免疫細胞的分離技術(shù)2011

1、第三節(jié)免疫細胞的分離技術(shù)免疫細胞的種類與特征免疫細胞的分離技術(shù)免疫細胞分離的臨床意義免疫系統(tǒng)的組成中樞：胸腺、骨題免疫髓官淋巴結(jié)、脾臟、粘膜相關(guān)淋巴組織等免疫柔統(tǒng)免疫細腿：淋巴細腿、單核巨噬細跑、粒細腮、DC、肥大細腮、NK細腹免疫分子：擾體.補體、細腮囲子、MHC、TCR、粘附分子等定義：人類在種菜迸丫匕過程中形炭萌、經(jīng)遺傳獲霄萌免疫，遇病原體后莒先養(yǎng)逑速趙彷N乍用萌免疫血普組欣：皮U粧膜及茸產(chǎn)將、細脛（驅(qū)細腥、單核丟噬細腿.DC.NKT、中幢粒細跑、yST細脛、B1細胞丿等特點：先天具有.無濟伏期.無特弄無記憶牲乍用時同：096小時Adaptiveimmunity定義：機體在圭満過程中,丫

2、接觸擾原牲將質(zhì)而獲浮的免疫。TvB細腮諛列病原體眈分后產(chǎn)主的免疫龐答特涼：后天獲語、有潛伏期、特弄牲，記憶牲賽與細腮:T細脛和B細脛趙乍用時間：晚,般在感辭后45天發(fā)揮乍用一、免疫細胞的種類與特征免疫細胞的分類凡參與免疫應(yīng)答或與免疫應(yīng)答有關(guān)的細胞，通稱為免疫細胞(immunocyte),其中包括淋巴細胞.單核細胞、巨噬細胞.NK細胞、樹突狀細胞DC.肥大細胞.粒細胞等根據(jù)免疫細胞在免疫應(yīng)答中的作用可分為三類免疫活性細胞(immunocompetentcells)抗原提呈細胞(antigen-presentingcells，APC)其他細胞淋巴細胞（T、B細胞）樹突狀細胞NK細胞單核細胞/巨噬細

3、胞中性粒細胞嗜酸性粒細胞嗜堿性粒細胞肥大細胞W紅細胞血小板免疫細胞種類Immunology免疫細胞的起源與分化粒/巨噬細胞前體細胞巨核/紅細胞前體細胞共同淋巴樣前體細胞共同髓樣前體細胞巨核細胞有核紅細胞Lz效應(yīng)1匕XZ細胞漿細胞活化的T細胞T細胞B細胞粒細胞（或多形核白細胞;驚：驚：囂未誠體單核細胞專囂0肥大細胞巨噬細胞未成熟樹突狀細胞血小板紅細胞1/淋巴結(jié)0成熟樹突秋細胞免疫活性細胞具有待異性抗原受體.在接受抗原刺激下發(fā)生克隆性活化、增值和分化，產(chǎn)生適應(yīng)性免疫應(yīng)答(adaptiveimmuneresponse)6&細胞。這類細胞是機體產(chǎn)生待異性免疫應(yīng)答的包括T細胞、I?(aniigenpre

4、sentingce_LAPC)皆H憐asm*芾#列弄常搟鋼粛如廉爭flff満8松淞轎雷褂。目掛-frM刪SAPC鑿活W開弗冷溺對浴并搟津B密津其他細胞自然殺傷（NK）細胞，肥大細胞,1中性粒細胞，嗜破性粒細胞，血小板等NK細胞肥大細胞嗜酸性粒細胞嗜中性粒細胞嗜堿性粒細胞血小板免疫細胞的特征免疫細胞的特征1、免疫細胞的形態(tài)學特征理化性狀2、免疫細胞的表面分子特征：白細胞分化抗原指血細胞分化成熟為不同譜系.分化的不同階段以及細胞活化過程中，出現(xiàn)或消失的細胞表面標記分子聚類分化群（分化抗原，clusterofdifferentiation,CD）：應(yīng)用單克隆抗體鑒定為主的方法，將來自不同實驗室的單克

5、隆抗體所識別的同一分化抗原稱為CD抗原CD抗原常用于鑒定和檢測淋巴細胞表面標志人CD分組分組CD(舉例)T細胞CD2、CD3.CD4.CDS.CD8、CD28.CD152(CCD154(CD40L).CD272(BTLA).CD278(ICOS)CD294(CRTH2)B細胞CD19CD20、CD21CD40CD79a(Iga)CD79b(Igp)CD80(B7-1).CD86(B7-2).CD267(TACI)、CD268(BAFFR)CD269(BCMA).CD307(IRTA2)髓樣細胞CD14.CD35(CR1)CD64(FcyRI)CD256(APRIL)CD257(BAFF).CD

6、312(EMR2)血小板CD36.CD41(整合蛋白allb).CD42a-CD42dCD51(整合蛋白av八CD61(整合蛋白卩3八CD62P(P選凝素)NK細胞CD16(FcyRIII).CD56(NCAM-1).CD94.CD158(KIR).CD161(NKR-P1A).CD314(NKG2D)CD335(NKp46)、CD336(NKp44)、CD337(NKp30)非譜系CD30.CD32(FcyRII).CD45RA.CD45RO.CD46(MCP)CD55(DAF).CD59.CD252(OX40L).CD279(PD1)CD281-CD284(TLR1-TLR4).CD289

7、(TLR9).CD305(LAIR-l).CD306(LAIR-2).CD319(CRACC)黏附分子CDlla-CDllcCD15.CD15s(sLx).CD18(整合蛋白卩2).CD29(整合蛋白卩1).CD49a-CD49f.CD54(ICAM-1).CD62E(E整合蛋白).CD62L(L整合蛋白人CD324(E-cadherin).CD325(N-cadherin)CD326(EpCAM)細胞因子/趨化因子受體CD25(IL-2Ra).CD95(Fas).CD116-CDwl37.CD178(FasL)、CD183(CXCR3).CD184(CXCR4).CD195(CCR5)CD2

8、61-CD264(TRAILR1-TRAILR4)內(nèi)皮細胞CD105(TGF-pRIII)CD106(VCAM-l).CD140(PDGFR)CD144(VE鈣黏蛋白人CD299(DCSIGN-related).CD309(VEGFR2)JAM1(CD321)JAM2(CD322)碳水化合物結(jié)構(gòu)樹突狀細胞CD15u.CD60a-CD60c.CD75.CDw327-CDw329(siglec6.7.9)CD85(ILT/LIR).CD273(B7DC)CD274-CD276(B7H1-B7H3)CD3O2(DCL1)CD303(BDCA2).CD304(BDCA4)干細胞/祖細胞基質(zhì)細胞CD13

9、3、CD243CD292(BMPR1A).CD293(BMPR1B).CD331-CD334(FGFR1-FGFR4).CD339(Jagged-l)紅細胞CD233-CD242分組人CD分組CD（舉例）（五）NK細胞的分離技術(shù)二免疫細胞的方離技術(shù)（一）夕卜周血單個枚細胞分離T淋巴細胞及其亞群的分離（三）B淋巴細胞及其亞群的分離）Mo/M0分離技術(shù)免疫細胞分離基本原理不同纟田胞密度不同不同纟田胞表面生物學特4生不同不同纟田胞表面分化抗原不同免疫細胞的分離技術(shù)根據(jù)不同的實驗的可以采取下列不同的分離方法h密度樺度離心法2、黏附分離法（尼龍毛法、貼壁法.親和板法）3、璉性分離法4、熒光澈活分離法5、

10、為*（花環(huán)沉降法）poojqejaqdudd)碼(OWSdsjpojuapnuououi疇溶4審Btef*星令酬晦的責珂留匕（一）不同細胞密度不同單個核細胞（淋巴細胞和單枚細胞）的密度為1.077左右人的紅細胞密度為1.093,1.077粒細胞密度為1.092,1.077血小板密度輔助性T細胞HelperTcells，Th效應(yīng)T細胞EffectorTcells，TE細胞毒T細胞CytotoxicTlymphocytes，CTLA遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)T細胞DelayedTcells,Td初始T細胞NaiveTcellsA調(diào)節(jié)性T細胞RegulatoryTcells,Tr記憶T細胞MemoryTcell

11、s,Tm抑制性T細胞SuppressorTcells,輔助性T細胞HelperTcells，ThThl:細胞免疫Th2：體液免疫Thl7：炎癥反應(yīng)輔助性T細胞HelperTcells，ThTh1%pMHCL4Th2L17IFNGIL4IL-237IL-23ROIL-12IL-12R初始T八柬激ThOCXCR3a31尸川GpMHCTCRIL-4IFN-yR(Stat6T-bepribi1FNGIFNyIL-4R亠IFN-yTNF-a細胞免疫CCR3.4.8IL-4IL-5IL-13體液免疫IL-17IL-17FTh17輔助性T細胞HelperTcells，Th濾泡輔助性T細胞（Tfollicul

12、arhelper,Tfh）通過細胞因子IL-10和IL-21來調(diào)節(jié)B細胞的功能調(diào)節(jié)性T細胞RegulatoryTcells,TrCD4+CD25+Foxp3+Treg細胞的分化Foxp+T調(diào)節(jié)細胞可以從胸腺直接分化，也可在TGF-p作用下從Foxp3-T細胞分化。（二）T淋巴細胞及其亞群的分離玫瑰花結(jié)法（E花環(huán)沉降法）尼龍毛柱分離法淘洗法免疫磁珠法流式細胞術(shù)分選法玫瑰花結(jié)法人T淋巴細胞表面表達CD2分子,即綿羊紅細胞受體，B細胞則無。在適當?shù)臈l件下，可與綿羊紅細胞(SRBC)結(jié)合，形成玫瑰花結(jié)(rosette)個為紅細胞環(huán)繞T細胞，形似花環(huán)，所以又稱E花環(huán)(Erosette)該實驗常用于臨床檢

13、測人外周血T淋巴細胞的數(shù)量和比例，由此可間接反映機體的細胞免疫功能狀況方法淋巴細胞+SRBC懸液-37C水浴10min-低溫低速離心fT細胞形成E花環(huán)而沉于管底懸液中為B細胞。尼龍毛柱分離法A混合單個核細胞懸液在通過尼龍毛柱時，B細胞、漿細胞、單核細胞和一些輔助細胞被選擇性粘附于尼龍毛上，而T細胞不與尼龍毛粘附的特性，這是獲得富含T細胞群的有效方法優(yōu)點簡單，快速，經(jīng)濟，尼龍毛可反復(fù)利用可分離大量細胞細胞不會被激活，可用于功能測定缺點純度不髙耗時淘洗法也叫親合板結(jié)合分離法(immunepanningisolation)。A利用親合層析和抗體固相包被原理，將相應(yīng)抗體結(jié)合于塑料平板上，由于各種淋巴細

14、胞亞群具有不同抗原性的特點和表面標志，加細胞懸液后，凡抗原陽性的細胞則與相應(yīng)的固相抗體結(jié)合，抗原陰性的細胞可從未吸附的細胞懸液中獲取同理若用特異性抗原交聯(lián)于塑料板上，則可分離得到具有特異抗原受體的淋巴細胞。但淋巴細胞受體與特異抗原或抗體連接后有可能引起細胞激活，因此，凡欲去除細胞懸液內(nèi)某一細胞亞群時，本法更合適親和板分離淋巴細胞示意圖與板匕抗體對應(yīng)的喪面抗原洶巴細胞混合液加入板屮IJ.洗滌板上除0其他細胞T淋巴細胞淘洗分離原理利用丁淋巴細胞表面某種標志性抗原與包被在固相載體上的特異性單抗結(jié)合，將T細胞與其他細胞分離的方法方法（以CD4+T細胞為例）1.羊抗兔ig包被平皿2.CD4一抗培育T細胞

15、，倒入平皿，4C孵育1小時;3.收集未粘附的CD4-T細胞PBS漂洗非特異吸附的CD4-T細胞收集粘附的CD4+T細胞，可以用刮板刮取并在顯微鏡下觀察免疫磁珠法(Magneticactivatedcellsorting,MACS)免疫磁珠法分離細胞是基于細胞表面抗原能與連接有磁珠的特異性單抗相結(jié)合，在外加磁場中，通過抗體與磁珠相連的細胞被吸附而滯留在磁場中，無該種表面抗原的細胞由于不能與連接著磁珠的特異性單抗結(jié)合而沒有磁性，不在磁場中停留，從而使細胞得以分離免疫磁珠細胞分選原理直接標記和間接標記ENAiCMMtNrLMAMilO忡EVALUATIOH!OuCATIO*iEXHKTlSE陽性選擇

16、法（正選）OO陰性選擇法（負選）正選和負選的比較正選優(yōu)點只需要一種抗體分離出的細胞純度高對于比例小的細胞群，正選容易得到高純度缺點需要特異性附靶細胞標記可能引起細胞活化負選需要的細胞沒有被抗體等標記對需要的細胞，不需要特異性的細胞標記需要多種抗體標記不需要的細胞It!16TTof免疫磁珠細胞分選裝置Affiiltcnyibiotac.ccn盲刨區(qū)|P百復(fù)嚇文件Si(l奩君牧慈工具肋電）|E8出|免疫爲h.從年HXCS.MACS.厳MAIS.AkacsANg.bPart.Ac-;ACDe-AsaAcub七刪:a.MACSCellSeparationReagentsIforhumancellsIT

17、cellsICD4*TcellschonaclarquaccCCD4+Tcells一VindovsInternetExplorerMACSC?CellSepardtionReagentsforhumancellsStemandpregenixorcellsTcellsPanTcellsACD獷TcellsCDe*7cells0Regulator/TcellsOthertcellsubsetsNKcellsBCellsMcnoc/tesDendriticcell;Antigen-presentingcellsGranulocytes3ndmyeloidcellsLeukocytesErythro

18、idcellsMegfloryocytesandplateletsEndothelialcell;EpithelialcellsFibroblastsNeuralcellsCytckirc-producingcellsTumorcellsFcrcccotorblockingfornon-humanprimatecellsformousecellsforratcellsforindrectmagneticlabalirgforapoptcticanddeadcellsforisolaricnofmitochondriaMACSCellSeparatiorColumnsMACSSep33torsa

19、utcHACSCellSeparationCD/1MicroBeadsProductApplicationsordernoCD4MicroBcads,humanPositiveselectionofhuman130045101Thelpercells;deplecicnofhumanThelpercells,mcnDcyt*srderdriticcellsWholeBloodCD4MicroRefldsProductApplicatioiifiorderno.WholeBloodCD4IsclatonM84callsfrom130090877MicroBcads,humanhumanwhole

20、bleedandbonemarrowCD4MultiSortKitProductApplicationsorderno.CD4MultiSortKitrhumanIsclatondFhum3rThelper130-055101cellsubsetsCD4TCellIsolationKitilProductApplicationsorderno.CD4TCellIsolationKitII,Isclobonofuntouded130-091-155humanhumanThelpercellsPomPBMCsbydepletiorcfnor-U：乙*TcellsNdiveCD4TCellIsold

21、tlociKitUProductApplicationsorderno.NaiveCD4rcellIsolationIsclatonoruntouched130094131KitIIrhuinanhumannav1helFerCllsFpmEHCsbydepletionorron-CD4TcellsondmemoryTcellsMemoryCD4*TCellIsolationKitProductApplicationsordernoMemoryCD4*TCellIsoldliunTsclationofuncoucbed130-091-893Kit,humanhum亦memoryThelperc

22、ellsfrom=BMCsbydeplericrcfncn-CD-lTcellsandnaiveTcellsCD”centralMemoryICellisolationKitToolboxiSiCon-aciHchSharePrintthispageMyfavoritesYourcurrentfavoritelistisempty.SeorchthiswebsiteScorchAdvancedsearch免疫磁珠法陽性選擇T細胞將特異性抗T細胞表面分子的單克隆抗體與磁性小珠形成免疫磁珠，用這種免疫磁珠從PBMC中結(jié)合T細胞在磁場中，結(jié)合T細胞的免疫磁珠固定了，未結(jié)合的其它細胞被洗脫下來撤離磁場

23、，再從免疫磁珠上洗脫T細胞免疫磁珠法陰性選擇T細胞免疫磁珠法陰性選擇T細胞將多種特異性抗非T細胞表面分子的單克隆抗體與磁性小珠形成免疫磁珠，用這種免疫磁珠從PBMC中結(jié)合非T細胞在磁場中，結(jié)合其它細胞的免疫磁珠固定了，未結(jié)合的T細胞被洗脫下來免疫磁珠法陰性選擇CD4+T細胞實例CD4+TCellIsolationKitIICD4-PEPBMCbeforeseparationCD4-PEUntouchedCD4+TcellsoHLLeAQOggn迅kbbchngofun*wonkdcclkwithbiotinyhtedanbody44Tcdlsareretainedin3MACS*Columnp

24、lacedInaMACSSeparator.CD4*T11$throughChetolumnandare-collectedastheensfifhed,ufihbalwlcedfraction.Non-CD4+TcellsinPBMC,i.e.,CD8+Tcells,ylbTcells,Bcells,NKcells,dendriticcells,monocytes,granulocytes,anderythroidcells,areindirectlymagneticallylabeledbyusingacocktailofbiotin-conjugatedantibodiesagainst

25、CD8,TCRyCD19,CD56,CD14,CD16,CD36,CD123,andCD235a(glycophorinA).ThesecellsaresubsequentlymagneticallylabeledwithAnti-BiotinMicroBeadsfordepletion.Thereby,highlypureCD4+Tcellsareobtained熒光激活細胞分離法(fluorescenceactivatedcellsorterFACS)FACS用途：用流式細胞儀對單個細胞進行快速定量分析與分選的_門技術(shù)原理：包在鞘液中的細胞通過高頻振蕩控制的噴嘴，形成包含單個細胞的液滴，在

26、激光束的照射下，這些細胞發(fā)出散射光和熒光，經(jīng)探測器檢測，轉(zhuǎn)換為電信號，送入計算機處理，輸出統(tǒng)計結(jié)果，并可根據(jù)這些性質(zhì)分選出高純度的細胞亞群，分離純度可達99%流式細胞儀工作原理示意圖分選樣品一01=18FSCCD5PerCP方法（以CD4+T細胞為例）PBMC用PBS洗滌，低溫離心棄上清;加入含AB血清的PBS封閉，4C孵育10分鐘;加入適量的PerCP-CD3，APC-CD4抗體，4C孵育30分鐘;PBS洗滌，低溫離心棄上清并用RPMI1640重懸;流式細胞術(shù)分選;（三）B淋巴細胞及其亞群的分離A如果僅考慮PBMC中T細胞和B細胞，那么所有從PBMC中分離T淋巴細胞的方法實際上也可用于分離B

27、淋巴細胞。B細胞表面標志SmlgFc受體、補體受體.EB病毒受體，部分CD分子是B細胞的重要表面標志，其中以Smlg為B細胞所特有，是鑒定B細胞可靠的指標CD19/CD5分子：可將B細胞區(qū)分為B1細胞和B2細胞，B1細胞為CD19和CD5雙陽性，而B2細胞僅為CD19陽性，B2細胞為通常所指的B細胞去除Mo/M0法終濃度5mML-leucinePMBC,混勻，室溫35smethylester(L-LME)重懸離心，400g,10min,棄上清，PBS洗滌細胞重懸于25mlRPMI除細胞團塊1640培養(yǎng)基，過尼龍毛柱，去玫瑰花結(jié)法去除T細胞抗CD19或CD20單抗標記，流式細胞儀檢驗B細胞純度免

28、疫磁珠法陽性選擇B細胞免疫磁珠法陽性選擇B細胞將特異性抗B細胞表面分子CD19的單克隆抗體免疫磁珠與PBMC混合，用這種免疫磁珠從PBMC中結(jié)合B細胞在磁場中，結(jié)合B細胞的免疫磁珠固定了，未結(jié)合的其它細胞被洗脫下來撤離磁場，再從免疫磁珠上洗脫CD19+B細胞將多種特異性抗非B細胞表面分子的單克隆抗體與磁性小珠形成免疫磁珠，用這種免疫磁珠從PBMC中結(jié)合非B細胞在磁場中，結(jié)合其它細胞的免疫磁珠固定了，未結(jié)合的B細胞被洗脫下來免疫磁珠法陰性選擇B細胞實例CO19PEPBMCbeforeseparationudUFWco二TfCD19PEUntouchedBcellsoda(D4eyBCellIso

29、lationKitIIMagneticIdbellngofunwarnedcellsandAnti*BiotinMicrofteadsNon-8clKretainedin.aMACSColumnplxedinaMACSSeparator.BcellsjMSiihrough(hiecatumndnidarecolltM45thnrkMd,unbteldcollfraction.Non-Bcells,i.e.9Tcells,NKcells,monocytes,dendriticcells,granulocytes,platelets,anderythroidcells,areindirectlym

30、agneticallylabeledusingacocktailofbiotinylatedCD2，CD16,CD14,CD36,CD43,andCD235a(glycophorinA)antibodies.ThesecellsaresubsequentlymagneticallylabeledwithAnti-BiotinMicroBeadsfordepletionHighlypureBcellsareobtainedbydepletionofmagneticallylabelednon-Bcells（四）Mo/M0分離技術(shù)A單核巨噬細胞包括骨髓中的前單核細胞、外周血中的單核細胞、以及組織內(nèi)

31、的巨噬細胞（M（p）oM（p來源于血液中的單核細胞，而單核細胞又來源于骨髓中的前體細胞。Mo/M0細胞*表面標志A表面標志抗原：CD14,但CD14也表達在粒細胞。CD14主要強表達在單核-巨噬細胞，弱表達在粒細胞上黏附法無血清RPMI1640培養(yǎng)液將PBMC2x106cell/ml重懸；75ml培養(yǎng)瓶中加入10ml細胞懸液，于培養(yǎng)箱內(nèi)37C孵育1小時；吸盡培養(yǎng)液，RPMI1640培養(yǎng)液漂洗2遍，去除非黏附細胞；細胞刮片輕輕刮取黏附的單核細胞。優(yōu)點快速，方便純度和得率均較低缺點易引起Mo/M0激活，引起基因表達和分泌蛋白免疫磁珠法陰性選擇單核細胞免疫磁珠法陽性選擇單核細胞將特異性抗單核細胞表面分子CD14的單克隆抗體免疫磁珠與PBMC混合，用這種免疫磁珠從PBMC中結(jié)合單核細胞在磁場中，結(jié)合單核細胞的免疫磁珠固定了，未結(jié)合的其它細胞被洗脫下來*撤離磁場，再從免疫磁珠上洗脫CD14+單核細胞將多種特異性抗非單核細胞表面分子的單克隆抗體與磁性小珠形成免疫磁珠,用這種免疫磁珠從PBMC中結(jié)合