超好研究生分子生物學-章 基因和基因功能分析基本策略

1、南昌大學醫(yī)學院萬福生第九章 基因和基因功能分析的基本策略1 由于基因克隆技術可以擴增特定基因片段，使基因分析可以在體外或用各種動物模型得以實現(xiàn)。當前被稱為醫(yī)學研究的“活試管”的轉(zhuǎn)基因動物和基因敲除動物兩種模型的建立，其前期工作都是要構建基因載體?？梢?，基因克隆在基因研究中的重要性。 分析基因可在DNA，RNA和蛋白質(zhì)三個層面上進行，研究者應根據(jù)研究目的篩選適當?shù)膶嶒灧椒ê椭贫ㄑ芯考夹g路線。 基因分析是一種策略性非常強的工作，能用于基因分析的實驗技術和方法很多，選擇適當?shù)膶嶒灧椒ê颓腥朦c是基因分析首先要考慮的，即要有一個周密的基因分析的策略。 2一、基因分析的基本策略(一)利用DNA定性定量分析

2、研究基因1. DNA序列測定基因的一級結構變化 人類基因組包含著決定一個人生,老,病,死及精神,行為等活動的全部遺傳信息.基因或基因組變異是人類多種疾病的根本病因,揭示基因或基因組的結構變化是推動醫(yī)學向縱深發(fā)展的關鍵.也是揭示生命起源與進化,細胞生長與分化,疾病發(fā)生與發(fā)展的分子機制. DNA序列測定常用于鑒定基因或基因組的變異.3核酸序列分析的基本原理化學裂解法 (Maxam-Gillbert法)DNA鏈的末端合成終止法 (sanger法)4A、化學裂解法(Maxam-Gillbert法)基本原理基于某些化學試劑可以使DNA鏈在1個或2個堿基處發(fā)生專一性斷裂的特性，精確地控制反應強度，使一個斷

3、裂點僅存在于少數(shù)分子中，不同分子在不同位點斷裂，從而獲得一系列大小不同的DNA片段，將這些片段經(jīng)電泳分離。分析前，用同位素標記DNA的5末端，經(jīng)放射自顯影即可在X膠片上讀出DNA鏈的序列。5B、DNA鏈末端合成終止法6目 錄7C、DNA自動測序采用熒光替代放射性核素標記是實現(xiàn)DNA序列分析自動化的基礎。用不同熒光分子標記四種雙脫氧核苷酸，然后進行Sanger測序反應，反應產(chǎn)物經(jīng)電泳（平板電泳或毛細管電泳）分離后，通過四種激光激發(fā)不同大小DNA片段上的熒光分子使之發(fā)射出四種不同波長熒光，檢測器采集熒光信號，并依此確定DNA堿基的排列順序。 8DNA自動測序結果舉例目 錄9 2. 基因拷貝數(shù)變化的

4、分析方法用Souther blot分析基因拷貝數(shù) 此法通常只能分析已知基因的拷貝數(shù).其成功與否的關鍵在于適當?shù)腄NA酶切消化和基因探針的標記.采用PCR技術分析基因拷貝數(shù) 一般說來,傳統(tǒng)PCR不合用于分析基因拷貝數(shù)變化,但差異PCR和實時PCR(real-time PCR)可以用于基因拷貝數(shù)的分析。有時也可通過對PCR產(chǎn)物含量的多少估計基因拷貝數(shù)在不同個體之間的差異，一般常用actin等管家基因作內(nèi)參照。10 Southern blot 的基本過程 11 Northern blot 的基本過程 12 Western blot 的基本原理 13三種印跡技術的比較14實時PCR技術原理目 錄15

5、用原位雜交技術確定基因在染色體上的分布 首次將原位雜交(in situ hybridization, ISH)技術用于基因定位是1977年,用此法確定了人和珠蛋白基因分別在11和16號染色體上的位置.熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)是用特殊熒光標記DNA探針,可在細胞、染色體及組織切片上檢測細胞內(nèi)是否存在特定的DNA或RNA序列，其分辯率小于100kb。16 (二)RNA定性定量分析觀察基因表達活性1. Nothern blot分析基因轉(zhuǎn)錄水平 Nothern blot 是定性分析mRNA水平的常用方法，也可相對定量分析特定RNA

6、。其基本程序與Souther blot相似。 RNA樣品制備和電泳分離成為關鍵步驟，操作人員的實驗技巧是實驗成功與否的重要因素之一?，F(xiàn)都傾向用RT-PCR方法。17 2. RT-PCR分析基因轉(zhuǎn)錄水平 通過RNA的分析,一是可以確定基因表達的組織分布;二是可以確定基因的表達時相。前者是用Nothern blot技術，對不同組織來源RNA進行定性雜交檢測，以確定特定基因的組織分布。后者是分析同來源的組織細胞在不同培養(yǎng)時間中RNA的表達特點。18 3.RNA酶保護實驗 基因轉(zhuǎn)錄后的RNA剪接可以直接影響基因活性,使一個基因產(chǎn)生多條多肽鏈或蛋白質(zhì)產(chǎn)物。RNA酶保護實驗(RNase protectio

7、n assay, PRA)是一種液相RNA雜交技術，主要是用RNase A 和RNase T1專一性降解單鏈RNA，分析受保護的雜交雙鏈RNA，從而確定RNA是否剪接、剪接種類、剪接位點及內(nèi)含子的可能位置等。 PRA的基本程序主要包括待測RNA的分離、 RNA探針的制備、待測RNA與RNA探針的液相雜交和RNA酶消化等。19 4 DNA芯片(DNA chips)技術 DNA芯片是生物芯片(bio chip)中的一種,又稱基因芯片、DNA陣列(DNA array) 、c DNA芯片等。生物芯片是指通過微電子、微加工技術在芯片表面形成的微型生物化學分析系統(tǒng)，以實現(xiàn)對細胞DNA、蛋白質(zhì)及其它物質(zhì)高效

8、、敏感而又快速的處理。 bio chip又分為DNA芯片、蛋白質(zhì)芯片及其它芯片三類。 20 DNA芯片技術分析基因轉(zhuǎn)錄活性的原理與核酸分子雜交方法是一樣的，都是用已知核酸序列與靶核酸序列雜交，定性定量分析基因表達情況，但不同的是DNA芯片表面集成了大量的核酸分子探針，能在同一時間內(nèi)平行分析大量的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。 DNA芯片技術還可用于基因組研究、基因診斷、法醫(yī)鑒定及藥物研究等。21目 錄22(三)蛋白質(zhì)定性定量分析揭示基因表達活性1.Western blot 分析特定蛋白質(zhì) Western blot 是用于分析克隆基因表達產(chǎn)物分析最特異的方法，也是首選方法。其基本步驟包括：樣品蛋白質(zhì)的制備、SD

9、S分離、蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)膜、特定抗體與膜上相應蛋白雜交及檢測分析標記信號。如目的基因表達活性較低，一般需采用免疫沉淀技術對目的蛋白進行濃縮，然后進行Western blot 。23 Western blot 的基本原理 24 2.熒光激活細胞分揀分析特定蛋白質(zhì) 熒光激活細胞分揀(fluorescence-activated cell sorting, FACS)技術，又叫流式細胞術(flow cytometry) ，是近年發(fā)展起來的一種快速定量分析細胞的新技術，用于細胞表面分子表達的定量分析，即可用于活細胞表面特定基因表達產(chǎn)物的定量分析。因此，該技術可用于基因表達活性的分析。如綠色熒光蛋白(gree

10、n fluorescence protein,GFP)基因，使轉(zhuǎn)染成功的細胞在表達外源基因的同時表達GFP，利用GFP的綠色熒光，可用流式細胞儀進行檢測。3.免疫組化對細胞內(nèi)蛋白的定位和半定量分析25二、基因功能分析的基本策略 隨著人類基因組計劃(HGP)的完成，人們對未知基因功能的預測和研究成為21世紀的熱點之一，其主要任務就是在基因組上找出每項個基因和基因產(chǎn)物及其的功能。制定合適的分析策略是進行基因功能分析的重要步驟?；蚬δ芊治隹梢栽贒NA、RNA和蛋白質(zhì)水平上采用不同的技術和模型來進行，轉(zhuǎn)基因小鼠和基因敲除小鼠是當前研究基因功能最常用的動物模型。下面簡要介紹幾種用于基因功能分析的常用技

11、術方法。(一) 采用轉(zhuǎn)基因模型研究基因功能(二)采用基因敲除動物模型研究基因功能(三)采用轉(zhuǎn)錄后基因沉默或抑制研究基因功能26(一) 采用轉(zhuǎn)基因模型研究基因功能 研究基因功能的轉(zhuǎn)基因模型目前主要有動物模型和細胞模型兩種。轉(zhuǎn)基因小鼠模型是應用最多的轉(zhuǎn)基因動物模型。1.利用轉(zhuǎn)基因動物研究基因在體內(nèi)的功能 轉(zhuǎn)基因動物(transgenic animal)是指用人工方法(轉(zhuǎn)基因技術)將外源基因?qū)牖蛘系交蚪M上，培育出帶有外源基因并能穩(wěn)定表達的動物。其中將外源基因?qū)牖蛘系交蚪M上的過程稱轉(zhuǎn)基因(transgene)。上述這種能夠產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物的方法稱轉(zhuǎn)基因技術(transgenic techno

12、logy)。27 第一次獲得了轉(zhuǎn)基因小鼠是1982 年。 由美國科學家Brinster和Palmiter將大鼠生長激素基因(GH)與小鼠的金屬硫蛋白基因(MT)連在一起，構成MTrGH融合基因，然后用顯微注射法注射到小鼠受精卵中，再移植到假受孕的子宮中，待其發(fā)育生長。這次共產(chǎn)了21只小鼠，其中7只帶有GH基因，而6只的體形較原小鼠大一倍左右，即稱超級小鼠或巨型鼠。轉(zhuǎn)基因小鼠模型是醫(yī)學領域中應用最廣泛的動物模型。 導入外源基因的方法主要有顯微注射法、胚胎干細胞法及逆轉(zhuǎn)錄病毒法等。28目 錄29 30 顯微注射法的特點： 經(jīng)此法注射的受精卵的成活率約有60%，由此發(fā)育所得的小鼠中大約有10-40%

13、帶有外源基因，其中80%的基因整合發(fā)生在單細胞期，成為轉(zhuǎn)基因動物。另外20%在細胞分裂后發(fā)生整合，這部分動物并不是所有細胞中都帶有外源基因，這類動物稱嵌合動物(chimeric animal). 外源基因整合的拷貝數(shù)從1-幾百不等，一般是在染色體單個位點整合，偶爾有在不同染色體不同位點整合。外源基因可幾個片段首尾相連插入整合位點。 此技術的優(yōu)點：導入基因的速度快、操作簡單、對DNA大小無限制（可達200kb以上）。31 胚胎干細胞法導入基因的基本過程 32 核轉(zhuǎn)移技術的基本原理 33 轉(zhuǎn)基因動物的應用 我國的轉(zhuǎn)基因研究雖起步較晚，但進展較快，已經(jīng)成功制備了轉(zhuǎn)基因大鼠、小鼠、牛、羊、兔子、豬及魚

14、等。轉(zhuǎn)基因研究的應用主要有以下方面： 研究組織細胞基因的特異表達； 研究外源基因的新表型，發(fā)現(xiàn)基因新功能； 研究外源基因插入后的突變表型，發(fā)現(xiàn)新基因； 建立研究外源基因表達、調(diào)控的動物模型； 培育動物新品種； 制備基因產(chǎn)品； 建立人工的疾病動物模型。342.利用細胞模型研究特定基因的功能在細胞水平上進行轉(zhuǎn)基因，以建立基因轉(zhuǎn)染細胞模型，可在DNA、RNA及蛋白質(zhì)水平上研究特定轉(zhuǎn)染基因的功能。轉(zhuǎn)染細胞是研究基因功能的常用細胞模型。利用轉(zhuǎn)染細胞研究基因功能時，可在細胞水平上進行，也可在動物體內(nèi)進行，如將轉(zhuǎn)染某一抑癌基因的腫瘤細胞接種到小鼠體內(nèi)。目前許多基因工程的重組蛋白的功能研究都采用轉(zhuǎn)染細胞模型。

15、35(二)采用基因敲除動物模型研究基因功能 研究基因功能最直接的方法就是在被研究的動物基因組中剔除這個基因?；蚯贸?gene knockout)是指通過DNA同源重組定向地將外源基因插入宿主細胞染色體中，使某特定基因在細胞或活體內(nèi)失活的過程。它是目前在體內(nèi)研究基因功能的最好方法?；蚯贸齽游?gene knockout animal)是指通過同源重組定向地在活體內(nèi)剔除特定基因的動物。基因敲除小鼠是指在兩條染色體上的等位基因都失去功能的小鼠。36(三)采用轉(zhuǎn)錄后基因沉默或抑制研究基因功能1. 利用RNA干擾技術研究基因功能 RNA干擾(RNA interference,RNAi)是指由短雙鏈RNA誘導的同源mRNA的降解過程。 RNA干擾過程主要分兩個階段：一是siRNA的生成，二是siRNA與細胞內(nèi)某些酶或蛋白質(zhì)形成RNA誘導的沉