分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)：第一章 核酸與分子標(biāo)志物

1、第一章 核酸與分子標(biāo)志物 分子標(biāo)志物（molecular biomarkers）是指可以反映機(jī)體生理、病理狀態(tài)的核酸、蛋白質(zhì)（多肽）、代謝產(chǎn)物（metabolites）等生物分子，是生物標(biāo)志物的一種類型。 /awards/1991clinical.htm核 酸脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）DNA高級(jí)結(jié)構(gòu)的形成分子生物學(xué)檢驗(yàn)中，主要內(nèi)容就是對(duì)DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)的分析，即DNA序列的分析DNA sequencing第一代：雙脫氧核苷酸末端終止法DNA sequencing第二代：焦磷酸測(cè)序（Pyrosequenci

2、ng）DNA sequencing第三代：?jiǎn)畏肿訉?shí)時(shí)測(cè)序（Single Molecule Real Time Sequencing , SMRT)The DNA sequencing is done on a chip that contains many ZMWs (Zero-mode waveguide)Inside each ZMW, a single active DNA polymerase with a single molecule of single stranded DNA template is immobilized to the bottom The signal fr

3、om a phospho-linked nucleotide incorporated by the DNA polymerase is detected as the DNA synthesis proceeds which results in the DNA sequencing in real time Developed by Pacific Biosciences 15-minute, $100 human genome sequencing DNA sequencing開(kāi)展個(gè)體化診斷與治療依賴于基因/基因組序列第一代測(cè)序技術(shù)：雙脫氧核苷酸末端終止測(cè)序法一個(gè)測(cè)序反應(yīng)可讀有效長(zhǎng)度：5

4、00bp 1000bp（1Kb）完成一個(gè)人基因組測(cè)序：3000000Kb（3000Mb）費(fèi)用：20元3000000 6000萬(wàn)元第二代測(cè)序技術(shù)：焦磷酸測(cè)序技術(shù)（高通量）Roche 454，運(yùn)行1次可測(cè) 1000000Kb/1萬(wàn)美元（3萬(wàn)美元）Illmina，運(yùn)行1次可測(cè) 2個(gè)人的基因組（3萬(wàn)美元），8 day 第三代測(cè)序技術(shù)（納米、單分子、實(shí)時(shí)）費(fèi)用：30億美元 3010萬(wàn)美元？ 1000美元100美元測(cè)序時(shí)間： 15年 6周 1周 ？ 60分 15分 2022/8/3112RNACoding RNAmRNANon-Coding RNASmall RNAsTranscription RNAsr

5、RNAtRNAmiRNASnoRNASnRNApiRNARNA分類16s rRNA基因是進(jìn)化遺傳研究的重要對(duì)象， 相對(duì)于細(xì)菌的表型鑒定， 16s rRNA基因檢測(cè)技術(shù)已成為細(xì)菌檢測(cè)和鑒定的使用廣泛和快速的工具；16S rRNA基因是存在于原核生物基因組上編碼rRNA相對(duì)應(yīng)的DNA序列；16S rRNA基因長(zhǎng)度是1.5kb， 具有高度保守性區(qū)域和高度特異性區(qū)域，特異性區(qū)域成為物種特異的標(biāo)志序列。Tumor-derived miRNAs are detectable in plasma. Mitchell P S et al. PNAS 2008;105:10513-105182008 by Na

6、tional Academy of SciencesDetection of human prostate cancer by serum levels of tumor-associated miRNA miR-141. Mitchell P S et al. PNAS 2008;105:10513-105182008 by National Academy of Sciences基因的結(jié)構(gòu)與功能基因的現(xiàn)代分子生物學(xué)概念是指編碼有功能的蛋白質(zhì)多肽鏈或合成RNA必需的全部核酸序列，是核酸分子的功能單位。原核生物的基因結(jié)構(gòu)示意圖終止子真核生物基因結(jié)構(gòu)示意圖表觀遺傳（epigenetics）是指在

7、DNA序列不發(fā)生改變的情況下，基因功能出現(xiàn)可逆的、可遺傳的變化。表觀遺傳現(xiàn)象包括組蛋白修飾、DNA甲基化、RNA干擾等。 表觀遺傳與基因功能修飾類型組蛋白H3K4H3K9H3K14H3K27H3K79H4K20H2BK5單甲基化 + + + + + +雙甲基化 +三甲基化 + +/ 乙酰化 + +注：“+”代表激活，“”代表抑制DNA甲基化（DNA methylation）是指生物體在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase，DNMT）的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl methionine，SAM）為甲基供體，將甲基轉(zhuǎn)移到特定的堿基上的過(guò)程 CpG isl

8、and and CpG site 突變（mutation）是指DNA序列的改變或重排。從突變的尺度和性質(zhì)上可以將其分為3類：染色體數(shù)目的改變（基因組突變）；染色體結(jié)構(gòu)的改變（染色體突變）；涉及單個(gè)基因的突變，也就是我們通常所講的基因突變。 點(diǎn)突變RNA加工突變插入/缺失突變動(dòng)態(tài)突變3000Full mutationPre-mutationNormalCAG repeat350520基因組（genome）是一個(gè)細(xì)胞或一種生物體的整套遺傳物質(zhì)，包括基因和非編碼DNA。更準(zhǔn)確地講，一個(gè)生物體的基因組是指一套染色體中的完整的DNA序列。 原核生物（prokaryote）是細(xì)菌、支原體、衣原體、立克次體

9、、螺旋體、放線菌和藍(lán)綠藻等原始生物的總稱，是最簡(jiǎn)單的細(xì)胞生物體，也是引起人類感染性疾病的重要病原體。 （一）原核生物基因組特征1原核生物基因組較小2原核生物的類核（nucleoid）結(jié)構(gòu) 3原核生物的操縱子（operon）結(jié)構(gòu)4原核生物的結(jié)構(gòu)基因5具有編碼同工酶的基因 6含有可移動(dòng)DNA序列質(zhì)粒（plasmid）是指細(xì)菌細(xì)胞染色體以外，能獨(dú)立復(fù)制并穩(wěn)定遺傳的共價(jià)閉合環(huán)狀分子。 質(zhì)粒是自行復(fù)制單位，有多個(gè)拷貝者，稱為松弛型質(zhì)粒（relaxed plasmid）；僅含一個(gè)或幾個(gè)拷貝者，稱為嚴(yán)緊型質(zhì)粒（stringent replication）。 利用同一復(fù)制系統(tǒng)的不同質(zhì)粒通常不能在同一菌株內(nèi)穩(wěn)定

10、共存，當(dāng)細(xì)胞分裂時(shí)就會(huì)分別進(jìn)入不同的子代細(xì)胞，這種現(xiàn)象叫做質(zhì)粒的不兼容性（incompatibility）。而利用不同復(fù)制系統(tǒng)的質(zhì)粒（如F和Col EI）可以在同一菌株內(nèi)穩(wěn)定共存，所以這些質(zhì)粒具有兼容性（compatibility）。 質(zhì)粒類型F質(zhì)粒 (Fertility plasmids) 編碼細(xì)菌性菌毛R質(zhì)粒 (Resistance plasmids) 編碼細(xì)菌耐藥性Col質(zhì)粒(colciogenic plasmid) 編碼大腸桿菌素代謝質(zhì)粒(Metabolic plasmid) Vi質(zhì)粒(virulence plasmids) 編碼細(xì)菌毒力因子R質(zhì)粒(R plasmid)接合型抗藥質(zhì)粒：

11、由抗藥轉(zhuǎn)移因子（RTF）和抗藥決定子或稱抗藥基因（RDF）組成非接合型抗藥質(zhì)粒：沒(méi)有抗藥轉(zhuǎn)移因子，只有抗藥基因（RDF）致育性和抗藥性導(dǎo)致它們成為傳染性抗藥因子FFFF-F質(zhì)粒的接合攜帶耐藥基因的轉(zhuǎn)座元件 核酸類型基因組組成病毒舉例DNA ：雙鏈DNA病毒（dsDNA）單純皰疹病毒、EB病毒、天花病毒、人乳頭瘤病毒：?jiǎn)捂淒NA病毒（ssDNA）貓細(xì)小病毒RNA：雙鏈RNA病毒（dsRNA）輪狀病毒：?jiǎn)喂烧淩NA病毒（+ssRNA）脊髓灰質(zhì)炎病毒、甲肝病毒、柯薩奇病毒、冠狀病毒、風(fēng)疹病毒、丙型肝炎病毒：?jiǎn)喂韶?fù)鏈RNA病毒 （-ssRNA）流感病毒、麻疹病毒、埃博拉病毒、狂犬病毒DNA/RNA：

12、單股正鏈RNA病毒（逆轉(zhuǎn)錄）（ssRNA-RT）人類免疫缺陷病毒：雙鏈DNA病毒（逆轉(zhuǎn)錄）(dsDNA-RT)乙型肝炎病毒巴爾的摩病毒分類及舉例病毒基因組的特點(diǎn)1基因組大小相差很大：HBV：3.2kb 痘病毒：300 kb2核酸結(jié)構(gòu)多樣性：DNA 或RNA 單鏈或雙鏈 合環(huán)狀分子或線性分子3基因組有重疊基因4基因組中基因操縱子結(jié)構(gòu)噬菌體X174基因組的重疊結(jié)構(gòu) 7. 多為單倍體，即每個(gè)基因只出現(xiàn)一次8. 相關(guān)基因叢集: 功能上相關(guān)的基因排列在一起9. 含有不規(guī)則結(jié)構(gòu)基因基因之間無(wú)間隔區(qū). mRNA5端無(wú)帽子結(jié)構(gòu). 結(jié)構(gòu)基因本身無(wú)翻譯起始序列.5. 基因有連續(xù)的和間斷的 (有內(nèi)含子) 6編碼序列

13、90%(基因組)人類基因組 1單一序列 又稱非重復(fù)序列，在基因組中僅有單一拷貝或少數(shù)幾個(gè)拷貝，約占到人類基因組的50%，絕大多數(shù)的蛋白質(zhì)編碼基因?yàn)閱我恍蛄?，但是單一序列大部分不編碼，長(zhǎng)度一般在幾個(gè)kb以下，分布在各種重復(fù)序列之間。2重復(fù)序列 人類基因組中的重復(fù)序列可以根據(jù)其組織形式分為兩種：串聯(lián)重復(fù)序列（tandem repeats）和分散重復(fù)序列（interspersed repeats），前一種成簇的存在于染色體的特定區(qū)域，后一種分散存在于染色體的位點(diǎn)上。 串聯(lián)重復(fù)序列：人類基因組中10%15%是串聯(lián)重復(fù)序列，以各自的核心序列（重復(fù)單元）首尾相連多次重復(fù)，長(zhǎng)度可達(dá)105bp106bp，為高

14、度重復(fù)序列，又稱為簡(jiǎn)單序列DNA，或衛(wèi)星DNA（satellite DNA）， 小衛(wèi)星DNA（minisatellite DNA）微衛(wèi)星DNA（microsatellite DNA） 可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)（variable number of tandem repeats，VNTR） 短串聯(lián)重復(fù)（short tandem repeat，STR）簡(jiǎn)單序列重復(fù)（simple sequence repeats，SSR） 散在重復(fù)序列：散在重復(fù)序列為中度重復(fù)序列，可分為三種類型：第一種為長(zhǎng)散在核元件（long interspersed nuclear element，LINE）和短散在核元件（short interspersed nuclear element，SINE），也稱為非LTR或polyA反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子（non-LTR 或polyA retrotransposons）；第二種為L(zhǎng)TR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子（LTR-retroposons），也稱為反轉(zhuǎn)錄病毒樣元件（retrov