蛋白質(zhì)提取（水溶液提取法和有機溶劑提取法）

1、Word文檔 蛋白質(zhì)提?。ㄋ芤禾崛》ê陀袡C溶劑提取法） 蛋白質(zhì)的提取工作是將經(jīng)過處理或破裂的細胞，置于肯定的條件和溶液中，讓被提取物充分釋放出來的過程。影響提取的因素主要是被提取物質(zhì)在提取的溶液中溶解度的大小及由固相集中到液相的難易程度。某一物質(zhì)在溶劑中溶解度大小與該物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)及溶劑理化性質(zhì)有關(guān)，一般遵守“相像相溶”的原則。集中作用對蛋白質(zhì)的提取有肯定的影響。減小溶劑的黏度、攪拌和延長提取時間可以提高集中速度，增加提取效果，提取的原則是“少量多次”，即對于等量的提取溶液，分多次提取比一次提取效果好得多。大部分蛋白質(zhì)都可以溶于水、稀鹽、稀酸或稀堿溶液，少數(shù)與脂類結(jié)合的蛋白質(zhì)則溶于乙醇、丙酮

2、及丁醇等有機溶劑中，因此，可實行不同溶劑提取分別和純化蛋白質(zhì)。 一、水溶液提取法稀鹽和緩沖系統(tǒng)的水溶液對蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性好，溶解度大，是提取蛋白質(zhì)常用的溶劑，通常用量是原材料體積的15倍，提取時需要勻稱地攪拌，以利于蛋白質(zhì)的溶解。提取的溫度視其有效成分的性質(zhì)而定。一方面，多數(shù)蛋白質(zhì)的溶解度隨著溫度的上升而增大，因此溫度高利于溶解，縮短提取時間。但另一方面，溫度上升會使蛋白質(zhì)變性失活，因此基于這一點考慮，提取蛋白質(zhì)時一般采納低溫（5以下）操作。為了避開蛋白質(zhì)提取過程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制劑（如二異丙基氟磷酸、碘/乙酸等）。下面著重爭論提取液的 pH 和鹽濃度的選擇。1. pH 蛋白質(zhì)是具有

3、等電點的兩性電解質(zhì)，提取液的 pH 應選擇在偏離等電點兩側(cè)的 pH 范圍內(nèi)。用稀酸或稀堿提取時，應防止過酸或者過堿而引起蛋白質(zhì)可解離基團發(fā)生變化，從而導致蛋白質(zhì)構(gòu)象的不行逆化。一般來說，堿性蛋白質(zhì)用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白質(zhì)用偏堿性的提取液提取。2. 鹽濃度 稀鹽溶液可促進蛋白質(zhì)的溶解，稱為鹽溶作用。同時稀鹽溶液因鹽離子與蛋白質(zhì)部分結(jié)合，具有愛護蛋白質(zhì)不易變性的優(yōu)點，因此在提取液中加入少量 NaCl等中性鹽，一般以0.15mol/L濃度為宜。緩沖液常采納0.020.05mol/L磷酸鹽或碳酸鹽的等滲鹽溶液。二、有機溶劑提取法一些和脂類結(jié)合比較堅固或者分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)，不溶于水

4、、稀鹽溶液、稀酸或稀堿中，可用乙醇、丙酮或丁醇等有機溶劑，它們具有肯定的親水性，還有較強的親脂性，是抱負的提取脂蛋白的提取液，但必需要在低溫下操作。丁醇提取法對提取一些與脂類結(jié)合緊密的蛋白質(zhì)特殊優(yōu)越，一方面是由于丁醇親脂性強，特殊是溶解磷脂的力量強；另一方面，丁醇兼具親水性，在溶解度范圍內(nèi)不會引起蛋白質(zhì)的變性失活。另外，丁醇提取法的pH及溫度選擇范圍較廣，也適用于動植物及微生物材料。三、蛋白質(zhì)提取舉例胰糜蛋白酶的制備【試驗目的】把握從組織中制備胰糜蛋白酶的原理和方法?！驹囼炘怼恳让拥鞍酌甘且认佼a(chǎn)生的一種消化酶。最初以酶原的形式被合成與分泌，之后在胰蛋白酶的作用下被水解而激活。胰糜蛋白酶是一種

5、催化肽鍵的肽鏈內(nèi)切酶，主要切斷色氨酸、苯丙氨酸或酪氨酸的羧基側(cè)肽鍵。酶絕大多數(shù)都是蛋白質(zhì)，因此一般提純蛋白質(zhì)的方法也適用于酶的提純，所不同的是在提純酶的過程中要不斷地進行酶活力的檢測，本試驗主要涉及提取過程?！驹囼炈幤放c器材】（一）材料和試劑1. 主要材料：新奇豬胰臟1個。2. 主要試劑2.5mol/L H2SO4溶液，固體(NH4)2SO4，氯化鈣/粉，10三氯/乙酸溶液，1%酪蛋白溶液，）0.1mol/L pH7.4 磷酸鹽緩沖液，1BaCl2溶液，5mol/L NaOH溶液。（二）主要器材組織搗碎機、手術(shù)器械、紗布、漏斗、透析袋、離心機、燒杯、pH計、離心管?！驹囼灧椒ㄅc步驟】1. 提取

6、 取新奇豬胰臟，放在盛有冰冷2.5mol/L H2SO4溶液的容器中，保存在冰箱中待用。去除胰臟表面的脂肪和結(jié)締組織后，稱重。用組織搗碎機粉碎。然后混懸于兩倍體積的冰冷2.5mol/L H2SO4溶液中，置于冰箱中過夜。將上述混懸液以3000rpm離心10min，上層液經(jīng)兩層紗布過濾至燒杯中；將沉淀再混懸于等體積的冰冷 2.5mol/L H2SO4溶液中，再離心，將兩次上層液合并，即為提取液。此時可留樣測酶的活力。2. 分別。3. 結(jié)晶 取分別所得的胰糜蛋白酶溶于3倍體積的水中（此時可取0.5ml留樣測酶活力），加(NH4)2SO4（1.44g/10ml），用5mol/L NaOH溶液調(diào)pH至6.0，在室溫放置12h即可消失結(jié)晶，在顯微鏡下觀看結(jié)晶外形。【留意事項】1. 整個操作過程在05條件下進行。2. 試驗材料應采納