蛋白質分離純化和定性定量分析

1、關于蛋白質的分離純化與定性定量分析第一張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月什么是蛋白質的分離純化分離：將蛋白質混合物分成單一的蛋白成分。純化：得到單一蛋白的純品。第二張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月為什么要純化蛋白質？研究特定蛋白質的生物學功能（酶、生物活性蛋白，etc）制備抗體蛋白質晶體學研究研究蛋白質-蛋白質相互作用第三張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月怎樣純化蛋白質？生化學家根據(jù)特定蛋白質與其他蛋白質的性質差異，來分離或純化它?？扇苄?、等電點、分子大小、生物學性質可溶性：硫酸銨沉淀等電點：離子交換層析分子大?。耗z過濾層析生物學性質：親和層析第四張，PPT共一百頁，創(chuàng)作

2、于2022年6月蛋白質純化的基本設計原則原料應易得到，并盡可能富含目的蛋白；應有特異性的蛋白質檢測方法（最重要的因素，決定了純化能否成功）；分級分離，先粗后細；純化條件盡量溫和，避免蛋白失活。第五張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月蛋白質的檢測方法蛋白質的活性檢測方法：必須快，必須是特異性的蛋白質的免疫學檢測方法：western-blot，前提是有特異的抗體第六張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月分離純化的一般程序前處理（取決于采用的材料） 動物材料處理：剔除結締組織和脂肪組織 種子處理：去種皮，有機溶劑脫脂 動物細胞破碎：勻漿器、超聲波處理 植物組織：研磨，纖維素酶 細菌破碎：超聲波

3、，溶菌酶如果蛋白質定位于某一細胞器，可用差速離心法將其分離。第七張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月相對離心力/g時間/min沉降的組分1 0005真核細胞4 00010葉綠體、細胞碎片、細胞核15 00020線粒體、細菌30 00030溶酶體、細菌細胞碎片100 000310 h核糖體第八張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月第九張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月粗分級分離（rough fractionation） 獲得蛋白質提取液后，用一定方法，將蛋白質與其它雜蛋白分離開來。 常用方法：鹽析、等電點沉淀、有機溶劑分級分離等 特點：簡便、處理量大、既能除去大量雜質（包括脫鹽），又

4、能濃縮蛋白質溶液。第十張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月細分級分離（fine fractionation） 主要方法： 層析：凝膠過濾、離子交換層析、吸附層析、親和層析等 第十一張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月1. 蛋白質的層析分離第十二張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月層析（chromatography）chrome意為“色彩”，graphy源自希臘文，意為“寫”?！皩游觥本褪恰吧V” 。層析最早由俄國植物學家 于1903年創(chuàng)造，1941年英國學者Martin和Synge提出分配層析，此后這種方法得到很大的發(fā)展。層析是利用物質在固定相與流動相之間不同的分配比例，達到分離目

5、的的技術。第十三張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月固定相：固定相是層析的基質。通常是固體（如吸附劑，凝膠，離子交換劑等），能與待分離的化合物進行可逆的吸附，溶解，交換等作用。流動相：在層析過程中，推動固定相上待分離的物質朝著一個方向移動的液體、氣體等，都稱為流動相。柱層析中一般稱為洗脫劑，薄層層析時稱為展層劑。 第十四張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月按操作形式不同分類：柱層析：將固定相裝于柱內，使樣品沿一個方向移動而達到分離。紙層析：用濾紙做液體的載體，點樣后，用流動相展開，以達到分離鑒定的目的。薄層層析：將適當粒度的吸附劑鋪成薄層，以紙層析類似的方法進行物質的分離和鑒定。 紙層

6、析和薄層層析主要適用于小分子物質的快速檢測分析和少量分離制備，通常為一次性使用；柱層析是常用的層析形式，適用于樣品分析、分離。生物化學中常用的凝膠層析、離子交換層析、親和層析、高效液相色譜等都通常采用柱層析形式。第十五張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月第十六張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月怎樣純化蛋白質？生化學家根據(jù)特定蛋白質與其他蛋白質的性質差異，來分離或純化它?？扇苄?、等電點、分子大小、生物學性質可溶性：硫酸銨沉淀等電點：離子交換層析分子大?。耗z過濾層析生物學性質：親和層析第十七張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月1. 離子交換層析離子交換層析利用物質的電荷與層析載體（

7、離子交換劑）電荷之間的相互作用而達到分離純化的目的，屬于吸附層析。離子交換層析的固定相稱為離子交換劑，由基質和基團兩部分組成?；|：纖維素、瓊脂糖、葡聚糖、苯乙烯-二乙烯苯等高分子聚合物；基團：共價結合在基質上的帶電基團，可分為正電基團和負電基團。第十八張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月第十九張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月Ion-Exchange chromatographyIf pH mobile phase =7.2 Then charge of the proteins: (-) (-) (+) (+)-+-+Anion exchange column = + charg

8、ed第二十張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月Increased salt concentrationIon-Exchange chromatography-+-Na+Na+Na+Na+Na+Na+Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-+-Na+Na+Na+第二十一張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月基本操作過程樣品制備，裝柱與平衡上樣（樣品溶解于A液中）洗脫：穿透峰，洗脫峰收集、鑒定第二十二張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月離子交換層析有兩種洗脫方式分步洗脫：用間斷地遞增的不同離子強度的流動相分次洗脫樣品蛋白的方法；梯度洗脫：連續(xù)改變流動相離子強度的方法。目前隨著層析的自動化，梯

9、度洗脫成為大多數(shù)情況下的首選方案。第二十三張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月分步洗脫第二十四張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月梯度洗脫第二十五張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月2. 凝膠過濾層析利用分子量不同的蛋白質，通過凝膠分子篩時速度不同來分離蛋白質的方法。固定相：凝膠顆粒（gel bead），多孔的網(wǎng)狀結構，其網(wǎng)孔決定了凝膠的分級分離范圍，即能被該凝膠分離的蛋白質混合物的Mr范圍，如Sephadex G-50的分離范圍是150030000。常用的凝膠有Sephadex、Sepharose、Sephacryl、Superdex等。第二十六張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022

10、年6月Size-exclusion chromatography第二十七張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月Size-exclusion chromatographyAbsorbance at 280 is used to identify protein-containing fractions. You can also perform an enzyme specific assay.第二十八張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月要根據(jù)待分離物質的分子量，選擇特定的凝膠過濾基質；凝膠過濾層析不僅可用于親水性分子的分離，也可用于疏水性分子的分離，當用于疏水性分子分離時，該類層析往往被

11、稱為“凝膠通透層析”；凝膠過濾層析可提供樣品的分子量信息；凝膠過濾的上樣量一般在柱床體積的15；凝膠過濾的樣品濃度越大越好，但一般不要超過100mg/ml。凝膠過濾的注意事項第二十九張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月第三十張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月3. 親和層析以樣品的生物活性為依據(jù)的分離方法。生物分子的特點是有專一的活性，如酶與底物的結合，抗原與抗體，激素與受體，糖與凝集素等。將上述作用體系的一方連接到層析基質上，使之固定化，就有可能分離純化專一作用的另一方。第三十一張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月Affinity chromatographyMakes use

12、of specific binding interactions between molecules 1- Incubate crude sample with the immobilized ligand 2- Wash away non bound sample components from solid support 3- Elute 第三十二張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月Commonly used affinity columns:Ni2+ binds to poly Histines (example 6xHis)Specific antibodies (anti-Fla

13、g tag)glutathione binds to GSTProtein A or G binds antibodiesAffinity chromatography第三十三張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月Possible elution strategies:pHIon strenghDenatureCompetitor ligand or analogAffinity chromatography第三十四張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月Ni-NTA columnsThe high affinity of the Ni-NTA resins for 6xHis-tagged

14、 proteins or peptides is due to:1- the strength with which these ions are held to the NTA resinNTA has a tetradentate chelating group that occupies four of six sites in the nickel coordination sphere第三十五張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月2- the specificity of the interaction between histidine residues and immobili

15、zed nickel ions第三十六張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月第三十七張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月在各種表達載體上都帶有各種標簽蛋白，如GST-tag、His-tag、V5-tag等，它們不僅可用于鑒定蛋白表達與否，更可用于與之相連的目標蛋白的純化；通過免疫親和層析技術，只需一步，即可純化帶有標簽的目標蛋白。親和層析是基因工程中最常用的純化技術第三十八張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月高效與簡便：一旦固定化配體制備好后，操作使用非常方便；親和層析是高度濃縮的過程；可從樣品中去除大量雜質；可在活性物質中去除理化性質幾乎完全相同的但已失活的那些“雜質”。親和層析的

16、優(yōu)點第三十九張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月免疫親和層析：將蛋白質抗體偶聯(lián)到免疫親和柱可用于抗原蛋白的純化；凝集素親和層析：凝集素是一大類能專一性和糖類和糖復合物結合的蛋白質，固定化凝集素可用于糖蛋白純化；染料親和層析：有多種染料可與各種類型的酶結合，又不受酶的作用，可用于多種蛋白的分離。親和層析中的三大通用技術第四十張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月4. 疏水層析與反向層析蛋白質具有親水與疏水兩重性，如果在層析基質上接上疏水的基團，就能在一定條件下與某些蛋白質的疏水基團相互作用，使之吸附，而達到分離純化的目的。一般情況下，是高鹽吸附（12M 硫酸銨），降低流動相的鹽濃度，使樣品

17、洗脫。疏水層析的機制與離子交換層析正好相反，因此兩者是互補的。第四十一張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月反向層析，或稱反相色譜，reverse phase chromatography，是液相色譜分析中最常用的技術。當反相色譜用于蛋白質分離時，其原理與疏水層析基本相同，區(qū)別在于：疏水層析的配基疏水性較弱（苯基等），所以高鹽吸附，低鹽洗脫；反相色譜配基疏水性強（C18等），所以需要使用有機溶劑洗脫。反向層析與疏水層析原理相同第四十二張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月反相色譜分離蛋白質的原理第四十三張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月反相色譜是最高效的蛋白質層析技術之一第四十四張，

18、PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月第四十五張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月2. 蛋白質的電泳分離第四十六張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月電泳（electrophoresis）帶電粒子在電場中向與自身電荷相反的電極移動的現(xiàn)象稱為電泳。蛋白質是兩性電解質，在不同pH溶液中帶不同電荷，在直流電場中能夠泳動。第四十七張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月電泳基本原理蛋白質在電場中泳動時，受到兩種方向相反的力的作用：電場力 FqE，q為帶電量，E為電場強度摩擦力 Fffv，f為摩擦系數(shù)，v為遷移速度當?shù)鞍踪|以恒速運動時，F(xiàn)Ff0，即qEfv，此時：v/Eq/fq/6r第四十八張，PP

19、T共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月在一定介質中，蛋白質的q/f是一個定值，因此v/E也是定值，它被稱為電泳遷移率，即：v/E可通過實驗測定，蛋白質的值為0.110-4 1.010-4 cm2V-1s-1，它是蛋白質的特性之一。第四十九張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月電泳的分類自由電泳（移動界面電泳）區(qū)帶電泳：在支持物上，蛋白質混合物被分離成若干區(qū)帶。穩(wěn)態(tài)電泳：蛋白質遷移一段時間后達到穩(wěn)態(tài)，帶的寬度不再隨時間而改變。第五十張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月1. 聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠由丙烯酰胺（Acr）和甲叉雙丙烯酰胺（bis）經共聚合而成，此過程在TEMED和過硫酸銨催化下進行。A

20、cr在AP和TEMED的作用下形成單鏈，隨后通過bis的作用交叉互聯(lián)形成網(wǎng)狀結構，聚合成凝膠。凝膠的孔徑可在較寬范圍內變化，以迎合不同的分離需要。第五十一張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月第五十二張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月根據(jù)凝膠的均勻性（孔徑、pH）可分為連續(xù)與不連續(xù)兩類；根據(jù)是否加蛋白質變性劑，可分為變性與非變性兩類；根據(jù)是否加還原劑2-巰基乙醇或DTT，可分為還原與非還原兩類；還可根據(jù)電泳裝置的不同，分為圓盤電泳和平板電泳。PAGE的分類第五十三張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月平板PAGE第五十四張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月不連續(xù)平板PAGE，是使

21、用 最廣泛的蛋白質電泳技術，它由濃縮膠與分離膠兩部分組成。不連續(xù)PAGE有很高的分辨力，因為它有以下三種效應：濃縮效應電荷效應分子篩效應不連續(xù)PAGE第五十五張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月制備凝膠樣品電泳目的蛋白檢測基本操作第五十六張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月染色法：考馬斯亮藍染色法（多種類型可選）、銀染法；活性檢測法：適用于Native PAGE，其中蛋白質保持天然活性，可用酶學方法檢測；免疫印跡法：用特異性抗體檢測蛋白質的技術。PAGE的檢測方法多種多樣第五十七張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月2. 等電聚焦電泳根據(jù)蛋白質的等電點進行分離的一種技術?；驹恚豪?/p>

22、用兩性電解質載體形成一個連續(xù)而穩(wěn)定的線性pH梯度，使pH從正極到負極逐漸增加。蛋白質分子在偏離其等電點的pH位置帶電，因此在電場中可以移動；當?shù)鞍踪|移動到pH等于pI位點，其靜電荷為0，在電場中不再移動，據(jù)此可將不同pI的蛋白質分離。第五十八張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月第五十九張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月優(yōu)點樣品加樣位置和體積不受限制；分辨率高于其它類型電泳；可測定pI值；缺點樣品在pI區(qū)域易沉淀，為增加樣品溶解度，可以在膠中加入尿素，但導致蛋白質失活；樣品前處理麻煩。等電聚焦的優(yōu)缺點第六十張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月3. 雙向電泳將等電聚焦技術與SDS技術

23、組合起來的新技術，是目前分離蛋白質混合物最強大的技術，也是蛋白質組學研究的重要技術?；静襟E：第一相等電聚焦后，在等電聚焦的垂直的方向進行第二相SDS。第六十一張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月pH 3 - - - - - - 10（1） IEF等電聚焦電泳（2）SDS（3）染色脫色第六十二張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月考馬斯亮藍銀 染第六十三張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月可綜合利用層析和電泳分離純化蛋白質第六十四張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月第六十五張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月蛋白質的濃縮超濾法使用特制薄膜對溶液中的溶質分子進行選擇性過濾的技術

24、。常用離心力使蛋白質透過濾膜，而使蛋白質截留在膜內。第六十六張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月冷凍干燥法在冷凍狀態(tài)下使樣品中水分升華而濃縮蛋白質的技術，保持蛋白質構象的最好方法。注意：必須保證蛋白質始終處于冷凍狀態(tài)（在70冰箱預冷），為提高溶解度可加賦形劑（右旋糖酐、甘露醇等）。第六十七張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月吸收法采用吸水劑直接吸去蛋白質溶液中的水。PEG、蔗糖、凝膠干粉等。沉淀法硫酸銨、PEG、有機溶劑沉淀；免疫沉淀。第六十八張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月3. 蛋白質的含量測定第六十九張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月蛋白質的含量測定目前蛋白質的直接定

25、量分析技術只能測定樣品的總蛋白含量；目前沒有任何方法能直接分析樣品中某一特定蛋白成分的含量；最常用的蛋白定量方法是比色法，包括Bradford（考馬斯亮藍）、BCA法、紫外分光光度法等。第七十張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月1. Lowry法1951年Lowry在Folin酚試劑法和雙縮脲法的基礎上建立原理：第一步反應：在堿性溶液中蛋白與Cu2+反應形成紫紅色的絡合物； 第二步反應：酚試劑（磷鉬酸和磷鎢酸混合液）與蛋白質芳香族氨基酸反應呈深藍色。第七十一張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月優(yōu)點：同時分析多個樣品，簡便；靈敏度提高；避免酚試劑局限于色氨酸和酪氨酸所造成的蛋白質含量測定

26、偏差。缺點：要求溶液完全溶解透明；酚試劑在堿性溶液中穩(wěn)定性差，導致測定誤差；反應受多種物質干擾。第七十二張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月2. Bradford法由Bradford等人于1976年建立?；驹恚嚎捡R斯亮藍G-250在一定條件下可與蛋白質結合，導致其顏色從紅色變?yōu)樗{色，最大光吸收峰從465nm移至595nm，其吸收度與蛋白質濃度成正比。目前絕大多數(shù)公司都提供基于此原理的蛋白質定量試劑盒。第七十三張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月優(yōu)缺點優(yōu)點：操作簡便，配合酶標儀，可同時測定多個樣品；可測定低達25 g/ml的蛋白質樣品；對干擾劑不敏感；缺點：染料主要結合蛋白質的疏水區(qū)

27、，因此不同組成的蛋白質與染料的結合比例不同。第七十四張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月3. BCA法原理：第一步，在堿性溶液中，蛋白質與Cu2+反應形成復合物；第二步，BCA試劑與該復合物反應，生成深紫色化合物，在562nm處有吸收峰。優(yōu)點：操作簡便，線性范圍202000 g/ml；有試劑盒出售。第七十五張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月4. 紫外分光光度法原理：蛋白質中的Trp、Tyr在280nm有特征性吸收；肽鍵在215nm附近有特異吸收?？赏ㄟ^測定該波長的光吸收度，計算蛋白質濃度。CA/KL，其中A為吸光度，K為摩爾消光系數(shù)，L為光程。K值可通過各種方法得到（包括軟件分析等）

28、。第七十六張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月優(yōu)缺點優(yōu)點：操作簡便，且敏感度高（20 g/ml ）；樣品不損失，測定后可繼續(xù)使用。缺點：核酸可干擾測定結果；不同蛋白質芳香族氨基酸含量變動較大。第七十七張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月5. 凱氏定氮法1883年，丹麥化學家Kjeldahl建立，基于蛋白質的含氮量在16%左右。蛋白質+硫酸CO2+H2O+NH3硫酸銨+強堿氨優(yōu)點：適用樣品廣泛，結果可靠缺點：樣品中非蛋白態(tài)氨影響測定值；蛋白質氨基酸有偏差時（大量堿性氨基酸、酰胺、小分子量氨基酸）誤差較大；操作繁瑣。第七十八張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月4. 蛋白質分子量的測定第

29、七十九張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月1. SDS測定分子量基本原理：SDS可以破壞蛋白質中的疏水鍵和氫鍵，并按一定比例（1g蛋白質結合1.4g SDS）和蛋白質組成復合物，使蛋白質帶的負電荷的量遠遠超過其本身的電荷量，并與蛋白質的分子量成正比。2-巰基乙醇破壞了蛋白質二硫鍵，使蛋白質呈橢圓棒形，其軸長與分子量成正比。q/fq/6r，所有蛋白質的遷移率都相同。第八十張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月在SDS中遷移的蛋白質的分子量與電泳遷移率的關系符合下述公式：lg MrlgKbmK1bm其中Mr為蛋白質相對分子量，K、K1為常數(shù)，b為斜率，m為遷移率。注意：此公式也適用于核酸在瓊

30、脂糖凝膠中的遷移第八十一張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月第八十二張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月第八十三張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月在半對數(shù)坐標紙上做出標準曲線注意：標準曲線的斜率會根據(jù)所用凝膠濃度而發(fā)生微小的改變。第八十四張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月2. 凝膠過濾層析法測定分子量蛋白質在凝膠過濾層析柱中的洗脫體積Ve，與其分子量的關系如下式所示：lg MrK1K2 Ve在實驗中，只要測得幾種蛋白質分子量標準物的Ve，并以它們的lg Mr對Ve作圖得一直線，再測出樣品的Ve，即可從圖中得到樣品的分子量。第八十五張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月SD

31、S與凝膠過濾法是互補的凝膠過濾法測得的是蛋白質四級結構（如果它有的話）的分子量；SDS測得的是蛋白質亞基的分子量；在有2-巰基乙醇（或DTT）存在時，SDS可測得蛋白質每條多肽鏈的分子量。綜合應用這兩種方法，可得到待測蛋白質結構的許多信息。第八十六張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月例如： 凝膠過濾法得到的蛋白質分子量：180kD SDS（不加還原劑）結果：45kD SDS（加還原劑）結果：兩條蛋白帶（15kD和30kD）則結論是： 該蛋白質由4個相同的亞基組成，每個亞基由兩條多肽鏈經二硫鍵連接而成，兩條多肽鏈的分子量分別為15kD和30kD。第八十七張，PPT共一百頁，創(chuàng)作于2022年6月質譜法是最精確的分子量測