪素、明膠或魚粉等蛋白質(zhì)經(jīng)

7、酸、酶(胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶)水解而成主要提供有機氮、維生素及碳水化合物酵母膏(酵母粉)酵母細胞水抽提物濃縮而成的膏狀物或粉劑提供大量的B族維生素，氨基酸，嘌呤堿及微量元素玉米漿用亞硫酸浸泡玉米制淀粉時的廢水，經(jīng)減壓濃縮而成的濃縮液。干物質(zhì)占50%，棕黃色，久置沉淀提供可溶性蛋白質(zhì)、多肽、小肽、氨基酸、還原糖和B族維生素。甘蔗糖蜜 甜菜糖蜜制糖廠除去糖結(jié)晶后的下腳廢液，棕黑色主要含蔗糖和其它糖，還有氨基酸、有機酸，少量的維生素等172.合成培養(yǎng)基(synthetic medium) 使用成分完全了解的化學藥品配制而成的培養(yǎng)基稱為合成培養(yǎng)基。合成培養(yǎng)基的優(yōu)點是：成分已知、精確、重復性好

8、。但價格較貴，培養(yǎng)的微生物生長較慢。適用于實驗室進行微生物生理、遺傳育種及高產(chǎn)菌種性能的研究。培養(yǎng)放線菌的高氏一號培養(yǎng)基和培養(yǎng)真菌的察氏培養(yǎng)基都屬于合成培養(yǎng)基。18 3.半合成培養(yǎng)基(semi-defined medium) 由部分天然材料和部分已知的純化學藥品組成的培養(yǎng)基稱為半合成培養(yǎng)基。例如，培養(yǎng)真菌用的馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基等。嚴格地講，凡含有未經(jīng)特殊處理的任何合成培養(yǎng)基，實際上都只是一種半合成培養(yǎng)基。特點是配制方便，成本低，微生物生長良好。發(fā)酵生產(chǎn)和實驗室中應(yīng)用的大多數(shù)培養(yǎng)基都屬于半合成培養(yǎng)基。19 4.液體培養(yǎng)基(liquid medium) 各營養(yǎng)成分按一定比例配制而成的水溶液或液體狀態(tài)

9、的培養(yǎng)基稱為液體培養(yǎng)基。工業(yè)上絕大多數(shù)發(fā)酵都采用液體培養(yǎng)基。實驗室中微生物的生理、代謝研究和獲取大量菌體是也常利用液體培養(yǎng)基。20 5.固體培養(yǎng)基(solid medium) 固體培養(yǎng)基一般是指液體培養(yǎng)基中加入一定量的凝固劑配制而成的固體狀態(tài)的培養(yǎng)基。此外，固體營養(yǎng)物(如麩皮、米糠、木屑、土豆塊、玉米粉)與水和鹽等混合構(gòu)成的疏松狀培養(yǎng)基也屬于固體培養(yǎng)基。固體培養(yǎng)基在科學研究和生產(chǎn)實踐中具有很多用途，例如它可用于菌種分離、鑒定、菌落計數(shù)、檢測雜菌、選種、育種、菌種保藏、抗生素等生物活性物質(zhì)的效價測定及獲取孢子等。21 6.半固體培養(yǎng)基(semi-solid medium) 半固體培養(yǎng)基是指瓊脂加

10、入量為0.2-0.5%而配制的固體狀態(tài)的培養(yǎng)基。半固體培養(yǎng)基有許多特殊的用途，如可以通過穿刺培養(yǎng)觀察細菌的運動能力，進行厭氧菌的培養(yǎng)及菌種保藏等。22 7.種子培養(yǎng)基(seed culture medium) 種子培養(yǎng)基是適合微生物菌體生長的培養(yǎng)基，目的是為下一步發(fā)酵提供數(shù)量較多，強壯而整齊的種子細胞。一般要求氮源、維生素豐富，原料要精。23 8.發(fā)酵培養(yǎng)基(fermentation medium) 用于生產(chǎn)預定發(fā)酵產(chǎn)物的培養(yǎng)基。一般的發(fā)酵產(chǎn)物以碳為主要元素，所以，發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源含量往往高于種子培養(yǎng)基。若產(chǎn)物的含氮量高，應(yīng)增加氮源。在大規(guī)模生產(chǎn)時，原料應(yīng)該價廉易得，還應(yīng)有利于下游的分離提取

11、工作。24 9.基本培養(yǎng)基(Minimal Medium，MM) 基本培養(yǎng)基又稱最低限度培養(yǎng)基，指能滿足某菌種的野生型(原養(yǎng)型)菌株最低營養(yǎng)要求的合成培養(yǎng)基。不同微生物的基本培養(yǎng)基很不相同，有的極為簡單，如大腸桿菌的基本培養(yǎng)基；有的極為復雜，如一些乳酸菌、酵母菌或梭菌的基本培養(yǎng)基。基本培養(yǎng)基有時也需要添加生長因子等。25若在基本培養(yǎng)基中加入富含氨基酸、維生素、堿基等生長因子的營養(yǎng)物質(zhì)，如蛋白胨、酵母膏等，就可滿足各種營養(yǎng)缺陷型的生長需求，這種培養(yǎng)基稱為完全培養(yǎng)基(Complete Medium，CM)。 若在基本培養(yǎng)基中只是針對性地加入一種或幾種營養(yǎng)成分，以滿足相應(yīng)的營養(yǎng)缺陷型生長，那么，這種

12、培養(yǎng)基稱為補充培養(yǎng)基(Supplement Medium,SM)。26 10.加富培養(yǎng)基(enriched medium) 加富培養(yǎng)基是在普通培養(yǎng)基中加入血、血清、動(植)物組織液或其它營養(yǎng)物(或生長因子)的一類營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基。它主要用于培養(yǎng)某種或某類營養(yǎng)要求苛刻的異養(yǎng)型微生物，或者用來選擇性培養(yǎng)(分離、富集)某種微生物。具有助長某種微生物的生長，抑制其它微生物生長的功能。廣義上講，保藏培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基也屬于加富培養(yǎng)基。27 11.選擇性培養(yǎng)基(selected medium)根據(jù)某種或某類微生物的特殊營養(yǎng)要求，或?qū)δ承┪锢?、化學條件的抗性而設(shè)計的培養(yǎng)基，稱為選擇性培養(yǎng)基。目的是利用這種培

13、養(yǎng)基把某種或某類微生物從混雜的微生物群體中分離出來?；旌蠘悠分袛?shù)量很少的某種微生物，如直接采用平板劃線或稀釋法進行分離，往往因為數(shù)量少而無法獲得。28 選擇性培養(yǎng)基的設(shè)計主要方法有兩種：一是根據(jù)某些微生物對碳源、氮源的需求而設(shè)計。 以纖維素為唯一碳源的培養(yǎng)基可用于分離纖維素分解菌；用石蠟油來富集分解石油的微生物；用較濃的糖液來富集酵母菌等。 29二是根據(jù)某些微生物的物理和化學抗性設(shè)計的， 如分離放線菌時，在培養(yǎng)基中加入數(shù)滴10%的苯酚，可以抑制霉菌和細菌的生長；在分離酵母菌和霉菌的培養(yǎng)基中，添加青霉素、四環(huán)素和鏈霉素等抗生素可以抑制細菌和放線菌的生長；結(jié)晶紫可以抑制革蘭氏陽性菌，培養(yǎng)基中加入結(jié)

14、晶紫后，能選擇性地培養(yǎng)革蘭氏陰性菌；7.5%NaCl可以抑制大多數(shù)細菌，但不抑制葡萄球菌，從而選擇培養(yǎng)葡萄球菌。30 12.鑒別培養(yǎng)基(differential medium) 在培養(yǎng)基中添加某種或某些化學試劑后，某種微生物生長過程中產(chǎn)生的特殊代謝產(chǎn)物會與加入的這些化學物反應(yīng)，并出現(xiàn)明顯的、肉眼可見的特征性變化，從而使該種微生物與其它微生物區(qū)別開來。這種培養(yǎng)基稱為鑒別培養(yǎng)基。31例如：用于檢測飲水、乳品中是否含腸道致病菌的伊紅-美蘭乳糖培養(yǎng)基，即EMB(Eosin Methylene Blue)培養(yǎng)基。其成分是：蛋白胨10克，乳糖10克，K2HPO4 2克，2%伊紅 20ml，0.325%美蘭

15、20ml, 蒸餾水1000ml, pH7.232其中的伊紅和美蘭兩種苯胺染料可以抑制革蘭氏陽性菌和一些難培養(yǎng)的革蘭氏陰性菌。試樣中的多種腸道菌會在EMB培養(yǎng)基上產(chǎn)生相互易區(qū)分的特征菌落，因而易于辨認。大腸桿菌，因其強烈分解乳糖而產(chǎn)生大量混合酸，使菌體帶H+，很容易染上酸性染料伊紅，伊紅又與美蘭結(jié)合，其復合物為黑色，所以，大腸桿菌的菌落呈紫黑色并帶金屬光澤，菌落較小。產(chǎn)氣桿菌產(chǎn)酸弱，菌落呈棕色；變形桿菌不能發(fā)酵乳糖，菌落無色、透明。33四、發(fā)酵培養(yǎng)基設(shè)計的原理1、營養(yǎng)物質(zhì)應(yīng)滿足微生物的需要不同營養(yǎng)類型的微生物對營養(yǎng)的需求差異很大，所以，應(yīng)根據(jù)所培養(yǎng)菌種對各營養(yǎng)要素的不同要求進行配制。而且，營養(yǎng)物

16、的濃度及配比應(yīng)恰當，營養(yǎng)物的濃度太低，則不能滿足微生物生長的需要，濃度太高，又會抑制微生物的生長。如糖和鹽都是良好的營養(yǎng)物質(zhì)，但是，濃度升高，則有抑菌作用。34碳氮比(C/N)一般指培養(yǎng)基中元素C與N的比值。為方便測定和計算，人們常以培養(yǎng)基中還原糖含量與粗蛋白含量的比值來表示。在考察培養(yǎng)基組成時，人們常以碳氮比作為一個重要的指標。一般培養(yǎng)基的C/N比為100：0.5-2；在谷氨酸生產(chǎn)菌發(fā)酵中，C/N比為4/1時，菌體大量繁殖，谷氨酸積累量較少；當C/N為3/1時，菌體繁殖受到抑制，谷氨酸大量積累。35在設(shè)計營養(yǎng)物配比時，還應(yīng)該考慮避免培養(yǎng)基中各成分之間的相互作用。如蛋白胨、酵母膏中含有磷酸鹽時

17、，會與培養(yǎng)基中鈣或鎂離子在加熱時發(fā)生沉淀反應(yīng)。在高溫下，還原糖與蛋白質(zhì)或氨基酸也會相互作用產(chǎn)生褐色物質(zhì)。在培養(yǎng)基配制時，可添加化學試劑補充宏量元素。其中，首選的是K2HPO4和MgSO4，因為它們包含了四種宏量元素。對于微量元素，一般化學試劑、水及器皿上均有存在。362、菌體的同化能力有些微生物能分泌水解酶（淀粉酶、蛋白酶等），能利用淀粉、黃豆粉、花生餅粉、玉米漿等復雜原料作為培養(yǎng)基；而不能分泌水解酶的微生物則只能利用小分子物質(zhì)，以淀粉為原料時需先進行“糖化”處理。373、培養(yǎng)基對菌體代謝的阻遏與誘導的影響在配制培養(yǎng)基考慮碳源和氮源時，應(yīng)根據(jù)微生物的特性和培養(yǎng)的目的，注意速效碳（氮）源和遲效碳

18、（氮）源的相互配合，發(fā)揮各自的優(yōu)勢。葡萄糖效應(yīng)：當菌體利用葡萄糖時產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物會阻遏或抑制某些產(chǎn)物合成所需的酶的形成或酶的活性。38在酶制劑生產(chǎn)過程中，應(yīng)考慮碳源的分解代謝阻遏的影響。對許多誘導酶來說，易被利用的碳源不利于產(chǎn)酶，而一些難被利用的碳源對產(chǎn)酶有利。微生物利用氮源的能力因菌種、菌齡的不同而有差異。在生長早期容易利用易同化的銨鹽和氨基氮，在生長中期則由于細胞代謝酶系已形成，利用蛋白質(zhì)的能力增強。因此，在培養(yǎng)基中有機和無機氮源應(yīng)當混合使用。39有些產(chǎn)物受氮源的誘導與阻遏。除個別微生物外（如黑曲霉生產(chǎn)酸性蛋白酶需高濃度的銨鹽），通常蛋白酶的產(chǎn)生受培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)或脂肪的誘導，而受銨鹽、硝酸

19、鹽以及氨基酸的代謝阻遏。這時應(yīng)選取蛋白質(zhì)等有機氮源為主。404、物理化學條件適宜1）pH值各大類微生物一般都有它們生長繁殖的最適pH。細菌的最適pH一般在7.0-8.0，放線菌在pH7.5-8.5間，酵母菌在pH3.8-6.0間，霉菌在pH4.0-5.8之間。對于具體的微生物菌種來說，它們都有各自特定的最適pH范圍，有時會大大突破上述界限。41在微生物生長繁殖過程中會產(chǎn)生引起培養(yǎng)基pH改變的代謝產(chǎn)物，尤其是不少微生物有很強的產(chǎn)酸能力，如不適當?shù)丶右哉{(diào)節(jié)，就會抑制甚至殺死其自身。在設(shè)計它們的培養(yǎng)基時，就要考慮到培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)能力。一般應(yīng)該加入磷酸緩沖液或CaCO3，使培養(yǎng)液的pH 穩(wěn)定。42調(diào)

20、節(jié)K2HPO4和KH2PO4兩者濃度比，可獲得從pH6.0到pH7.6間一系列穩(wěn)定的pH，當兩者等摩爾濃度比時，溶液的pH可穩(wěn)定在6.8。其反應(yīng)式如下：K2HPO4 + HCl KH2PO4 + KClKH2PO4 + KOH K2HPO4 + H2O432）滲透壓等滲溶液適宜微生物的生長，高滲溶液會使細胞發(fā)生質(zhì)壁分離，而低滲溶液則會使細胞吸水膨脹。 3）氧化還原電位一般來說好氧微生物的Eh值為+0.3-+0.4V；兼性厭氧微生物在+0.1V以上時進行好氧呼吸，在+0.1V以下時則進行發(fā)酵，厭氧微生物只能在+0.1V以下才能生長。 445、根據(jù)培養(yǎng)的目的培養(yǎng)基的成分直接影響著培養(yǎng)的目標。在設(shè)計培養(yǎng)基時必須考慮是要培養(yǎng)菌體，