根際土壤溶液中磷的毛細管電泳分析

1、根際土壤溶液中磷的毛細管電泳分析摘要】應(yīng)用毛細管區(qū)帶電泳間接紫外吸收法，對測定根際土壤溶液中p的檢測波長、電泳溫度、別離電壓和電解液組成等參數(shù)進展了選擇，開展了根際土壤溶液中p濃度的毛細管電泳分析法。選擇后的電泳條件為：電解液為32l/l三羥甲基氨基甲烷+4l/l1,2,4-苯三酸+0.3l/l十六烷基三甲基溴化銨ph=8.5；檢測波長為205n，別離電壓為20kv，溫度為25。本方法有效地屏蔽了土壤溶液中l(wèi)，s2和n3等離子對p3測定的影響，對根際土壤溶液中p的檢出限為0.68g/ls/n=3；回收率為87.2%99.4%，適于測定微量根際土壤溶液樣品中p3的濃度?！娟P(guān)鍵詞】p；根際土壤溶液

2、；毛細管電泳analysisfphsphateinrhizspheresilslutinsaplesusingapillaryeletrphresisangzhen-yu，ensheng-fang，liai-feng*(keylabratryfarineenvirnentalandelgy，inistryfeduatin，eanuniversityfhina，qingda266100)abstratanalytialethdfapillaryzneeletrphresisithindiretuvdetetinasptiizedandvalidatedtdeterinethephsphatein

3、rhizspheresilslutinsaples.theeffetfdetetinavelength，eletrlytepsitin，separatinvltageandteperatureereinvestigated.analysesereperfredina56unatedfused-siliaapillary(lengthtthedetetrind)ithreversedeletrstifl，andidetetinin205n，separatinvltage20kv，andteperature25.theeletrlytentained32l/ltris-hydrxyethyl-ai

4、nethane，4l/l1,2,4-benzene-triarbxylitriellitiaidand0.3l/ltetradeyl-triethylaniubride，ph8.5.underthenditins，thenegativeeffetftheinrganianin，suhasl，s4andn3，anbereduednphsphate.thedetetinliitas0.68g/l(s/n=3)，andthereveryas87.2%99.4%.theethdhasbeenappliedtthedeterinatinfthenentratinfphsphateintherhizshe

5、resilslutin.keyrdsphsphate；ilslutin；apillaryeletrphresis1引言利用根箱抽提系統(tǒng)搜集的原位根際土壤溶液中磷元素的動態(tài)變化研究可直接反映植物根系吸收磷的根際過程，對于理解磷的生物可利用性具有重要意義1。土壤根際中磷的研究過程，由于樣品量很少，且磷的濃度很低，限制了對根際土壤溶液中磷的測定，成為根際土壤溶液中磷研究的瓶頸2,3。毛細管電泳技術(shù)的微量進樣和較高的別離效率優(yōu)勢使其在根際研究中占有重要地位。同時，紫外間接檢測方法是檢測無機離子的最普遍和有效的方法，被廣泛應(yīng)用4,5。但由于土壤溶液中p3濃度遠低于其它無機離子，且高濃度的l，s2，n3等

6、離子峰形的擴展，影響p3的出峰時間，增加了定性分析的難度6,7。本研究基于文獻7測定土壤溶液p3的方法，對p3的檢測波長、電解液的組成、電泳溫度及電壓等條件進展了選擇，以減少離子干擾，滿足原位根際土壤溶液樣品中p3測定的需要。2實驗局部2.1儀器與試劑毛細管電泳儀agilent3de，g1601a，gerany，包括安捷倫工作站a.10.02，二極管陣列檢測器dad；熔融石英毛細管內(nèi)徑50，總長度64.5，有效長度56，河北永年銳灃色譜器件。三羥甲基氨基甲烷tris，99.0%、1,2,4-苯三酸t(yī)a，99.9%和十六烷基三甲基溴化銨ttab，99.0%，美國siga公司；nah2p499.0

7、%，美國fluka公司。實驗用水為illiq水美國illipre公司。2.2實驗方法根據(jù)文獻7中測定土壤溶液陰離子的方法毛細管電泳儀：bekanp/ae5510，a，usa，以p3為目的離子，對檢測波長、電泳溫度、別離電壓及電解液組成濃度等電泳條件進展選擇。電解液經(jīng)用0.45混合纖維膜過濾，實驗前用超聲波脫氣15in。毛細管使用前，先用1l/lnah沖洗30in，電解液沖洗10in。在不進樣的情況下電泳5次至毛細管壁平衡。每次測定樣品后，用電解液沖洗5in，使管壁回復(fù)到一樣的待測狀態(tài)。采用壓力進樣法，進樣時間4s，負極進樣，正極檢測，整個電泳分析過程由儀器自動完成。2.3土壤根際溶液樣品的制備

8、用文獻2建立的根箱抽提系統(tǒng)，分別將微型抽提管rhizsphereresearhprduts，ageningen，netherlands，外徑為1，前端為多孔陶瓷p80材料，孔隙度48%，最大孔徑為1插入到植物根尖以上3左右的根系周圍土壤中。微型抽提管的后端那么通過內(nèi)徑0.75的聚醚醚酮管與真空搜集器相連，在負壓下將土壤溶液搜集于聚丙烯瓶200l中。根箱中分別種植喜旱蓮子草和香蒲2種植物，每種植物的根際間隔 根表1插10個微型抽提管，非根際間隔 根表5插5個微型抽提管，在302kpa的壓力下連續(xù)搜集48h，每個抽提點搜集到的土壤溶液約為100l。3結(jié)果和討論3.1檢測波長、溫度和電壓的選擇根據(jù)毛

9、細管電泳儀工作站的等吸收繪圖確定p的最正確檢測波長。檢測波長為205n時，磷的信號峰的信噪比最大。因此，選擇205n作為檢測波長。溫度和電壓條件可影響磷的出峰時間、峰面積和峰高。實驗中保持毛細管電泳電解液2l/lta+8l/ltris+0.3l/lttab，ph=7.8和電泳電壓30kv不變，改變電泳溫度10，15，20，25和30，測定5g/lp3標(biāo)準(zhǔn)溶液。隨溫度升高，p出峰時間變短，峰形越來越鋒利，25時峰面積到達最大見表1。然后再保持毛細管電泳電解液2l/lta+8l/ltris+0.3l/lttab，ph=7.8和電泳溫度25不變，改變電泳電壓15，20，25和30kv，測定5g/lp

10、3標(biāo)準(zhǔn)溶液。隨電壓升高，p3出峰時間變短，但同時峰面積變小，峰高根本不變見表2。綜合考慮峰面積和出峰時間，電泳溫度選擇25，電壓選擇20kv。表1電泳溫度對p的遷移時間、峰面積及峰高的影響略table1igratintie，peakareaandpeakheightfphsphateatdifferentteperature表2電泳電壓對p的出峰時間、峰面積及峰高的影響略table2igratintie，peakareaandpeakheightfphsphateindifferentvltage3.電解質(zhì)溶液的影響由于陰離子遷移方向與電滲流ef方向相反，陰離子出峰時間很長或無法檢測，因此在別

11、離緩沖體系中參加電滲流反向改性劑改變毛細管內(nèi)壁電荷，從而使電滲流方向反轉(zhuǎn)。ttab是一種常用的電滲流反向劑，一般選擇濃度0.3l/l時，別離時間比擬適宜8,9。tris是一種弱堿，其緩沖ph值范圍7.59.025。當(dāng)電壓為20kv，溫度為25，ttab為0.3l/l，ta為2l/l，tris濃度為8，16和24l/l時，電解液ph值在7.88.7之間變化表3。h3p4的pk2為7.2，隨著ph升高，h2p4向hp2轉(zhuǎn)化；ph值越大，hp2比例越大；當(dāng)ph7.2時，以hp2為主10。隨著ph值的升高，譜圖中p的峰形對稱性越好，但基線越不穩(wěn)定。ph=8.5時的峰形和基線都較理想。表3不同濃度tri

12、s緩沖溶液對p3峰形的影響略table3effetfdifferentnentratinftrisbufferslutinnphsphruspeaktris：tris-hydrxyethylainethane.表4不同濃度ta對基線噪聲和p遷移時間的影響略table4effetfdifferentnentratinf1,2,4-benzenetriarbxylitriellitiaid(ta)nbaselineandtheigratintiefphsphate保持ttab濃度為0.3l/l，背景電解質(zhì)分別選擇2，4和8l/lta，ph為8.5tris濃度分別為16，32和64l/l。從表4可見

13、，ta濃度越大，p3的遷移時間延后程度越校這主要是因為檢測方式采用的是間接紫外吸收方法，無紫外吸收特性的無機陰離子與背景電解液中的強紫外吸收物質(zhì)ta進展置換，改變了電解液的紫外吸收強度，形成倒立的信號峰11。當(dāng)ta濃度增大時，其對l和s2的容量越大，譜帶展寬越小，這些非目的離子對p3出峰時間的影響就越校然而，ta濃度增大的同時，背景電解液的噪聲也逐漸增大，進步了p3的檢出限。因此ta濃度選擇4l/l。3.線性關(guān)系、重現(xiàn)性及回收率在選定的條件下，用6.4g/lp3標(biāo)準(zhǔn)液重復(fù)進樣5次，遷移時間的平均值為5.77in；其rsd為0.03%0.5%；峰面積的平均值為9.68aus，其rsd為0.2%0

14、.7%；p3濃度與其峰面積在0.425.6g/l范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，其線性回歸方程為：aaus=1.478+0.0514r=0.9999，檢出限為0.5g/l。用香蒲根際土壤溶液與12.8g/lp3標(biāo)準(zhǔn)液按照體積比為11混合制備加標(biāo)樣品，重復(fù)進樣5次，遷移時間rsd為0.7%2.5%；峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏向為0.8%1.6%；加標(biāo)樣品的回收率為87.2%99.4%；樣品檢出限為0.68g/ls/n=3，可以滿足樣品的測定需求。圖1p標(biāo)準(zhǔn)溶液(a)和香蒲根際土壤試樣(b)的電泳譜圖略fig.1eletrphregraphfstandardphsphateandrhizspheresilsaplefat

15、tail電泳條件(letrdenditins)：毛細管(apillary):56；電解液(bufferslutin)：0.3l/ltetradeyltriethylaniubride(ttab)l/ltris-4l/lta，ph8.5；壓力進樣：50kpa4s；電泳電壓(seperatinvltage):20kv，電泳溫度(eperature):25，檢測波長(detetinavelength):205n。3.土壤溶液的測定采用本方法測定土壤根際溶液中的磷元素含量，每個樣品測定3次，每3個樣品間插測3次p3標(biāo)準(zhǔn)溶液進展校正。p3標(biāo)準(zhǔn)溶液和香蒲土壤溶液樣品的電泳譜圖見圖1。喜旱蓮子草根際的土壤溶液p3質(zhì)量濃度2.51.0g/l顯著低于香蒲根際5.41.8g/lp0.05，且均顯著低于非根際土壤溶液11.82.4g/lp0.05?！緟⒖嘉墨I】3