正常細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)(miao)

1、正常細(xì)胞，不管是來(lái)自人或動(dòng)物的細(xì)胞，在體外培養(yǎng)時(shí)都不易生長(zhǎng)，建立細(xì)胞系更難，因?yàn)樗鼈兪且逊只募?xì)胞，對(duì)體外生存條件要求嚴(yán)格，目前體外模擬的培養(yǎng)條件都還達(dá)不到與體內(nèi)相一致的要求。正常細(xì)胞在體外并非不能培養(yǎng)，只要各種條件適當(dāng)仍然有培養(yǎng)成功的可能，初代培養(yǎng)較傳代細(xì)胞系容易。正常細(xì)胞培養(yǎng)可用于許多方面，如研究細(xì)胞代謝、物理、化學(xué)、生物因素的影響，作為 觀察和檢測(cè)手段研究活細(xì)胞的變化變異、分化，可從細(xì)胞水平開展亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和代謝分子的表達(dá)，也可大量培養(yǎng)用于生物制品的生產(chǎn)，等等。一、上皮細(xì)胞培養(yǎng)上皮細(xì)胞可來(lái)源于外、內(nèi)、中三個(gè)胚層，其中來(lái)源于內(nèi)外胚層的上皮細(xì)胞可呈膜狀生長(zhǎng)。不同器官的上皮細(xì)胞均具有不同的特定的

2、功能，培養(yǎng)上皮細(xì)胞不僅有利于研究其功能，還可為燒傷、燙傷的皮膚進(jìn)行上皮膜層移植，加速傷口愈合，不留疤痕，在皮膚美容方面也具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。上皮細(xì)胞培養(yǎng)有三個(gè)難點(diǎn)：需特殊底物 如需在底層涂以膠原或鋪上飼養(yǎng)層細(xì)胞，以利于生長(zhǎng)。需特殊的培養(yǎng)液 如加濃縮維生素及氨基酸的EMEM及KGM培養(yǎng)消化上皮細(xì)胞、EGM培養(yǎng)一般上皮細(xì)胞等，價(jià)格昂貴。與上皮細(xì)胞混雜的成纖維細(xì)胞的過(guò)度生長(zhǎng)，常常干擾上皮細(xì)胞在體外的培養(yǎng)使其難以長(zhǎng)期生存。為此，需要從表皮別離、培養(yǎng)液和基質(zhì)底物的選擇、增加適當(dāng)生長(zhǎng)因子等方面著手，以抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)上皮細(xì)胞生長(zhǎng)。由此可見，要純化和延長(zhǎng)上皮細(xì)胞生存期，抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)或去除或減少

3、成纖維細(xì)胞是上皮細(xì)胞培養(yǎng)成功的關(guān)鍵。(一)表皮細(xì)胞別離與培養(yǎng)皮膚是表皮細(xì)胞的重要來(lái)源，小兒陰莖包皮是表皮培養(yǎng)的好材料。目前，全皮培養(yǎng)混有大量成纖維細(xì)胞，因而不采用，常采用皮膚表皮和真皮別離培養(yǎng)法可獲得純上皮細(xì)胞。 1無(wú)菌條件下切取皮膚標(biāo)本，以角化層薄者為佳，早產(chǎn)、流產(chǎn)胎兒皮膚更好。 2將皮塊置于消化液中進(jìn)行消化，此時(shí)表皮層與真皮層自然別離，表皮層為淺棕色，真皮層為白色。 3取出表皮層再進(jìn)行第二次消化 。 4待充分消化后，剪碎移至瓶?jī)?nèi)參加適量培養(yǎng)液，吹打分散制成細(xì)胞懸液，用不銹鋼紗網(wǎng)過(guò)濾，調(diào)整細(xì)胞濃度，用含15%胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行分瓶培養(yǎng)，3天后可見大局部上皮細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。 (二)乳腺上皮細(xì)胞

4、別離培養(yǎng)乳腺主要由腺上皮組成，早期乳汁或斷奶后的乳汁含有上皮細(xì)胞團(tuán)塊，可用離心法收集上皮細(xì)胞，培養(yǎng)時(shí)常用人胚小腸成纖維細(xì)胞作飼養(yǎng)層可抑制間質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)。 (1) 取材， 于產(chǎn)后27天收集乳汁1:1的比例與培養(yǎng)基混合。 (2) 低速離心，仔細(xì)去除上清，收集細(xì)胞。 (3) 細(xì)胞洗滌后置于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。 (4) 35天更換培養(yǎng)基，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后可消化、傳代 。 (5) 用乳腺細(xì)胞培養(yǎng)上皮細(xì)胞時(shí)，注意：應(yīng)盡可能去除脂肪組織，如果標(biāo)本中纖維組織較多，可用膠原酶消化法獲取細(xì)胞，初時(shí)有巨噬細(xì)胞存在，可作飼養(yǎng)層細(xì)胞，培養(yǎng)時(shí)也可用經(jīng)照射或用絲裂霉素C處理過(guò)的3T3細(xì)胞作飼養(yǎng)層細(xì)胞，或用膠原層，培養(yǎng)液中也可加刺激生長(zhǎng)

5、因子如EGF、胰島素、氫化可的松、豬促乳素和前列腺素E1等，有利于細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖。 表皮細(xì)胞生長(zhǎng)融合成片，并向復(fù)層開展 表皮細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，呈多邊形，不規(guī)那么(三)子宮頸上皮細(xì)胞別離培養(yǎng)子宮頸上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)在細(xì)胞癌前病變及致癌的研究中有重要意義 。常用組織塊法進(jìn)行原代培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)需用經(jīng)照射或絲裂霉素C處理的3T3細(xì)胞作滋養(yǎng)層。培養(yǎng)液需添加適當(dāng)?shù)拇碳どL(zhǎng)的添加物。 1收集活檢標(biāo)本， 盡可能防止污染。2洗滌、剪碎，去除纖維組織。337培養(yǎng)10天以上，組織塊貼壁，參加EGF并用此培養(yǎng)液換液。4消化、分散、傳代培養(yǎng)。(四) 肝細(xì)胞別離培養(yǎng)可用組織塊法和原位灌注消化法收獲肝細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，其形態(tài)規(guī)那么

6、，適于作多種功能的研究。肝臟原位灌注消化法：從門靜脈或其分支中插管，用無(wú)鈣、鎂PBS沖洗肝臟15分鐘，然后用膠原酶液灌注15分鐘，使纖維組織網(wǎng)被消化，經(jīng)過(guò)23次離心別離，可獲得大量肝細(xì)胞懸液。培養(yǎng)時(shí)可將肝細(xì)胞接種在游離漂浮的膠原薄片上，細(xì)胞能較好地表達(dá)其功能 。 (五) 胰腺細(xì)胞別離將獲取的胰臟標(biāo)本修剪切碎后消化，并使之浮于牛血清白蛋白溶液上，經(jīng)過(guò)3次離心別離收集細(xì)胞，在水浴槽中用旋轉(zhuǎn)法使細(xì)胞聚集224h，接種涂布了膠原的培養(yǎng)皿，可獲得體外培養(yǎng)的胰腺細(xì)胞。 此法可用于家鼠和人胰腺細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)采用照射過(guò)的肺成纖維細(xì)胞作為飼養(yǎng)層，效果更佳。 (六) 氣管及支氣管上皮細(xì)胞別離培養(yǎng)在血清存在條件下

7、，正常人氣管上皮細(xì)胞停止分裂和生長(zhǎng)分化，因此需用無(wú)血清培養(yǎng)基(LHC-9),可使組織碎塊的氣管上皮細(xì)胞生長(zhǎng)，并且抑制纖維細(xì)胞生長(zhǎng)。 (七) 前列腺細(xì)胞培養(yǎng)前列腺細(xì)胞的培養(yǎng)，關(guān)鍵是改進(jìn)培養(yǎng)液的成分，參加激素樣生長(zhǎng)因子，以刺激前列腺細(xì)胞生長(zhǎng)，抑制纖維細(xì)胞生長(zhǎng)，可用于研究前列腺的生長(zhǎng)和功能。 (八) 口腔粘膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)口腔粘膜上皮為復(fù)層鱗狀上皮，體外培養(yǎng)口腔粘膜上皮細(xì)胞的關(guān)鍵是：用膠原酶消化法使鱗狀上皮細(xì)胞層與底層的間質(zhì)分開，再進(jìn)一步用胰蛋白酶消化法使鱗狀上皮細(xì)胞別離為單細(xì)胞懸液，然后在角化細(xì)胞培養(yǎng)液(KGM)中培養(yǎng)。 (九) 胃上皮細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)正常人胃上皮細(xì)胞對(duì)研究胃癌癌變機(jī)理有很大應(yīng)用價(jià)值。但

8、培養(yǎng)難度大，培養(yǎng)成功要注重三點(diǎn)：第一，用膠原酶和透明質(zhì)酸酶消化法，并用消化細(xì)胞；第二，應(yīng)用膠原底物培養(yǎng)；第三，制備含有特定成分的培養(yǎng)基。 胃上皮細(xì)胞培養(yǎng)多加血清并不能促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，可能與血清中含有抑制上皮細(xì)胞生長(zhǎng)的TGF-1有關(guān)。完全培養(yǎng)基中添加的許多種成分和生長(zhǎng)因子，可利于上皮細(xì)胞生長(zhǎng)，而且呈現(xiàn)對(duì)胞外基質(zhì)ECM的依賴性，尤以型膠原對(duì)胃上皮細(xì)胞作用更好。 二、中胚層細(xì)胞培養(yǎng)中胚層細(xì)胞培養(yǎng)包括結(jié)締組織、肌肉組織、骨組織、骨髓細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、血細(xì)胞等的培養(yǎng)。(一)結(jié)締組織細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)中包括人在內(nèi)的結(jié)締組織細(xì)胞(如成纖維細(xì)胞等)都很容易培養(yǎng)成功，也是其他組織培養(yǎng)時(shí)的副產(chǎn)物，無(wú)需特殊的培養(yǎng)條件，常規(guī)

9、培養(yǎng)即可。其生物學(xué)特性穩(wěn)定，不易發(fā)生轉(zhuǎn)化，成為二倍體細(xì)胞的主要來(lái)源，人的二倍體細(xì)胞系主要為成纖維細(xì)胞。為獲取大量成纖維細(xì)胞，用人和動(dòng)物胚體為好。動(dòng)物可用鼠胚或雞胚，人胚可取皮膚(包皮或胎兒皮膚)、肺、腎，這些都是很好的研究和應(yīng)用對(duì)象。1、人胚肺細(xì)胞別離培養(yǎng)人胚肺細(xì)胞可建立二倍體細(xì)胞系，可用于病毒疫苗的生產(chǎn)和研究，還可用來(lái)生產(chǎn)-干擾素(IFN-)等生物制品。 傳代培養(yǎng)能穩(wěn)定生長(zhǎng)，但有壽命限制，一般可連續(xù)傳至6515代左右。染色體數(shù)為2n=46條，通常以1:2傳代后，一周內(nèi)可形成單層，其形態(tài)和生長(zhǎng)特性穩(wěn)定，無(wú)致瘤性，對(duì)某些病毒敏感，但本身無(wú)潛在病毒和支原體污染。國(guó)際公認(rèn)的人胚肺二倍體細(xì)胞系為WI-

10、38和MRC-5等。 人胚肺細(xì)胞的別離和培養(yǎng)方法如下： (1)取妊娠35個(gè)月人工流產(chǎn)的正常胎 兒，無(wú)菌取肺組織。 (2) 洗滌、剪切、消化，常規(guī)培養(yǎng)，注 意觀察細(xì)胞的形態(tài)、密度變化，及時(shí)換液、傳代。2、人胚腎細(xì)胞別離培養(yǎng)人胚腎細(xì)胞利用腎臟的皮質(zhì)細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化分散后制成，該細(xì)胞呈類梭形，細(xì)胞界限較模糊，消化時(shí)間要控制好，原代培養(yǎng)時(shí)血清濃度以20%為宜，貼壁較牢固，傳代培養(yǎng)時(shí)，消化時(shí)間可適當(dāng)延長(zhǎng)。細(xì)胞來(lái)自于妊娠35個(gè)月人工流產(chǎn)的正常胎兒 ，無(wú)菌取得。3、人羊膜細(xì)胞別離培養(yǎng)人羊膜細(xì)胞目前已建立了細(xì)胞系，通過(guò)轉(zhuǎn)化后，可以無(wú)限制傳代，常用FL、Wish人羊膜細(xì)胞別離、繁殖某些病毒，并用來(lái)測(cè)定干擾素的

11、效價(jià)。正常的人羊膜細(xì)胞也易于培養(yǎng)。 細(xì)胞來(lái)自于剖腹產(chǎn)、順產(chǎn)胎兒或新生兒的胎盤中的羊膜。4、實(shí)驗(yàn)室也經(jīng)常使用幼地鼠腎細(xì)胞、鼠胚及地鼠胚成纖維細(xì)胞、雞胚纖維母細(xì)胞等，這些細(xì)胞的別離培養(yǎng)與人細(xì)胞的別離培養(yǎng)根本方法是一樣的。 (二) 肌肉組織細(xì)胞骨骼肌、心肌和平滑肌細(xì)胞都可在體外培養(yǎng)中生長(zhǎng)，心肌細(xì)胞在培養(yǎng)的最初幾天還具有自動(dòng)節(jié)律性收縮功能，傳代培養(yǎng)時(shí)可能會(huì)逐漸喪失這種功能。平滑肌細(xì)胞可通過(guò)胰蛋白酶或膠原酶消化法從血管氣管壁及腸壁中獲得。骨骼肌可從四肢中獲得。肌細(xì)胞含有數(shù)種抗原標(biāo)記物，如肌漿球蛋白、原肌凝蛋白等。肌動(dòng)蛋白等可在大多數(shù)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，但并非細(xì)胞的特有標(biāo)記物，肌細(xì)胞分化時(shí)肌酸磷酸酶活性升高 。1

12、、骨骼肌細(xì)胞別離培養(yǎng)動(dòng)物胚或幼體四肢，特別是大腿肌組織為最好的培養(yǎng)材料，取材常用生后12天的乳鼠Wistar大鼠更好。人骨骼肌細(xì)胞來(lái)源最好是人工流產(chǎn)的孕期為35個(gè)月的健康胎兒肢體。無(wú)菌取肌組織，洗滌、剪切、消化。常規(guī)培養(yǎng)，注意觀察細(xì)胞形態(tài)、數(shù)量的變化，及時(shí)換液、傳代。肌肉細(xì)胞成片后，可用胰蛋白酶消化分散，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，可傳1020代。 2、心肌細(xì)胞培養(yǎng)心肌組織是最早利用的培養(yǎng)材料之一，最常用的是孵育1012天的雞胚心肌，新生大鼠、乳鼠及人胎兒心肌等。心肌是比較容易培養(yǎng)和生長(zhǎng)的組織，可應(yīng)用多種方法進(jìn)行培養(yǎng)，如懸滴培養(yǎng)、組織塊培養(yǎng)和消化培養(yǎng)法等。主要是取心室肌培養(yǎng)，消化別離方法與前相同。 (三)

13、各種骨細(xì)胞別離培養(yǎng)包括軟骨細(xì)胞別離培養(yǎng)、成骨細(xì)胞別離培養(yǎng)和破骨細(xì)胞別離培養(yǎng)等。1、軟骨細(xì)胞別離培養(yǎng)軟骨分為生長(zhǎng)部和休止部，其中生長(zhǎng)部軟骨細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下代謝較活潑，具有形成軟骨基質(zhì)的功能和成骨細(xì)胞的某些特性。軟骨細(xì)胞埋藏于致密的糖蛋白軟骨基質(zhì)中，必須經(jīng)過(guò)一系列酶消化,才能獲得少量細(xì)胞，在呈弱堿性并增加Mg+濃度的培養(yǎng)液中易于生長(zhǎng) 。操作要點(diǎn)是：切碎軟骨組織，用透明質(zhì)酸酶、胰蛋白酶和膠原酶消化兩遍以除去基質(zhì)，再用膠原酶長(zhǎng)時(shí)間消化，收集細(xì)胞，按常規(guī)貼壁單層細(xì)胞培養(yǎng)法，培養(yǎng)于弱堿性的F12培養(yǎng)液中。 體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞，很像上皮樣細(xì)胞，可形成具有折光性的細(xì)胞外基質(zhì)，經(jīng)甲苯胺蘭染色呈異染性。細(xì)胞組

14、織化學(xué)染色：軟骨細(xì)胞可以特異性合成葡萄糖胺聚糖(GAG),型和型膠原，并具有堿性磷酸酶活性(免疫組化陽(yáng)性)，也可用定量法測(cè)出其含量。 2、成骨細(xì)胞別離培養(yǎng)骨細(xì)胞是一種終末化的細(xì)胞，埋藏于骨基質(zhì)中，從皮質(zhì)骨中別離培養(yǎng)骨細(xì)胞至今未見報(bào)導(dǎo)，只是在胎鼠或雞胚顱骨細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)見到少量星狀細(xì)胞，呈花邊樣網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。在某些激素(如甲狀旁腺素)的作用下或無(wú)血清培養(yǎng)中，這些細(xì)胞可變?yōu)閳A形，二羥基維生素D3可以刺激某些成骨樣細(xì)胞變?yōu)樾菭?。骨?xì)胞可以和成骨細(xì)胞一起從胎鼠或雞胚顱蓋骨上別離出來(lái)，也可由體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞分化而來(lái)，陽(yáng)性的細(xì)胞剛別離時(shí)為圓形，貼壁生長(zhǎng)變?yōu)樾切?，具有胞漿突起，數(shù)日后胞突連成網(wǎng)狀，使星形細(xì)胞相互連

15、接，不依賴于細(xì)胞外基質(zhì)。 成骨細(xì)胞包繞在硬組織中，致使處理困難，用骨組織塊法、酶消化法、骨膜組織法、骨髓培養(yǎng)法以及薄層骨片經(jīng)EDTA處理，并經(jīng)膠原酶消化，均可別離培養(yǎng)出成骨細(xì)胞，體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞保持有骨組織細(xì)胞的某些特性。3、破骨細(xì)胞別離培養(yǎng)破骨細(xì)胞的研究說(shuō)明，脾臟和骨髓中單個(gè)核細(xì)胞可以互相融合形成多核的破骨細(xì)胞，隨血流到達(dá)破骨細(xì)胞活動(dòng)活潑的部位，在新生動(dòng)物的長(zhǎng)骨內(nèi)面反復(fù)沖洗或用膠原酶消化，新生動(dòng)物的顱蓋骨都可獲得破骨細(xì)胞，用骨髓培養(yǎng)法也可使單個(gè)核細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞。(四) 骨髓細(xì)胞的別離培養(yǎng)骨髓可分為造血干/祖細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞兩類，均可在體外進(jìn)行培養(yǎng)，擴(kuò)增和開展細(xì)胞定向分化的研究。骨髓基質(zhì)細(xì)

16、胞在骨髓中可為造血干/祖細(xì)胞提供微環(huán)境，可分泌許多種細(xì)胞因子，對(duì)造血干/祖細(xì)胞的分化起著獨(dú)特的支持作用。此外，骨髓基質(zhì)細(xì)胞還與成骨效應(yīng)密切相關(guān)，目前認(rèn)為骨髓基質(zhì)細(xì)胞有內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、網(wǎng)狀細(xì)胞、脂肪細(xì)胞或骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞等，因此，對(duì)開展成骨效應(yīng)、成骨細(xì)胞分化和上述各類細(xì)胞的別離、鑒定及其功能的實(shí)驗(yàn)研究，已引起科研人員和臨床醫(yī)生的極大興趣。體外大量擴(kuò)增骨髓基質(zhì)細(xì)胞應(yīng)用于臨床治療骨不連及軟骨缺損具有廣闊的應(yīng)用前景。 1、骨髓細(xì)胞來(lái)源新生動(dòng)物及胚胎骨的骨髓，人和胎兒的骨髓，成人取自術(shù)后骨，胎兒取自流產(chǎn)胎兒骨的骨髓或臨床上抽骨髓檢查時(shí)剩余的骨髓或自愿供骨髓者。2、骨髓細(xì)胞的別離培養(yǎng)骨髓中的細(xì)胞，一

17、類為不能貼壁、在培養(yǎng)基中懸浮生長(zhǎng)的造血干/祖細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、紅細(xì)胞，另一類為能緩慢貼壁生長(zhǎng)的骨髓基質(zhì)細(xì)胞，這兩類細(xì)胞不僅形態(tài)上有明顯差異，而且別離培養(yǎng)方法、條件以及功能應(yīng)用性研究也有所不同。 體外培養(yǎng)的骨髓細(xì)胞中紅系集落形成單位CFUE體外培養(yǎng)的骨髓細(xì)胞中單核巨噬細(xì)胞集落形成單位CFUGM 培養(yǎng)4d的骨髓基質(zhì)細(xì)胞伸展生長(zhǎng)、呈長(zhǎng)菱形肌樣外觀培養(yǎng)1周的骨髓基質(zhì)肌樣細(xì)胞網(wǎng)狀 懸浮生長(zhǎng)的造血干/祖細(xì)胞，假設(shè)在骨髓培養(yǎng)的細(xì)胞中參加不同細(xì)胞因子，如G-CSF或M-CSF或EPO，同時(shí)均參加IL-3、IL-6，在軟瓊脂和甲基纖維素半固體培養(yǎng)基的24孔板中可形成不同的集落，這種試驗(yàn)既可用于測(cè)定細(xì)胞因子的效價(jià)，

18、又可檢查骨髓細(xì)胞的造血功能，同時(shí)也可從細(xì)胞中抽提總RNA，通過(guò)RT-PCR，可克隆相應(yīng)的基因。此外，還可用于測(cè)定對(duì)化療藥物的敏感性和耐藥性 。這些細(xì)胞在多種細(xì)胞因子的作用下，其中的造血干細(xì)胞在體外既保持其分化潛能又大量擴(kuò)增，可用于骨髓移植。 經(jīng)體外培養(yǎng)貼壁的骨髓基質(zhì)細(xì)胞，可用于細(xì)胞因子自分泌和誘導(dǎo)分泌能力的測(cè)試。骨髓基質(zhì)細(xì)胞能分泌多種調(diào)節(jié)免疫和造血功能的細(xì)胞因子，證明基質(zhì)細(xì)胞能支持造血、提供造血微環(huán)境，也為體外擴(kuò)增干細(xì)胞用于骨髓移植提供了新技術(shù)、新方法。擴(kuò)增的基質(zhì)細(xì)胞不僅可直接應(yīng)用于臨床治療骨髓抑制、成骨能力障礙性疾病，而且可通過(guò)基因?qū)敕ㄩ_展基因治療的研究。五內(nèi)皮細(xì)胞的別離培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞在血管

19、內(nèi)形成單層內(nèi)外表，標(biāo)本來(lái)源多為牛主動(dòng)脈、牛腎上腺皮質(zhì)毛細(xì)血管、鼠腦皮質(zhì)毛細(xì)血管、人臍靜脈以及人皮膚和脂肪的毛細(xì)血管。采用血管內(nèi)注入膠原酶的灌流消化法，可使內(nèi)皮細(xì)胞別離，然后培養(yǎng)在鋪有明膠基質(zhì)的培養(yǎng)器皿中，如果標(biāo)本來(lái)源是毛細(xì)血管，培養(yǎng)時(shí)需參加有絲分裂原，假設(shè)來(lái)源于大血管那么不用加。內(nèi)皮細(xì)胞易于從血管別離進(jìn)行培養(yǎng)成單層，對(duì)研究?jī)?nèi)皮細(xì)胞再生長(zhǎng)、腫瘤促血管生長(zhǎng)因子TAF等有很大應(yīng)用價(jià)值。(六) 血液細(xì)胞別離培養(yǎng)正常血細(xì)胞在體外培養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)間短，只有白血病、血友病、淋巴瘤細(xì)胞可培養(yǎng)成功并建立細(xì)胞系，但多半為EB病毒等致瘤病毒引起的轉(zhuǎn)化細(xì)胞(EBNA檢查陽(yáng)性)，DMSO處理也可誘導(dǎo)這些細(xì)胞分化發(fā)生逆轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)化

20、為正常細(xì)胞。所建立的細(xì)胞系多半為單核細(xì)胞系、B淋巴細(xì)胞系、T淋巴細(xì)胞，在IL-2產(chǎn)品問(wèn)世后，T細(xì)胞也可在體外建系、建株。 血細(xì)胞可從外周血中用梯度別離液通過(guò)離心分層后別離獲得，也可從脾臟、扁桃體、淋巴結(jié)中用機(jī)械法切碎過(guò)篩別離獲得淋巴細(xì)胞，從腹腔刺激后的沖洗液中可獲得多量的單核一巨噬細(xì)胞，從骨髓中可以獲得前體血細(xì)胞，并可長(zhǎng)期培養(yǎng)生長(zhǎng)，參加生長(zhǎng)因子或某些物質(zhì)有利于細(xì)胞純化并促進(jìn)分化和生長(zhǎng)繁殖。 1、外周血細(xì)胞別離培養(yǎng)外周血中除紅細(xì)胞外，還有粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞及血小板等，通常是別離白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、血小板的重要來(lái)源。其別離方法有四種：即自然沉降法、差異沉降法、氧化別離法、Ficoll分層法。

21、Ficoll別離法 采用Ficoll和泛影葡胺配制而成的淋巴細(xì)胞別離液，通過(guò)2000r/min離心后可使血細(xì)胞以不同比重將其別離開，如別離淋巴細(xì)胞可選用比重的別離液，假設(shè)別離血小板可用比重的別離液，假設(shè)別離骨髓中的單核細(xì)胞常用比重的別離液。 外周血中淋巴細(xì)胞的別離1500rpm, 20, 30min2、淋巴器官中的淋巴細(xì)胞的別離從人脾臟、淋巴結(jié)、扁桃體或胸腺等器官中制備淋巴細(xì)胞懸液，在免疫學(xué)研究中是經(jīng)常需要的。將淋巴器官剪成碎塊，用鑷子壓擠或在金屬絲網(wǎng)上研磨，或用玻璃勻漿器研磨，制成懸液，再用Ficoll別離法別離細(xì)胞，洗滌、計(jì)數(shù)，備用。 用上述別離法所獲得的細(xì)胞、淋巴細(xì)胞，可用于白細(xì)胞粘附移

22、動(dòng)試驗(yàn)、轉(zhuǎn)化試驗(yàn)、細(xì)胞毒試驗(yàn)，同時(shí)用于細(xì)胞因子的誘生和制備，或擴(kuò)增外周血造血細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、LAK細(xì)胞、T細(xì)胞等，供細(xì)胞移植用。3、人臍帶血細(xì)胞別離培養(yǎng)人臍帶血來(lái)源方便，臍血的血漿中富含許多高水平的造血活性物質(zhì)，具有刺激和促進(jìn)骨髓造血干/祖細(xì)胞增殖、分化和再植能力，是造血生長(zhǎng)因子的重要來(lái)源。臍血中富含類似于骨髓的造血干細(xì)胞，具有很強(qiáng)的自我復(fù)制和再植能力。臍血中還含有類似于骨髓的基質(zhì)細(xì)胞，對(duì)骨髓造血具有支持作用，在體外培養(yǎng)擴(kuò)增中具有更大的增殖能力，是造血干細(xì)胞移植的理想來(lái)源，已被應(yīng)用于許多血液病和惡性腫瘤的治療，并容易獲得骨髓造血功能的重建。目前，不少單位建立臍血庫(kù)，以不斷滿足研究和臨床應(yīng)用。4、巨噬細(xì)