復雜先心病TGA基因組學及網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機制研究課件

1、復雜先心?。═GA）的基因組學及其網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機制研究鐘詩龍 博士 副研究員廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學研究中心、廣東省心血管病研究所病因與致病機制不明確：包括遺傳與環(huán)境因素先天性心臟病在活產(chǎn)嬰兒中的發(fā)病率為8-14.6嚴重影響威脅人口素質(zhì)，給社會和家庭帶來極大負擔盡管介入與手術(shù)能有效治療先心病，但先心病的幾個關(guān)鍵問題還沒有解決確定病因，有效預防實現(xiàn)早期診斷疾病、明確疾病分類預測預后，進行個體化干預闡明發(fā)病機制，發(fā)現(xiàn)治療靶標隨著理論與技術(shù)的發(fā)展，基因組學研究在先心病研究中扮有重要作用。提綱基因組學的分子生物學基礎(chǔ)；先心病的基因組學：染色體變異單基因突變；多基因突變TGA的基因組學及其網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機制研究簡介提綱

2、基因組學的分子生物學基礎(chǔ)；常見先心病的基因組學：染色體變異單基因突變；多基因突變TGA的基因組學及其網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機制研究簡介DNAmRNA(messenger)ncRNAProteinRibosometranscriptiontranscriptiontranslationEpigenetics先心病的分子生物學基礎(chǔ)：中心法則序列變異 單核苷酸（突變、SNP和indel）結(jié)構(gòu)變異微星、拷貝數(shù)變異（CNV）亞染色體組整個染色體組或基因組提綱基因組學的分子生物學基礎(chǔ)；常見先心病的基因組學：染色體變異單基因突變；多基因突變TGA的基因組學及其網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機制研究簡介先心病的遺傳學染色體異常引起的合并先心病的

3、綜合癥13 三體 1:15,00018 三體 1:5,00021 三體 (Down syndrome)1:80022q11缺失：法洛四聯(lián)癥、DiGeorge 綜合征其他較少見的染色體缺失包括：9q34, 1q21.1, 16p11.2 and 17p11.2.Page 85321 三體-唐氏綜合癥產(chǎn)前診斷絨毛膜絨毛活檢10/40Miscarriage 1%Results :1 week羊膜腔穿刺14/40Miscarriage 0.5%Results :3 weeks 用高通量測序法檢測胎兒非整倍體Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Dec 23;105(51):20

4、458-63BMJ. 2011 Jan 11;342:c7401懷孕年齡35.4歲，取血樣時懷孕時間13周又1天提綱基因組學的分子生物學基礎(chǔ)；常見先心病的基因組學：染色體變異單基因突變；多基因突變TGA的基因組學及其網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機制研究簡介先心病的遺傳學基因突變引起的先心病基因綜合征心臟畸形TBX1基因DiGeorge綜合征主動脈離斷、永存動脈干（PTA）、法洛四聯(lián)癥（TOF）、右室雙出口和大動脈換位TBX5基因Holt-Oram綜合征心臟畸形包括房間隔缺損（ASD）、TOF和房室傳導阻滯等TFAP2基因Char綜合征動脈導管未閉PTPN11基因Noonan綜合征胸部畸形和肺動脈狹窄（PS）NOT

5、CH通路JAG1、NOTCH2基因突變Alagille綜合征動脈-肝臟發(fā)育不良、肺動脈流出道或外周肺動脈的狹窄HOLT-ORAM綜合征和TBX5基因 Holt-Oram綜合征主要表現(xiàn)為肢體和心臟畸形，故又稱為心-手綜合征單倍體TBX5基因可導致Holt-Oram綜合征，TBX5基因突變也是人類首個在心臟間隔缺損畸形中找到的單基因突變。TBX5基因的錯義突變導致心臟或肢體的畸形則取決于其突變的位點單基因先心病的遺傳模式有一些顯示出明顯的孟德爾遺傳模型；有的顯性遺傳、有的隱性遺傳、有的伴性遺傳；有一些是為一個基因的結(jié)構(gòu)或功能的改變，即“單基因突變”；估計這種遺傳缺陷占 8% ；但是大部分的先心病是

6、多基因突變的結(jié)果。提綱基因組學的分子生物學基礎(chǔ)；常見先心病的基因組學：染色體變異單基因突變多基因突變TGA的基因組學及其網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機制研究簡介與遺傳性心臟疾病相關(guān)的致病基因突變肥厚性心肌病擴張性心肌病致心律失常性右室心肌病長QT綜合癥Brugada綜合征基因發(fā)生% 基因發(fā)生% 基因發(fā)生% 基因發(fā)生% 基因發(fā)生% MYH71220%LMNA26%PKP21143%KCNQ13035%SCN5A2025%MYBPC32028%MYH747%DSG2726%KCNH22530%GPD1LTNNT225%MYBPC337%DSP616%SCN5A510%CACNA1CTNNI313%TNNT214%DS

7、C2KCNE11%CACNB2TPM113%SCN5A23%JUPKCNE21%SCN1BMYL213%LDB313%RYR2ANK2KCNE3ACTC11%PLN13%TGFB3KCNJ2SCN3BMYL31%ACTN24%TMEM43CACNA1CGLA1%VCL3%DESCAV3LAMP21%SGCD3%SCN4BPRKAG21%CSRP32%AKAP9TNNC1DES2%SNTA1MYH6TNNI31%MYO6TPM11%TTNACTC11%CSRP3TCAP1%MYOZ2ABCC91%VCLCTF11%TCAPTNNC1ACTN2MYH6LDB3TTNPLNTAZJPH2EMDTTR

8、LAMP2MYLK2PSEN1CAV3PSEN2MTTIEYA4致病基因突變的發(fā)現(xiàn)有助于基因診斷如對有肥厚性心肌病的母親進行基因檢測，可以預測其子女的風險。但是如何決策?基因突變用于診斷與預測對遺傳性心血管病家庭進行遺傳學檢測的決策樹Caleshu C et al. Heart 2010;96:1669-1675檢測先心病患者致病突變可能致病突變未知功能突變陰性或良性突變檢測沒有發(fā)病家族成員陽性結(jié)果遺傳咨詢臨床監(jiān)護陰性結(jié)果無危險無需進一步檢測基因診斷檢測：益處與風險益處風險基因診斷檢測可以:確定胎兒或個體是否處于遺傳疾病的風險當胎兒處于風險是，可以是父母和醫(yī)生考慮盡早作出產(chǎn)前診斷性選擇。檢測結(jié)

9、果也可以:使個人和家人難于決斷；可能負面影響家庭穩(wěn)定性和個人關(guān)系基因突變用于預測預后：雙基因突變對肥厚性心肌病模型小鼠生存的影響有2個致病基因突變的個體比只含1個突變的家族性肥厚性心肌病病人更易發(fā)生嚴重的心衰Circulation. 2008;117:1820-1831肥厚性心肌病模型小鼠目前已知的基因突變僅能部分解釋先心病發(fā)病率：以肥厚性心肌病為例對80個不相關(guān)的先癥者進行7個HCM 基因 (b-MHC, MyBP-C, cTnT, cTnI, ACTC, MYL2, and MYL3) 作基因突變檢測在23個先癥者中檢測到26個基因突變，發(fā)生率為 (29%)以往的研究主要集中在候選的信號通

10、路或基因在全基因組范圍全面發(fā)現(xiàn)新的先心病的致病基因突變，闡明其遺傳傳遞規(guī)律，并系統(tǒng)地揭示其致病機制成為目前全世界研究重點。J Med Genet 2005;42:e59提綱基因組學的分子生物學基礎(chǔ)；常見先心病的基因組學：染色體變異單基因突變多基因突變TGA的基因組學及其網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機制研究簡介外顯子組測序發(fā)現(xiàn)完全性大動脈轉(zhuǎn)位（TGA）的致病基因突變及其致病機制研究TGA流行病學TGA是新生兒期最常見的紫紺型先天性心臟病，發(fā)病率為0.2-0.3，約占先天性心臟病總數(shù)的5-7，男女患病之比為2-4：1。若不治療，約90的患者在1歲內(nèi)死亡。TGA嚴重影響威脅人口素質(zhì)，給社會和家庭帶來極大負擔。TGA解剖

11、與功能分類TGA + IVSTGA + VSDTGA + AoCoa(RVOTO)TGA + PS (LVOTO)在病理上：大動脈轉(zhuǎn)位時，主動脈瓣下圓錐發(fā)達，未被吸收，主動脈位于左前上方；肺動脈瓣下圓錐萎縮，肺動脈位于作后下方。發(fā)病原因及其發(fā)病機制目前還不清楚。以往的研究主要集中在與體軸形成有關(guān)的信號通路或基因發(fā)現(xiàn)了一些TGA致病基因變異：CFC1、GDF1、NODAL等NODAL信號通路與左右體軸形成有關(guān)TGA的致病基因突變基因位置突變類型CFC1exon 4 splice donor siteIVS4DS DUPGDF1exon 3CYS227TERFOXH1exon 1Pro21SerN

12、ODALexon 29-BP INSERTION/24-BP DELETION, NT700Donor splice site of intron 2IVS2DS, G-A, +1exon 3IVS2-1GCMED13Lexon 6752A-GGLU251GLYexon 255615G-A、ARG1872HISexon 286068A-GASP2023GLYZIC3exon 21741A-T, LYS-TERexon 1763T-G,TRP255GLYexon 1GLY17CYSNKX2.5exon 2VAL150ILE這些突變不足以解釋TGA的高發(fā)病率；尤其在中國人中：我們在28個TGA患者

13、及10個家系成員中沒有檢測到這些突變科學問題能否在全外顯子組范圍找到引起TGA的致病基因突變？它們在父代與子代之間的傳遞規(guī)律如何？明確其傳遞規(guī)律將為早期診斷提供TGA分子預警的標記。通過系統(tǒng)生物學的方法識別基因組中關(guān)鍵節(jié)點基因及其網(wǎng)絡(luò)，對于致病基因突變的機制研究具有方向性指導作用。高糖對致病基因突變有沒有協(xié)同作用？全基因組外顯子測序（EXOME SEQUENCING）外顯子組測序是一種新型的基因組分析技術(shù)，只需針對外顯子區(qū)域的DNA即可，能夠發(fā)現(xiàn)位于編碼區(qū)的SNPs和小的InDels。因此與全基因組重測序相比，外顯子組測序更加簡便、經(jīng)濟、高效，已成為現(xiàn)階段基因測序工作的重心權(quán)重基因共表達網(wǎng)絡(luò)分

14、析權(quán)重基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析是一種用于解析分子作用機制和網(wǎng)絡(luò)關(guān)系的系統(tǒng)生物學方法。它充分利用基因表達的內(nèi)在信息，把高度關(guān)聯(lián)的轉(zhuǎn)錄子聚類成一族，稱作一個模塊(module)，然后識別與臨床相關(guān)的模塊，最后用模塊內(nèi)連通性（intramodular connectivity）和基因重要性（gene significance）識別信號通路上關(guān)鍵調(diào)控基因（Hub genes）。網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建Tools: Pearson correlation, Soft thresholdingRationale: make use of interaction patterns between genes模塊識別Tools:

15、TOM, Hierarchical clusteringRationale: module- (pathway-) based analysis找到模塊代表性基因Tools: eigengene (1st Principal Component)Rationale: Condense each module into one profile進一步分析模塊相關(guān)性，模塊重要性、析因分析等.第一部分：全基因組外顯子測序?qū)ふ襎GA的致病錯義基因突變1.篩選階段完全性大動脈轉(zhuǎn)位患者(12例)Agilent 全外顯子捕獲Solexa測序 生物信息學分析注釋和統(tǒng)計分析、排除非基因、內(nèi)含子、同義突變、已知SN

16、P 潛在致病突變Sanger測序排除沒有驗證的潛在致病突變 TGA患者150例包括核心家系50個健康志愿者500例基因型與表型是否發(fā)生共分離 驗證潛在致病突變 2. 驗證階段TGA主動脈瓣下圓錐組織權(quán)重基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析TGA肺動脈瓣下圓錐組織TGA肺動脈瓣下圓錐與干下型肺動脈瓣下圓錐的差異模塊干下型患者的肺動脈瓣下圓錐組織TGA的關(guān)鍵信號通路及關(guān)鍵節(jié)點基因TGA主動脈瓣下圓錐與干下型肺動脈瓣下圓錐的差異模塊TGA的差異模塊1. 權(quán)重基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析識別TGA的關(guān)鍵信號通路及關(guān)鍵節(jié)點基因，第二部分：致病錯義基因突變的分子機制野生型致病基因P19細胞功能Nodal信號應答突變型致病基因基因突變的功能及其分子機制