細(xì)菌內(nèi)毒素檢查10.內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品效價(jià)標(biāo)定

1、內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品效價(jià)標(biāo)定湛江安度斯生物有限公司2017年5月內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品效價(jià)標(biāo)定背景方法舉例（一）背景近期，經(jīng)常接到用戶有關(guān)如何進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品效價(jià)標(biāo)定的咨詢。BET法中并沒有要求對CSE效價(jià)進(jìn)行復(fù)核，因此，我整理相關(guān)的法規(guī)、指南的要求供大家參考：YYT 0618-2007 細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)方法 常規(guī)監(jiān)控與跳批檢驗(yàn)3藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（2010年修訂）第二百二十七條 標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌返墓芾?52010版實(shí)驗(yàn)室控制系統(tǒng)GMP實(shí)施指南內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品效價(jià)標(biāo)定方法標(biāo)定方法凝膠法光度測定法（動態(tài)濁度法/動態(tài)顯色法/終點(diǎn)顯色法）標(biāo)定參考資料中國藥典2015年版通則1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法論文：

2、第 7 批細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品的建立 作者：蔡 彤 , 張國來 , 高 華 (中國藥品生物制品檢定所 , 北京100050) 61.實(shí)驗(yàn)材料試劑內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品（細(xì)菌內(nèi)毒素檢測用）凝膠法鱟試劑（最好兩批不同靈敏度試劑）細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)驗(yàn)器具同凝膠法試驗(yàn)。7（二）標(biāo)定方法-凝膠法2.實(shí)驗(yàn)步驟（1）標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液的制備 根據(jù)鱟試劑標(biāo)示靈敏度，將國家標(biāo)準(zhǔn)品稀釋制備成2.0、0.5和0.25濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液；（2）待測工作標(biāo)準(zhǔn)品內(nèi)毒素溶液的制備 按照標(biāo)示效價(jià)（Pe），用Vml BET水溶解，然后稀釋制備成2.0、0.5和0.25濃度的內(nèi)毒素溶液；（3） 用同一批號鱟試劑同時(shí)測定

3、兩系列內(nèi)毒素，每一濃度平行4管，陰性對照平行2管；8（二）標(biāo)定方法-凝膠法3.計(jì)算方法（1）只有當(dāng)國家標(biāo)準(zhǔn)品的2.0平行管均為陽性， 0.25平行管均為陰性，且陰性對照為陰性時(shí)，實(shí)驗(yàn)方為有效。（2）計(jì)算工作標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋倍數(shù) D1=Pe/V/2.0，D2=Pe/V/，D3=Pe/V/0.5，D4=Pe/V/0.25（3）工作標(biāo)準(zhǔn)品效價(jià)Pt的計(jì)算 Pt=antilog（X/n）antilog（D/4） V（EU/支）其中X為國家標(biāo)準(zhǔn)品系列反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對數(shù)值，D為工作標(biāo)準(zhǔn)品系列反應(yīng)終點(diǎn)稀釋倍數(shù)的對數(shù)值。9（二）標(biāo)定方法-凝膠法10（二）標(biāo)定方法-凝膠法4.舉例（1）設(shè)工作標(biāo)準(zhǔn)品的效價(jià)為10EU/支

4、，使用標(biāo)示靈敏度為0.25EU/ml的鱟試劑進(jìn)行標(biāo)定。加入1ml細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解標(biāo)準(zhǔn)品。（2）工作標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋倍數(shù)為： D1=Pe/V/2.0=101 0.5=20， D2=Pe/V/=10 1 0.25=40， D3=Pe/V/0.5=101 0.125=80， D4=Pe/V/0.25 =101 0.0625=160（二）標(biāo)定方法-凝膠法11（3）反應(yīng)結(jié)果為：國家標(biāo)準(zhǔn)品濃度（EU/ml）平行管數(shù)0.50.250.1250.0625NC反應(yīng)終點(diǎn)濃度1+0.252+0.253+0.254+0.25工作標(biāo)準(zhǔn)品稀釋倍數(shù)平行管數(shù)204080160反應(yīng)終點(diǎn)稀釋倍數(shù)1+402+403+404+40

5、12（二）標(biāo)定方法-凝膠法（二）標(biāo)定方法-凝膠法13（4）計(jì)算Pt：antilog（X/4）=antilog（lg0.25+lg0.25+lg0.25+lg0.25）/4=0.25 EU/ml antilog（D/4）=antilog（lg40+lg40+lg40+lg40）/4=40倍 Pt=0.2540 1=10 EU/支1.實(shí)驗(yàn)材料試劑內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品（細(xì)菌內(nèi)毒素檢測用）光度法鱟試劑細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品內(nèi)毒素定量測定儀（動態(tài)試管儀/酶標(biāo)儀）實(shí)驗(yàn)用具同光度法試驗(yàn)。14（二）標(biāo)定方法-光度測定法2.實(shí)驗(yàn)步驟（1）標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液的制備 將國家標(biāo)準(zhǔn)品稀釋制備成1.0、0.5、0.2

6、5、0.125和0.0625EU/ml濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液；（2）待測工作標(biāo)準(zhǔn)品內(nèi)毒素溶液的制備 按照標(biāo)示效價(jià)（Pe），用Vml BET水溶解，然后稀釋制備成1.0、0.5、0.25、0.125和0.0625EU/ml濃度的系列內(nèi)毒素溶液；（3） 用同一批號鱟試劑同時(shí)測定兩系列內(nèi)毒素，每一濃度平行2管，陰性對照平行2管；15（二）標(biāo)定方法-光度測定法3.計(jì)算方法（1）反應(yīng)結(jié)束后，利用內(nèi)毒素定量測定儀所配的程序軟件計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線和工作標(biāo)準(zhǔn)品的內(nèi)毒素濃度；（2）實(shí)驗(yàn)有效性判斷：陰性對照的反應(yīng)時(shí)間大于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點(diǎn)的反應(yīng)時(shí)間相關(guān)系數(shù)的絕對值大于等于0.980標(biāo)準(zhǔn)曲線上各點(diǎn)的變異系數(shù)CV小于10%1

7、6（二）標(biāo)定方法-光度測定法試驗(yàn)有效（3）確定實(shí)驗(yàn)為有效后，計(jì)算工作標(biāo)準(zhǔn)品的效價(jià)。首先去除無效的點(diǎn) 落在標(biāo)準(zhǔn)曲線以外的點(diǎn)（即其反應(yīng)時(shí)間大于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度點(diǎn)的時(shí)間，或反應(yīng)時(shí)間小于標(biāo)準(zhǔn)曲線最高濃度點(diǎn)的時(shí)間）CV大于10%的點(diǎn)將剩余的各點(diǎn)濃度乘以各自的稀釋倍數(shù)，即得到工作標(biāo)準(zhǔn)品的原濃度。再將各原濃度進(jìn)行算術(shù)平均再乘以加入水的體積，即為工作標(biāo)準(zhǔn)品效價(jià)。17（二）標(biāo)定方法-光度測定法18（二）標(biāo)定方法-凝膠法4.舉例（1）設(shè)工作標(biāo)準(zhǔn)品的效價(jià)為10EU/支，使用標(biāo)示檢測靈敏度范圍為100.03EU/ml的動態(tài)濁度法鱟試劑進(jìn)行標(biāo)定。加入1ml細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解標(biāo)準(zhǔn)品。（2）選擇標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度1、0.5、

8、0.25、0.125和0.0625EU/ml，計(jì)算對應(yīng)工作標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋倍數(shù)為：10、20、40、80和160倍；（3）檢測19（4）反應(yīng)結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍10.0625EU/ml,反應(yīng)平均時(shí)間998.52586.5秒。相關(guān)系數(shù)絕對值|r|=0.99490.980TNC（7200s）T試驗(yàn)有效試驗(yàn)有效CV10%，無效！標(biāo)準(zhǔn)曲線外，無效?。?）結(jié)果判斷和計(jì)算Pt內(nèi)毒素濃度（EU/ml）0.06250.1250.250.51.0反應(yīng)時(shí)間（秒）2586.52236.51599.51293.5998.5標(biāo)準(zhǔn)曲線信息2021結(jié)果判斷和計(jì)算Pt:稀釋倍數(shù)16080402010反應(yīng)時(shí)間（S）2584.520081591.51233987CV（%）16.721.410.760.234.44原液濃度（EU/ml）11.10411.32810.93211.24810結(jié)果判斷無效有效有效有效無效計(jì)算Pt（EU/支）（11.328+10.932+11.248）31=11.1691.使用細(xì)菌