試驗設計-骨髓基質細胞系的建立

1、小鼠骨髓細胞群細胞系的建立一、實驗目的：1)通過培養(yǎng)小鼠骨髓基質細胞，建立小鼠骨髓基質細胞系2) 了解細胞培養(yǎng)的一般步驟和注意事項，培養(yǎng)無菌操作意識二、實驗原理：細胞培養(yǎng)：多細胞生物，以細胞分裂的方式產生新的細胞，用來補充體內衰老和死亡的細胞。移植到體外后，只要條件適合，依然保持著分裂增殖的能力。利用這個原理，將小鼠骨髓基質細胞移植到體外培養(yǎng)。通過一定的純化方法，從原代細胞得到傳代細胞，經過若干代中，部分細胞發(fā)生遺傳物質的變化成為無限傳代的性質，分離得到細胞系。培養(yǎng)細胞純化：由于上皮細胞和成纖維細胞對胰蛋白酶的耐受性不同，成纖維細胞先脫壁，利用此道理，采用多次差別消化法將上皮細胞核成纖維細胞分

2、離而達到純化的目的三、材料：實驗小白鼠四、藥劑及配制：DYEM培養(yǎng)基購買工清購買5溶液L)NaCl8.00KC10.40工 32Hpev 2Hgkh2po40.D6NaHCO：0.35酚紅0.0275%酒精縣取無水酒精75份定容至100.0 9%.生理掛水稱理941溶于少毫無菌水,定容至1L乙醵XzHCO3準確稱理工5g溶解于100ml三蒸水，過濾除菌,分裝后4c保存口胰蛋白酶液根據(jù)原代細胞的貼壁程發(fā)空意，可選口口的，0-125%. 025%,用是為ImKnA1作用效分鐘口【例；聾璃稱取膜黃白醉梏末025g,用pH為&的DrHank s液溶期，定客至Wftnl；震蕩過夜！過濾3.22阿濾膜）除

3、菌，分裝；用之前用NaHCQ調節(jié)pH至72左右-26C保存】EDTA準琬林益EDTA 002g,用D-Hank g液溶解后定容至100al1,高通高壓滅國，分裝-2CTC保存:雙抗溶液毒霉素：0.007-0,008g/100ml;鏈霉素:O.Olg/lOOnl；用時加在培養(yǎng)基里4%臺給藍取也臺給藍，用09%生理鹽水定容至IDOml,過濾，4C保存DMSO五、儀器器材：（1）培養(yǎng)皿X 3、500ml燒杯X 1、棉花、醫(yī)用解剖器材（剪刀、鐐子、解剖刀）、10ml注射器、4號針頭、離心管若干、三角瓶若干、25ml卡式瓶若干、滴管、精密 pH試紙、0.22m微孔濾膜、血球細胞計數(shù)板、標簽紙、油性筆、凍

4、存管（2）超凈工作臺、CO2培養(yǎng)箱、 高速離心機、高壓滅菌鍋、顯微鏡、水浴鍋、-86C冰箱第一部分實驗前遇備1、Sr）玻西善JR的清洗用5篝的鉆要法曜浸泡過夜用足量的法衣粉反復刷洗.悔瓶壁上的殘潰澆干凈三汽精干善年的器口三量箔酸鉀溶液（重絡酸弊120備流硫酸20（麗匕堡濯水；更經1U浸泡過空專f*三三=強專1W勺三水寸三,殊甘斗亨孽水-九三二矗 士三2、無菌工作室及其內物品的消毒滅菌（1）超凈工作臺檢查超凈工作臺是否正常；用之前用沾了 75%酒精的脫脂棉擦拭，再開30min的紫外照射（2） 小件物品用牛皮紙（報紙）將小件物品（如鐐子、解剖刀等）包裹好放進飯盒里，放進滅菌鍋，其他物品也一并放入蒸

5、汽滅菌鍋內，95KPa、121c下滅菌30min （3）其他儀器滅菌 3、試劑配制（如上表）4、器材準備5、注意：1）使用高壓滅菌鍋時注意正確使用方法，以免引起危險2）超凈工作室和工作臺必須清理干凈，以免引起細胞污染浸泡?用5%的鹽酸溶液浸泡過夜刷洗?用足量的洗衣粉反復刷洗，將瓶壁上的殘漬洗干凈浸酸?將干燥后的器皿用重絡酸鉀溶液（重絡酸鉀120g:濃硫酸200ml:蒸儲水1L）浸泡過夜沖洗?將浸酸后的玻璃器皿用自來水沖洗，然后用蒸儲水，最后干燥、待用 第二部分原代培養(yǎng)器材：解剖刀、剪刀、鐐子、平皿、注射器、離心機、血球計數(shù)板、15ml離心管X 4、培養(yǎng)瓶X 2,冰塊試劑：乙醛、D-Hank s

6、溶液、生理鹽水 儀器：超凈工作臺、離心機、顯微鏡 步驟：1.取 樣1）超凈工作臺上的物品：滅菌后的解剖刀、剪刀、鐐子、注射器、平皿、冰塊2）將小鼠用乙醛麻醉后引頸處死（用培養(yǎng)皿盛），在盛有75%酒精的燒杯中浸泡5min。在超凈工作臺上分離雙側股骨（培養(yǎng)皿下置冰塊），在含生理鹽水的 50mm2玻璃平皿中去除股骨周圍肌肉組織（皿下置冰塊）。3）剪去髓端。用10mL注射器抽取食量 D-Hank s液沖洗骨髓腔，將骨髓沖入培養(yǎng)瓶。4）用4號針頭反復吹打骨髓細胞懸液，制成單細胞懸液，盛在離心管里。5）將懸液在1000r/min下離心5min后收集細胞2.原代培養(yǎng)1）取出部分細胞用顯微鏡計數(shù)【附：血球計數(shù)

7、板計數(shù)法】2）以1 x 108/ml細胞密度接種在25cm2卡式瓶中，加血清培養(yǎng)基3）在飽和濕度下5% CO2 37c恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3、注意：1）超凈工作臺上操作的基本規(guī)范；2）離心機的使用方法；第三部分傳代培養(yǎng)器材：卡式瓶若干、滴管、洗耳球、移液管試齊J: D-Hank s液、胰蛋白酶液、EDTA液材料：生長良好的原代培養(yǎng)細胞步驟：1、從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)五天后的培養(yǎng)瓶，用滴管吸掉舊培養(yǎng)液2、用D-Hank s液洗滌細胞1或2次，洗去血清和活力弱的細胞【在培養(yǎng)瓶中滴加BSS直接傾倒，重復即可】3、用胰蛋白酶-EDTA液（1:1）消化分散貼壁細胞【加入消化液，37 C,數(shù)分鐘（看情況而定，顯

8、微鏡下細胞將要分離呈現(xiàn)圓粒狀即可）】4、加適量含血清的培養(yǎng)液終止消化作用，離心去上清液，加D-Hank s液洗滌1-2次5、輕拍培養(yǎng)瓶使細胞自瓶壁脫落，加入培養(yǎng)基，吹打混勻。按比例稀釋后接種到新的培養(yǎng) 瓶中培養(yǎng)。第四部分純化器材及儀器：吸管、離心管、培養(yǎng)瓶、顯微鏡、離心機 試劑：培養(yǎng)基、月K蛋白酶液、EDTA液材料：生長良好的傳代培養(yǎng)細胞步驟：1）取出細胞培養(yǎng)瓶，用 0.25%胰蛋白酶一0.02%EDTA夜混合漂洗細胞，搖動，用顯微鏡觀察，等到差不多半數(shù)細胞脫落后，停止消化2）將消化液用吸管吸出到離心管中，離心去上清，沉淀的細胞轉入新培養(yǎng)瓶中，加培養(yǎng)液培養(yǎng)3）原瓶加液繼續(xù)培養(yǎng)注意：各步驟均在無

9、菌工作室內進行第五部分凍存和復蘇試劑：培養(yǎng)基、 20%DMS。臺盼藍器材：凍存管、血球計數(shù)板、離心管、試管、培養(yǎng)瓶、吸管 儀器：-86C冰箱、離心機、顯 微鏡、水浴鍋步驟：1.離心用試管收集對數(shù)生長期的純化培養(yǎng)細胞（如果不是，可更換培養(yǎng)瓶里的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h）,加血清培養(yǎng)基，重懸起細胞2.取0.1mL細胞計數(shù)，計算細胞濃度及凍前存活率.凍存液的配制：取離心管，加入血清培養(yǎng)基，逐滴加入DMSO至20%;用前配制，待置室溫下.取凍存液緩慢逐滴加入細胞懸液中，邊加變輕微搖動，至 DMSO濃度成10% 止，細胞濃度15X106j/mL,混勻，分裝到凍存管中，標記；留少量做污染檢測.凍存：先將凍存管置

10、于 4 C10min ,調節(jié)冰箱，-20C30min, -80C18h;有條件的可以將凍存管放到液氮槽中長期儲存6.復蘇：1）將取出的凍存管迅速投入 3740 c水浴中，振蕩；2）將細胞液吸出到培養(yǎng)瓶中，加培養(yǎng)液離心洗滌1-2次，除去凍存保護劑；3）將培養(yǎng)液細胞濃度調整到1 X 105-2 X 105個/mL ,常規(guī)培養(yǎng)注意事項：慢凍快蘇原理；凍存管若是安培瓶或無螺帽凍存管，小心凍存管爆裂，若是非螺旋蓋凍存管，應注意防止水進入而造成污染附1:細胞計數(shù)法實驗原理：當待測細胞懸液中細胞均勻分布時，通過測定一定體積懸液中的細胞的數(shù)目，即可換算出每毫升細胞懸液中細胞的細胞數(shù)目。具體操作：蓋好蓋玻片：取

11、一套血球計數(shù)板，將特制的蓋玻片蓋在血球計數(shù)槽上。制備計數(shù)用的細胞懸液：用吸管吸5滴細胞懸液到離心管中， 加入5滴臺盼藍，活細胞不會被染色，加入染液后就可以在顯微鏡下區(qū)別活細胞和死細胞。將細胞懸液滴入計數(shù)板：將待測細胞懸液吹均勻，然后吸取少量懸液沿蓋片邊緣緩緩滴入，要保證蓋片下充滿懸液， 注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中。統(tǒng)計4個大格的細胞數(shù)：將血球計數(shù)板放于顯微鏡的低倍鏡下觀察，并移動計數(shù)板，當看到鏡中出現(xiàn)計數(shù)方格后，數(shù)出四角的4個大銘（每個大格含有 16個中格）中沒有被染液染上色的細胞數(shù)目。計算原細胞懸液的細胞數(shù) ：按照下面公式計算細胞密度：（細胞懸液的細胞數(shù)）ZmL= （4個大格子細胞數(shù)Z4） X2X 104說明：公式中除以4因為計數(shù)了 4個大格的細胞數(shù)。 公式中乘 以2因為細胞懸液于染液是 1:1稀釋。公式中乘以104因為計數(shù)板中每一個大格的體積為： 1.0mm （長）x 1.0mm （寬）x 0.1mm （高）=0.1mm3 而 1mL= 1000mm3 細胞計數(shù)要點： 進行細胞計數(shù)時，要求懸液中細胞數(shù)目不低于1 X 107 L-1,如果細胞數(shù)目很少要進行離心再懸浮于少量培養(yǎng)液中。要求細胞懸液中的細胞分散良好，否則影響計數(shù)準確性。取樣計數(shù)前，應充分混勻細胞懸液，尤其時多次取樣計數(shù)時