試驗(yàn)設(shè)計(jì)-骨髓基質(zhì)細(xì)胞系的建立

1、小鼠骨髓細(xì)胞群細(xì)胞系的建立一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?)通過培養(yǎng)小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞，建立小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞系2) 了解細(xì)胞培養(yǎng)的一般步驟和注意事項(xiàng)，培養(yǎng)無菌操作意識(shí)二、實(shí)驗(yàn)原理：細(xì)胞培養(yǎng)：多細(xì)胞生物，以細(xì)胞分裂的方式產(chǎn)生新的細(xì)胞，用來補(bǔ)充體內(nèi)衰老和死亡的細(xì)胞。移植到體外后，只要條件適合，依然保持著分裂增殖的能力。利用這個(gè)原理，將小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞移植到體外培養(yǎng)。通過一定的純化方法，從原代細(xì)胞得到傳代細(xì)胞，經(jīng)過若干代中，部分細(xì)胞發(fā)生遺傳物質(zhì)的變化成為無限傳代的性質(zhì)，分離得到細(xì)胞系。培養(yǎng)細(xì)胞純化：由于上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶的耐受性不同，成纖維細(xì)胞先脫壁，利用此道理，采用多次差別消化法將上皮細(xì)胞核成纖維細(xì)胞分

2、離而達(dá)到純化的目的三、材料：實(shí)驗(yàn)小白鼠四、藥劑及配制：DYEM培養(yǎng)基購買工清購買5溶液L)NaCl8.00KC10.40工 32Hpev 2Hgkh2po40.D6NaHCO：0.35酚紅0.0275%酒精縣取無水酒精75份定容至100.0 9%.生理掛水稱理941溶于少毫無菌水,定容至1L乙醵XzHCO3準(zhǔn)確稱理工5g溶解于100ml三蒸水，過濾除菌,分裝后4c保存口胰蛋白酶液根據(jù)原代細(xì)胞的貼壁程發(fā)空意，可選口口的，0-125%. 025%,用是為ImKnA1作用效分鐘口【例；聾璃稱取膜黃白醉梏末025g,用pH為&的DrHank s液溶期，定客至Wftnl；震蕩過夜！過濾3.22阿濾膜）除

3、菌，分裝；用之前用NaHCQ調(diào)節(jié)pH至72左右-26C保存】EDTA準(zhǔn)琬林益EDTA 002g,用D-Hank g液溶解后定容至100al1,高通高壓滅國，分裝-2CTC保存:雙抗溶液毒霉素：0.007-0,008g/100ml;鏈霉素:O.Olg/lOOnl；用時(shí)加在培養(yǎng)基里4%臺(tái)給藍(lán)取也臺(tái)給藍(lán)，用09%生理鹽水定容至IDOml,過濾，4C保存DMSO五、儀器器材：（1）培養(yǎng)皿X 3、500ml燒杯X 1、棉花、醫(yī)用解剖器材（剪刀、鐐子、解剖刀）、10ml注射器、4號(hào)針頭、離心管若干、三角瓶若干、25ml卡式瓶若干、滴管、精密 pH試紙、0.22m微孔濾膜、血球細(xì)胞計(jì)數(shù)板、標(biāo)簽紙、油性筆、凍

4、存管（2）超凈工作臺(tái)、CO2培養(yǎng)箱、 高速離心機(jī)、高壓滅菌鍋、顯微鏡、水浴鍋、-86C冰箱第一部分實(shí)驗(yàn)前遇備1、Sr）玻西善JR的清洗用5篝的鉆要法曜浸泡過夜用足量的法衣粉反復(fù)刷洗.悔瓶壁上的殘潰澆干凈三汽精干善年的器口三量箔酸鉀溶液（重絡(luò)酸弊120備流硫酸20（麗匕堡濯水；更經(jīng)1U浸泡過空專f*三三=強(qiáng)專1W勺三水寸三,殊甘斗亨孽水-九三二矗 士三2、無菌工作室及其內(nèi)物品的消毒滅菌（1）超凈工作臺(tái)檢查超凈工作臺(tái)是否正常；用之前用沾了 75%酒精的脫脂棉擦拭，再開30min的紫外照射（2） 小件物品用牛皮紙（報(bào)紙）將小件物品（如鐐子、解剖刀等）包裹好放進(jìn)飯盒里，放進(jìn)滅菌鍋，其他物品也一并放入蒸

5、汽滅菌鍋內(nèi)，95KPa、121c下滅菌30min （3）其他儀器滅菌 3、試劑配制（如上表）4、器材準(zhǔn)備5、注意：1）使用高壓滅菌鍋時(shí)注意正確使用方法，以免引起危險(xiǎn)2）超凈工作室和工作臺(tái)必須清理干凈，以免引起細(xì)胞污染浸泡?用5%的鹽酸溶液浸泡過夜刷洗?用足量的洗衣粉反復(fù)刷洗，將瓶壁上的殘漬洗干凈浸酸?將干燥后的器皿用重絡(luò)酸鉀溶液（重絡(luò)酸鉀120g:濃硫酸200ml:蒸儲(chǔ)水1L）浸泡過夜沖洗?將浸酸后的玻璃器皿用自來水沖洗，然后用蒸儲(chǔ)水，最后干燥、待用 第二部分原代培養(yǎng)器材：解剖刀、剪刀、鐐子、平皿、注射器、離心機(jī)、血球計(jì)數(shù)板、15ml離心管X 4、培養(yǎng)瓶X 2,冰塊試劑：乙醛、D-Hank s

6、溶液、生理鹽水 儀器：超凈工作臺(tái)、離心機(jī)、顯微鏡 步驟：1.取 樣1）超凈工作臺(tái)上的物品：滅菌后的解剖刀、剪刀、鐐子、注射器、平皿、冰塊2）將小鼠用乙醛麻醉后引頸處死（用培養(yǎng)皿盛），在盛有75%酒精的燒杯中浸泡5min。在超凈工作臺(tái)上分離雙側(cè)股骨（培養(yǎng)皿下置冰塊），在含生理鹽水的 50mm2玻璃平皿中去除股骨周圍肌肉組織（皿下置冰塊）。3）剪去髓端。用10mL注射器抽取食量 D-Hank s液沖洗骨髓腔，將骨髓沖入培養(yǎng)瓶。4）用4號(hào)針頭反復(fù)吹打骨髓細(xì)胞懸液，制成單細(xì)胞懸液，盛在離心管里。5）將懸液在1000r/min下離心5min后收集細(xì)胞2.原代培養(yǎng)1）取出部分細(xì)胞用顯微鏡計(jì)數(shù)【附：血球計(jì)數(shù)

7、板計(jì)數(shù)法】2）以1 x 108/ml細(xì)胞密度接種在25cm2卡式瓶中，加血清培養(yǎng)基3）在飽和濕度下5% CO2 37c恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3、注意：1）超凈工作臺(tái)上操作的基本規(guī)范；2）離心機(jī)的使用方法；第三部分傳代培養(yǎng)器材：卡式瓶若干、滴管、洗耳球、移液管試齊J: D-Hank s液、胰蛋白酶液、EDTA液材料：生長(zhǎng)良好的原代培養(yǎng)細(xì)胞步驟：1、從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)五天后的培養(yǎng)瓶，用滴管吸掉舊培養(yǎng)液2、用D-Hank s液洗滌細(xì)胞1或2次，洗去血清和活力弱的細(xì)胞【在培養(yǎng)瓶中滴加BSS直接傾倒，重復(fù)即可】3、用胰蛋白酶-EDTA液（1:1）消化分散貼壁細(xì)胞【加入消化液，37 C,數(shù)分鐘（看情況而定，顯

8、微鏡下細(xì)胞將要分離呈現(xiàn)圓粒狀即可）】4、加適量含血清的培養(yǎng)液終止消化作用，離心去上清液，加D-Hank s液洗滌1-2次5、輕拍培養(yǎng)瓶使細(xì)胞自瓶壁脫落，加入培養(yǎng)基，吹打混勻。按比例稀釋后接種到新的培養(yǎng) 瓶中培養(yǎng)。第四部分純化器材及儀器：吸管、離心管、培養(yǎng)瓶、顯微鏡、離心機(jī) 試劑：培養(yǎng)基、月K蛋白酶液、EDTA液材料：生長(zhǎng)良好的傳代培養(yǎng)細(xì)胞步驟：1）取出細(xì)胞培養(yǎng)瓶，用 0.25%胰蛋白酶一0.02%EDTA夜混合漂洗細(xì)胞，搖動(dòng)，用顯微鏡觀察，等到差不多半數(shù)細(xì)胞脫落后，停止消化2）將消化液用吸管吸出到離心管中，離心去上清，沉淀的細(xì)胞轉(zhuǎn)入新培養(yǎng)瓶中，加培養(yǎng)液培養(yǎng)3）原瓶加液繼續(xù)培養(yǎng)注意：各步驟均在無

9、菌工作室內(nèi)進(jìn)行第五部分凍存和復(fù)蘇試劑：培養(yǎng)基、 20%DMS。臺(tái)盼藍(lán)器材：凍存管、血球計(jì)數(shù)板、離心管、試管、培養(yǎng)瓶、吸管 儀器：-86C冰箱、離心機(jī)、顯 微鏡、水浴鍋步驟：1.離心用試管收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的純化培養(yǎng)細(xì)胞（如果不是，可更換培養(yǎng)瓶里的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h）,加血清培養(yǎng)基，重懸起細(xì)胞2.取0.1mL細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞濃度及凍前存活率.凍存液的配制：取離心管，加入血清培養(yǎng)基，逐滴加入DMSO至20%;用前配制，待置室溫下.取凍存液緩慢逐滴加入細(xì)胞懸液中，邊加變輕微搖動(dòng)，至 DMSO濃度成10% 止，細(xì)胞濃度15X106j/mL,混勻，分裝到凍存管中，標(biāo)記；留少量做污染檢測(cè).凍存：先將凍存管置

10、于 4 C10min ,調(diào)節(jié)冰箱，-20C30min, -80C18h;有條件的可以將凍存管放到液氮槽中長(zhǎng)期儲(chǔ)存6.復(fù)蘇：1）將取出的凍存管迅速投入 3740 c水浴中，振蕩；2）將細(xì)胞液吸出到培養(yǎng)瓶中，加培養(yǎng)液離心洗滌1-2次，除去凍存保護(hù)劑；3）將培養(yǎng)液細(xì)胞濃度調(diào)整到1 X 105-2 X 105個(gè)/mL ,常規(guī)培養(yǎng)注意事項(xiàng)：慢凍快蘇原理；凍存管若是安培瓶或無螺帽凍存管，小心凍存管爆裂，若是非螺旋蓋凍存管，應(yīng)注意防止水進(jìn)入而造成污染附1:細(xì)胞計(jì)數(shù)法實(shí)驗(yàn)原理：當(dāng)待測(cè)細(xì)胞懸液中細(xì)胞均勻分布時(shí)，通過測(cè)定一定體積懸液中的細(xì)胞的數(shù)目，即可換算出每毫升細(xì)胞懸液中細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目。具體操作：蓋好蓋玻片：取

11、一套血球計(jì)數(shù)板，將特制的蓋玻片蓋在血球計(jì)數(shù)槽上。制備計(jì)數(shù)用的細(xì)胞懸液：用吸管吸5滴細(xì)胞懸液到離心管中， 加入5滴臺(tái)盼藍(lán)，活細(xì)胞不會(huì)被染色，加入染液后就可以在顯微鏡下區(qū)別活細(xì)胞和死細(xì)胞。將細(xì)胞懸液滴入計(jì)數(shù)板：將待測(cè)細(xì)胞懸液吹均勻，然后吸取少量懸液沿蓋片邊緣緩緩滴入，要保證蓋片下充滿懸液， 注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中。統(tǒng)計(jì)4個(gè)大格的細(xì)胞數(shù)：將血球計(jì)數(shù)板放于顯微鏡的低倍鏡下觀察，并移動(dòng)計(jì)數(shù)板，當(dāng)看到鏡中出現(xiàn)計(jì)數(shù)方格后，數(shù)出四角的4個(gè)大銘（每個(gè)大格含有 16個(gè)中格）中沒有被染液染上色的細(xì)胞數(shù)目。計(jì)算原細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù) ：按照下面公式計(jì)算細(xì)胞密度：（細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)）ZmL= （4個(gè)大格子細(xì)胞數(shù)Z4） X2X 104說明：公式中除以4因?yàn)橛?jì)數(shù)了 4個(gè)大格的細(xì)胞數(shù)。 公式中乘 以2因?yàn)榧?xì)胞懸液于染液是 1:1稀釋。公式中乘以104因?yàn)橛?jì)數(shù)板中每一個(gè)大格的體積為： 1.0mm （長(zhǎng)）x 1.0mm （寬）x 0.1mm （高）=0.1mm3 而 1mL= 1000mm3 細(xì)胞計(jì)數(shù)要點(diǎn)： 進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)，要求懸液中細(xì)胞數(shù)目不低于1 X 107 L-1,如果細(xì)胞數(shù)目很少要進(jìn)行離心再懸浮于少量培養(yǎng)液中。要求細(xì)胞懸液中的細(xì)胞分散良好，否則影響計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性。取樣計(jì)數(shù)前，應(yīng)充分混勻細(xì)胞懸液，尤其時(shí)多次取樣計(jì)數(shù)時(shí)