實(shí)驗(yàn)四兔抗SRBC免疫血清的純化課件

1、實(shí)驗(yàn)四 兔抗SRBC免疫血清的純化 抗血清純化的目的是盡量除去抗血清中與目的抗體不相關(guān)的成分。 抗血清純化的方法主要有粗提法和精制法兩個(gè)過程。 粗提法主要常用硫酸銨鹽析法 精制法分非特異性和特異性兩種類型。 非特異性方法如葡聚糖凝膠過濾法、離子交換 層析法，其方法均系基于蛋白質(zhì)分子的物理性質(zhì)。 特異性方法如免疫吸附法，其方法基于抗原抗 體的特異性反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)?zāi)康模菏煜っ庖哐寮兓椒ǎ}析法）的原理了解抗體的純化方法（鹽析法）和步驟實(shí)驗(yàn)原理: 蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度是由蛋白質(zhì)周圍親水基團(tuán)與水形成水化膜的程度，以及蛋白質(zhì)分子帶有電荷的情況決定的。 當(dāng)用中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液，中性鹽對(duì)水分子的親和力

2、大于蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)分子周圍的水化膜層減弱乃至消失。同時(shí)，中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液后，由于離子強(qiáng)度發(fā)生改變，蛋白質(zhì)表面電荷大量被中和，更加導(dǎo)致蛋白溶解度降低，使蛋白質(zhì)分子之間聚集而沉淀。 在溶液中加入中性鹽使生物大分子沉淀析出的過程稱為“鹽析” 常用的中性鹽中最重要的是（NH4）2SO4，因?yàn)樗c其他常用鹽類相比有十分突出的優(yōu)點(diǎn)： 溶解度大；分離效果好；不易引起變性； 價(jià)格便宜；廢液不污染環(huán)境。 蛋白質(zhì)由于分子質(zhì)量和攜帶的電荷不同，可在不同濃度的高鹽溶液內(nèi)分級(jí)析出。 pH7: 50%飽和硫酸銨，可沉淀出所有類型Ig； 33%飽和硫酸銨，可沉淀出大部分分IgG； 40%飽和硫酸銨，沉淀最多，IgM和I

3、gA增多。實(shí)驗(yàn)用品：飽和硫酸銨溶液(400g-500ml;70-80 20min；趁 熱過濾；濃氨水調(diào)pH至7.4;室溫保存）兔抗SRBC免疫血清0.1mol/L、pH7.4磷酸鹽緩沖液 （含0.2g/L疊氮鈉）生理鹽水，蒸餾水器材 離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)、天平、磁力攪拌器、透析袋、燒杯、滴管等實(shí)驗(yàn)方法:1、鹽析2、透析除鹽3、蛋白含量測(cè)定 取一100ml燒杯： 10ml免疫血清10ml生理鹽水 置于磁力攪拌器上，邊攪拌邊滴加入飽和硫酸銨20ml(至50飽和度) 10000r/min, 4 0C離心10min，棄上清（含白蛋白）(50ml離心管) 沉淀（含球蛋白）中加入20ml生理鹽水溶解 滴加飽和硫酸銨10ml (至33飽和度) 10000r/min離心10min，棄上清 （球蛋白析出） 靜置30min沉淀物中加4ml生理鹽水,裝入透析袋（除鹽）透析袋放入盛有蒸餾水的大燒杯中，4下透析4h將燒杯中的蒸餾水換為生理鹽水透析48h，其間反復(fù)換液數(shù)次.(以除去剩余硫酸銨)將透析袋中樣品收集到4個(gè)1.5ml管中取一管,從中取少許做稀釋，以紫外分光光度計(jì)測(cè)量蛋白量,其余,置-20 保存. 蛋白含量(mg/ml) =(1.45OD280