化合物抗體的制備與應(yīng)用材料

1、第五章化合物抗體的制備與應(yīng)用一些分子量小于4000的有機(jī)物質(zhì)，如多肽、大多數(shù)的多糖、甾族 激素、脂肪胺、類脂質(zhì)、核苷、某些小分子量的藥物等能與對(duì)應(yīng)抗體 結(jié)合出現(xiàn)抗原-抗體反應(yīng)、又不能單獨(dú)激發(fā)人或動(dòng)物體產(chǎn)生抗體，它 只有反應(yīng)原性，不具免疫原性，稱為半抗原，又稱不完全抗原。該類 化合物其本身不具有免疫原性，但當(dāng)其與蛋白質(zhì)大分子或其他高分子 量物質(zhì)結(jié)合后形成完全抗原，可以刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體。半抗原 性免疫原的制備是其抗體制備的關(guān)鍵技術(shù)之一。在其產(chǎn)生的抗體中， 針對(duì)偶聯(lián)載體的抗體占多數(shù)，因此，在化合物抗體的制備中，構(gòu)建快 速，有效的篩選方案和技術(shù)成為其抗體制備的另一關(guān)鍵技術(shù)。目前，化合物抗體已經(jīng)成

2、功的應(yīng)用于藥物分析，農(nóng)藥殘留檢測(cè)， 重金屬檢測(cè)等多個(gè)方面，為醫(yī)學(xué)檢測(cè)，環(huán)境保護(hù)等發(fā)展奠定了堅(jiān)實(shí)的 基礎(chǔ)。5.1半抗原性免疫原的制備半抗原性免疫原的制備是其抗體制備的關(guān)鍵技術(shù)之一，其主要包 括偶聯(lián)載體的選擇，偶聯(lián)方式的選擇等方面的內(nèi)容。5.1.1載體的選擇常用于半抗原偶聯(lián)的載體包括蛋白質(zhì)，多肽類聚合物，大分子聚 合物和某些顆粒等。蛋白質(zhì)是空間結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜的生物大分子，是一種良好的載體。常用的有人血清白蛋白、牛血清白蛋白、血藍(lán)蛋白、牛甲狀腺球蛋白 等。以牛血清白蛋白最常用。蛋白質(zhì)與半抗原結(jié)合基于游離氨基、羧 基、酚基、巰基、吲哚基、咪唑基、胍基等活性基團(tuán)的縮合。多肽類聚合物是人工合成的多肽聚合物，

3、常用多聚賴氨酸，分子 量達(dá)十幾萬(wàn)至幾十萬(wàn)，與半抗原結(jié)合后可誘發(fā)動(dòng)物產(chǎn)生高親和力及高 滴度的抗血清。大分子聚合物和某些顆粒包括聚乙烯毗咯烷酮、活性炭、羧甲基 纖維素等。5.1.2半抗原與載體的結(jié)合半抗原與載體結(jié)合的方法包括化學(xué)法和物理法。物理法是具有物 理吸附能力的載體通過(guò)電荷和微孔吸附半抗原，物理吸附的載體有羧 甲基纖維素、聚乙烯毗咯烷酮等?；瘜W(xué)法是利用功能團(tuán)將半抗原交聯(lián) 固定在載體上，這些載體包括血清白蛋白、甲狀腺球蛋白、銅藍(lán)蛋白、 卵蛋白和人工合成的多聚賴氨酸。帶有游離氨基或游離羧基以及兩種 基團(tuán)都有的半抗原，可直接與載體連接。其他不帶有氨基或羧基的半 抗原，須加以適當(dāng)?shù)母脑?，使其轉(zhuǎn)變?yōu)閹?/p>

4、有游離氨基或游離羧基的衍 生物，才能與載體連接。半抗原與載體連接時(shí)，應(yīng)選擇合適的方法，結(jié)合方式的選擇應(yīng)考 慮如下因素：1）半抗原的溶解度和穩(wěn)定性：在結(jié)合反應(yīng)中應(yīng)不導(dǎo)致半抗原活性 的改變，同時(shí)也不能使載體變性至不溶解的程度。2）結(jié)合鍵的位置：抗體對(duì)遠(yuǎn)離蛋白質(zhì)聯(lián)接點(diǎn)的半抗原部分有最好 的特異性，故聯(lián)接時(shí)應(yīng)使聯(lián)接鍵遠(yuǎn)離半抗原的決定簇。3）選擇適合的偶聯(lián)試劑：不同的半抗原在偶聯(lián)時(shí)，應(yīng)根據(jù)半抗原 的化學(xué)結(jié)構(gòu)，以及反應(yīng)方式選擇適當(dāng)?shù)呐悸?lián)試劑。如小分子肽類有一 定的三級(jí)結(jié)構(gòu)，在溶液中依靠氨基酸殘基來(lái)維持其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。因此， 用雙功能的亞氨酸酯不但對(duì)氨基酸有選擇，而且能代替被取代的每一 個(gè)8-氨基的正電荷。蛋

5、白質(zhì)與偶聯(lián)劑接觸后，使不同蛋白質(zhì)分子的 功能基團(tuán)交聯(lián)并凝聚。廣泛交聯(lián)的蛋白質(zhì)，其溶解度常降低，而這種 溶解度差的蛋白質(zhì)卻是有效的免疫源。半抗原與載體的連接一般在實(shí)驗(yàn)室皆可完成，但反應(yīng)條件須嚴(yán)格 控制，以防半抗原失活或載體嚴(yán)重變性。因此，半抗原與載體連接方 法的選擇與設(shè)計(jì)是制備抗體中最具挑戰(zhàn)性的關(guān)鍵性步驟。常規(guī)的連接 方法包括以下幾類：1）有游離氨基或游離羧基以及兩種基團(tuán)都有的半抗原與載體的連 接方法（1）碳化二亞胺法：碳化二亞胺是一種化學(xué)性質(zhì)非?；钴S的雙功 能試劑，它們既可與半抗原上的羧基又可與半抗原上的氨基縮合。此 法非常簡(jiǎn)便，只要將半抗原與載體蛋白質(zhì)按一定分子比混合在適當(dāng)?shù)?溶液中，然后加

6、入碳二亞胺，攪拌l2h，置室溫反應(yīng)24h，最后透 析除去未反應(yīng)的半抗原，即可得到人工免疫原。（2）戊二醛法：戍二醛是帶有兩個(gè)活性基團(tuán)雙功能的連結(jié)劑，它 借助兩端的醛基與載體和半抗原的氨基以共價(jià)鍵連接，其反應(yīng)如下：（3）混和酸酐法：混合酸酐法又稱為氯甲基異丁酯法，主要用以 甾體激素與蛋白質(zhì)的偶連。以烷基氯甲基為偶連劑，最常用的是氯甲 基異丁酯。含有羧基的半抗原與氯甲基異丁酯反應(yīng)形成混合酸酐，然后在與蛋白質(zhì)載體上的氨基反應(yīng)形成肽鍵。其反應(yīng)如下：（4）過(guò)碘酸氧化法：過(guò)碘酸將糖環(huán)氧化成雙醛基，再與蛋白質(zhì)上 的氨基偶聯(lián)。本法常用于配糖體類藥物與蛋白質(zhì)的偶聯(lián)。2）不帶有氨基或羧基的半抗原可用下面方法改造后

7、，再用上述方 法進(jìn)行連接（1）琥珀酸酐法：本法用于帶有羥基的半抗原的改造。琥珀酸 酐加水轉(zhuǎn)變成琥珀酸。如將帶有羥基的半抗原和琥珀酸酐在無(wú)水毗啶 中反應(yīng)，即可得到帶有羧基的半抗原琥珀酸的衍生物。其反應(yīng)式如下：（2）羧甲基羥胺法：帶有酮基的半抗原（如孕酮、睪酮）與0-（羧 甲基）羥胺反應(yīng)，轉(zhuǎn)變?yōu)閹в恤然陌肟乖苌?。其反?yīng)式如下：（3）重氮化的對(duì)氨基苯甲酸法：本法適于帶有酚基的半抗原（如 某些藥物）的改造。先將對(duì)氨基苯甲酸和亞硝酸鈉反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物再 作用于帶有酚基的半抗原，從而制得帶有羧基的半抗原衍生物。（4）一氯醋酸鈉：本法適于帶有酚基半抗原的改造。將帶有酚基 的藥物與一氯醋酸鈉反應(yīng)即可得到帶有羧基的半抗原衍生物。5.2化合物抗體的應(yīng)用目前化合物抗體已經(jīng)應(yīng)用于農(nóng)藥殘留降解的檢測(cè)。研究者建立了 多項(xiàng)化學(xué)農(nóng)藥殘留免疫檢測(cè)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)同類農(nóng)藥的同時(shí)在線檢 測(cè)。以二乙基磷酸乙酸為半抗原與適當(dāng)?shù)妮d體連接合成人工免疫原， 免疫后獲得了針對(duì)雙乙氧基硫代磷酸酯類有機(jī)磷農(nóng)藥的