免疫組化實驗課

1、免疫組化實驗課第1頁，共48頁，2022年，5月20日，5點24分，星期一實驗一 實驗動物取樣、固定與保存（4學(xué)時）實驗室規(guī)章制度及實驗室安全講解學(xué)生分組分小組配置相關(guān)溶液：操作動物的致死法及取材: 操作 細(xì)胞標(biāo)本的制備：操作尸體解剖的取材：講解活檢標(biāo)本的取材：講解組織樣品的固定：操作第2頁，共48頁，2022年，5月20日，5點24分，星期一實驗室規(guī)章制度及實驗室安全 熟悉你所使用的化學(xué)物質(zhì)的特性和潛在危害。 檢查設(shè)備的性能，充分考慮到使用設(shè)備的局限性。 工作中碰到疑問，及時請教技術(shù)負(fù)責(zé)人以及有豐富知識的專業(yè)人員，不得盲目操作。 不得在實驗室儲藏食品、吃食品、抽煙、使用化妝品以及清洗隱形眼鏡

2、。不得將家屬、小孩、親友帶進(jìn)化學(xué)實驗室。 必須戴防護(hù)鏡，穿工作服，包括不露腳趾的滿口鞋，長發(fā)必須束起。 熟悉在緊急情況下的逃離路線和緊急疏散方法；清楚滅火器材、安全淋浴間、眼睛沖洗器的位置、急救電話。 保持實驗室門和走道暢通，最小化存放實驗室的試劑數(shù)量，未經(jīng)允許嚴(yán)禁儲存劇毒藥品。 實驗必須在合適的通風(fēng)柜內(nèi)進(jìn)行，密閉和有壓力的實驗必須在特種實驗室進(jìn)行。 離開實驗室前須洗手，不可穿著實驗室服裝和戴手套進(jìn)入清潔場所，如餐廳和休息室等。 遇試劑溢出，應(yīng)當(dāng)立即清除。如溢出物有劇毒氣體揮發(fā)，當(dāng)事人無法處理，必須及時疏散人員并封閉現(xiàn)場，立即報告室主任和安全部門。 保持實驗室干凈整潔，無堆積，每天至少清理一次

3、實驗臺面，通常在下班前或完成某個特定實驗后進(jìn)行。 做實驗期間嚴(yán)禁脫崗。過夜實驗按所“過夜實驗管理辦法”執(zhí)行。 及時按規(guī)定處理廢棄化學(xué)品，包括化學(xué)廢棄物、過期化合物、生物廢棄物。每周在指定時間送往指定地點。 實驗室及禁煙區(qū)內(nèi)禁止吸煙，禁止吸游煙。嚴(yán)禁違章使用明火。 工作時間之外，任何人都不允許在實驗室單獨(dú)操作大型儀器和危險化學(xué)品，或單獨(dú)處于具潛在危險的場所。第3頁，共48頁，2022年，5月20日，5點24分，星期一學(xué)生分組1 學(xué)生分為6組，每組3個人，每組選一個小組長2 安排值日生第4頁，共48頁，2022年，5月20日，5點24分，星期一分小組配置相關(guān)溶液1 配制10XPBS及1XPBS10

4、Phosphate Buffered Solution（PBS）(pH 7.4) ：ReagentWeightFinal concentrationNaCl MW=58.4481.816 g1.4 MKCl MW=74.55 2.01 g27 mMNa2HPO412H2O MW=358.1435.8 g100 mMKH2PO4 MW=136.092.45 g18 mMH2OUp to 1000 ml注：1000 ml溶液用約1ml 10 M NaOH調(diào)節(jié)pH值至 7.4。因為實驗室所用蒸餾水、三蒸水和去離子水的本底pH值有一定差異，加之NaOH可能由于放置時間而產(chǎn)生pH值的變化，故實際用量需根

5、據(jù)情況調(diào)整。第5頁，共48頁，2022年，5月20日，5點24分，星期一2 配制1N HCl，1N NaOH3 配制組織固定液：4% PFA4 配制熱修復(fù)液：Tris-EDTA5 配制梯度酒精：75%， 85%，95%6 酒精：二甲苯=1:17 石蠟：二甲苯=1:1分小組配置相關(guān)溶液第6頁，共48頁，2022年，5月20日，5點24分，星期一動物的致死法動物處死方法： 1.麻醉法 乙醚或4戊巴比妥靜注 2.空氣栓塞法 3.斷頭法 4.斷頸法 5. 二氧化碳窒息法第7頁，共48頁，2022年，5月20日，5點24分，星期一病人死亡后，一般要在數(shù)小時后才能做尸檢，因此，及時取材，盡早固定是開展IH

6、C 檢測的關(guān)鍵。尸檢組織的取材第8頁，共48頁，2022年，5月20日，5點24分，星期一第9頁，共48頁，2022年，5月20日，5點24分，星期一抗原在組織中的分布常不均一，取材時應(yīng)考慮：主要病灶，病灶與正常組織交界處，遠(yuǎn)離病灶的正常組織。組織大?。洪L1cm寬1cm厚0.20.3cm。手術(shù)切除標(biāo)本的取材第10頁，共48頁，2022年，5月20日，5點24分，星期一1.組織要求離體后30min內(nèi)浸入固定液，尤其是開展分子生物學(xué)工作。 動物組織取材要求心臟還在跳動時取材。2.注意防止人為因素的影響 刀和剪要快，刀要足夠長。3.組織塊的大小 厚為0.10.3cm，大小可根據(jù)需要而定4. 組織的取

7、材位置 要視研究目的，觀察部位而定5.取材時間 原則上，應(yīng)盡快取材，但比較大的手術(shù)標(biāo)本如胃、肺、腸等器官，最好先固定后取材。組織取材注意事項第11頁，共48頁，2022年，5月20日，5點24分，星期一培養(yǎng)的活細(xì)胞可分貼壁和懸浮二種。貼壁細(xì)胞可將（1）細(xì)胞大量培養(yǎng)后，經(jīng)消化將細(xì)胞制成懸液（106）涂在涂有切片粘合劑的載玻片上，涼干后固定。（2）將細(xì)胞直接培養(yǎng)在蓋玻片上。（3）將細(xì)胞直接培養(yǎng)在6孔或9孔板上，經(jīng)固定后可行IHC?；罴?xì)胞標(biāo)本的制備法第12頁，共48頁，2022年，5月20日，5點24分，星期一目的 (1)防止組織細(xì)胞的死后變化，防止自溶和腐敗，以保持組織細(xì)胞的固有形態(tài)。 (2)使細(xì)

8、胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂肪、糖和酶等各種抗原成份轉(zhuǎn)變成不溶性物質(zhì)，以保持它原有的結(jié)構(gòu)與生活時相仿。（3）使組織中的各種物質(zhì)沉淀和凝固起來而產(chǎn)生不同的折射率，造成光學(xué)上的差異，以便染色后易于鑒別和觀察。（4）固定劑兼有硬化作用、使組織硬化、增加組織硬度、便于制片。（5）防止細(xì)胞過度收縮或膨脹而失去其原有形態(tài)結(jié)構(gòu)。（6）經(jīng)過固定的組織能對染料產(chǎn)生不同的親和力而著色清晰，便于辨認(rèn)。組織標(biāo)本的固定第13頁，共48頁，2022年，5月20日，5點24分，星期一 (1)甲醛固定液 10福爾馬林(2) 4多聚甲醛固定液(3)Bouin S液及改良Bouin S液固定液的種類第14頁，共48頁，2022年，5月20日

9、，5點24分，星期一(1)大小 2cm2cm0.3cm(2)及時固定(3)固定時間 固定時間要視組織塊的厚薄，固定液的種類及濃度，溫度而定，原則上，組織塊大小與固定時間成正比，固定液的穿透力及濃度與固定時間成反比。(4)組織固定后必須徹底沖洗。固定方法的選擇及注意事項第15頁，共48頁，2022年，5月20日，5點24分，星期一實驗步驟組織取材與細(xì)胞制備。組織取材：小鼠子宮、淋巴結(jié)、胸腺、脾、骨髓。組織洗滌。將取到的材料在滅菌預(yù)冷的PBS中洗凈，盡量徹底洗掉血液，以免切片觀察時紅細(xì)胞影響結(jié)果；組織固定。所取材料于4多聚甲醛中固定24小時（固定的時間依組織大小而定，組織較大可固定較長時間，如果一

10、開始分小塊固定，則固定時間應(yīng)縮短，約6小時）；組織脫水。分別用50和70酒精脫水1h，樣品在70酒精中置于4保存直至石蠟包埋；梯度脫水。組織塊從70酒精中取出，在80、95%、100、100酒精中各脫水1h；透明。組織塊在100酒精/二甲苯（1:1）中透明30min；再到二甲苯中透明，具體時間根據(jù)組織塊大小而定，以組織塊完全透明為宜；浸蠟。包埋機(jī)可直接接取加溫并過濾好的石蠟液體，組織塊在二甲苯/石蠟(1:1)、石蠟、石蠟中各透蠟2h；第16頁，共48頁，2022年，5月20日，5點24分，星期一實驗完畢整理實驗室及實驗臺第17頁，共48頁，2022年，5月20日，5點24分，星期一實驗二 組織

11、包埋與切片及HE染色（4學(xué)時）實驗內(nèi)容：1 經(jīng)脫水，透明，浸蠟的組織樣品進(jìn)行包埋：操作2 包埋樣品的切片：石蠟切片3 切片的HE染色：第18頁，共48頁，2022年，5月20日，5點24分，星期一目的：由于石蠟不溶于水和醇類試劑，只溶解在二甲苯類試劑中。因而,組織經(jīng)固定和水洗后含大量水分,需用乙醇類試劑進(jìn)行脫水,水脫完后,組織內(nèi)含有大量的乙醇,還必須用能溶解乙醇的二甲苯來置換,最后經(jīng)浸蠟,組織細(xì)胞內(nèi)被大量石蠟支撐,才使組織能用于石蠟切片。組織脫水、浸蠟及包埋第19頁，共48頁，2022年，5月20日，5點24分，星期一(1)脫水：75、85乙醇，95、 乙醇，無水乙醇、。(2)透明：二甲苯、二

12、甲苯、二甲苯(3)浸蠟：石蠟、石蠟、石蠟(4)石蠟包埋：修蠟塊，標(biāo)號常規(guī)石蠟包埋過程第20頁，共48頁，2022年，5月20日，5點24分，星期一一般的組織化學(xué)染色切片厚度要求在57 m左右，神經(jīng)組織切片的厚度要求比較特殊，一般在20100 m之間，以便觀察神經(jīng)纖維的走行。對于不同的組化反應(yīng)在切片制作上有不同的要求。目前的切片技術(shù)主要有：冰凍切片、石蠟切片、超薄切片（電鏡學(xué)）。 組織切片第21頁，共48頁，2022年，5月20日，5點24分，星期一 驟冷（Quenching）驟冷的目的 最主要的目的是防止標(biāo)本內(nèi)的水結(jié)成 冰晶破壞標(biāo)本結(jié)構(gòu)。 殺死組織（細(xì)胞）。 快捷制片。冰凍切片是酶組織化學(xué)和免

13、疫組織化學(xué)最常用的方法。它的突出特點：能比較好地保存組織的酶活性，較完好地保存組織抗原的免疫活性。 冰凍切片第22頁，共48頁，2022年，5月20日，5點24分，星期一 切片 驟冷后的組織塊切片機(jī)上切片，目前的 切片機(jī)有兩類：1）開放式冰凍切片機(jī)（半導(dǎo)體制冷切片機(jī)、 甲醇制冷切片機(jī)及老式CO2、氯乙烷等切片 機(jī)）。開放式冰凍切片機(jī)由于暴露于空氣 中，溫度不易控制，技術(shù)難度大，現(xiàn)多已 淘汰。2）恒溫冰凍切片機(jī)（Cryastat）常用 恒溫冰凍切片機(jī)切片后如不染色，必須冷 風(fēng)吹干，貯存于低溫冰箱內(nèi)或短暫預(yù)固定 后，冰箱貯存。 冰凍切片第23頁，共48頁，2022年，5月20日，5點24分，星期一

14、LEICA冰凍切片機(jī)第24頁，共48頁，2022年，5月20日，5點24分，星期一石蠟切片Leica RM2235 Rotary Microtome第25頁，共48頁，2022年，5月20日，5點24分，星期一第26頁，共48頁，2022年，5月20日，5點24分，星期一 (1)連續(xù)切片按序貼在玻片的下1/3。 (2)5260烤片。 (3)切片厚24m。 (4)切片刀要快 (5)編上號 (6)切片可在4保存數(shù)年（石蠟切片） (7)冰凍切片后需涼干后立即固定 (8)冰凍切片分固定和新鮮組織，固定組織需經(jīng)庶糖處理24h，冰凍切片。 (9)冰凍切片固定后-80保存?zhèn)溆们衅蠹白⒁馐马椀?7頁，共4

15、8頁，2022年，5月20日，5點24分，星期一包埋。在包埋盒底先鋪上一定厚度的石蠟，置于熱臺，將組織用鑷子放入，調(diào)整好方向，將包埋盒置于涼臺，使底部略微凝固，繼續(xù)澆上石蠟，放上切片托，涼臺冷凍，澆蠟，冷凍，直至整個蠟塊成型。置于涼臺，待石蠟徹底凝固后，利用切片托將蠟塊取出。組織切片。把切片刀架上，固定緊，然后利用切片托將蠟塊在切片機(jī)固定器上夾緊。若位置不夠平，可調(diào)整切片臺的位置，同時修塊。切片時，一開始可以將厚度調(diào)整至20m。右手勻速轉(zhuǎn)動手柄，直到把組織全部切出，這時將厚度調(diào)為5m，繼續(xù)切片。蠟片切成后，右手用小鑷子攝蠟片，左手用毛筆沿刀鋒輕輕把蠟片分開，切面朝下把切片放入42水中，展平后用

16、鑷子輕輕將連續(xù)蠟片分開，再用載玻片撈起，晾干，放入切片盒。37烤片過夜。石蠟包埋及切片實驗步驟第28頁，共48頁，2022年，5月20日，5點24分，星期一HE染色法，即是蘇木精-伊紅染色法。石蠟切片技術(shù)里常用的染色法之一 。蘇木精染液為堿性，主要使細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)與胞質(zhì)內(nèi)的核糖體著紫藍(lán)色；伊紅為酸性染料，主要使細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)中的成分著紅色。易于被堿性或酸性染料著色的性質(zhì)分別稱為嗜堿性和嗜酸性；若于兩種染料的親和力都不強(qiáng)，則稱中性。一般的組織變化和組織產(chǎn)物都可以通過這一染色法顯示出來。是形態(tài)學(xué)最常用的染色方法。HE染色第29頁，共48頁，2022年，5月20日，5點24分，星期一HE染色步

17、驟試劑時間次數(shù)1二甲苯10min32100酒精5min3395酒精5min1485酒精5min1570酒精5min1650酒精5min17蒸餾水5min38蘇木精染液10 min9自來水（緩流水）10min10蒸餾水2min1111HCl 分色1-2s（浸入即取出）12自來水（緩流水）立即沖凈13蒸餾水2min1140.1氨水 返藍(lán)2-2.5min15蒸餾水2min11650酒精5min11770酒精5min11885酒精5min119伊紅染液20s2095酒精 脫浮色5min12195酒精 5min122100酒精5min323二甲苯10min324二甲苯&封片劑封片25通風(fēng)櫥晾干4h或過夜

18、第30頁，共48頁，2022年，5月20日，5點24分，星期一實驗三 免疫組化染色（4學(xué)時）實驗內(nèi)容：1 免疫組化原理2 免疫組化操作第31頁，共48頁，2022年，5月20日，5點24分，星期一免疫組化原理抗原抗體（特異性）酶標(biāo)記抗體，通過酶與底物作用生成有色反應(yīng)物，定位組織或細(xì)胞內(nèi)抗原的一門技術(shù)。第32頁，共48頁，2022年，5月20日，5點24分，星期一設(shè)對照的目的是為了排除假陰性和假陽性。對照染色的目的第33頁，共48頁，2022年，5月20日，5點24分，星期一假陰性的原因主要有：組織處理不當(dāng)，抗原丟失過多或被遮蔽；抗體失活、效價過低或稀釋度不合適（主要指一抗，即特異性抗體）；染色

19、步驟遺漏及差錯，或顯色劑的選擇、緩沖液的pH和離子強(qiáng)度不當(dāng)?shù)取?第34頁，共48頁，2022年，5月20日，5點24分，星期一假陽性均系由多種因素造成的非特異著色所致，原因主要有：自發(fā)熒光或內(nèi)源酶等干擾；抗體試劑不純(特別是一抗）；操作失誤，如污染、切片干枯或顯色劑操作不當(dāng)?shù)?；?5頁，共48頁，2022年，5月20日，5點24分，星期一對照染色大致可分為陽性組織對照、陰性組織及陰性試劑對照和自身對照四大類：對照的種類及其選用目的 第36頁，共48頁，2022年，5月20日，5點24分，星期一陽性組織對照 指用已證實含有靶抗原的同源及不同源組織切片或細(xì)胞涂片與待檢實驗切片同時作同樣處理和免疫染

20、色的組織對照。正確的結(jié)果應(yīng)呈現(xiàn)陽性，目的是為了證實所用免疫組化染色流程的有效性，排除假陰性的可能。 對照的種類及其選用目的 第37頁，共48頁，2022年，5月20日，5點24分，星期一陰性組織對照 指用已證實不含靶抗原的同步處理和免疫標(biāo)記染色的組織對照。正確的結(jié)果應(yīng)為陰性，目的是除外假陽性。對照的種類及其選用目的 第38頁，共48頁，2022年，5月20日，5點24分，星期一空白對照指以緩沖液（PBS、TBS等）取代第一抗體（主要的，必要時還可做第二抗體及橋聯(lián)抗體的空白取代），其他各步不變的試劑對照染色，結(jié)果應(yīng)為陰性。 對照的種類及其選用目的 第39頁，共48頁，2022年，5月20日，5點24分，星期一取代對照 指以所用方法第一抗體同源動物的正常血清，或與本實驗無關(guān)的抗體(靶生物缺如的)取代第一抗體，其他步驟不變的試劑對照染色，結(jié)果應(yīng)為陰性。吸收試驗 是指用事先經(jīng)過量抗原吸收的第一抗體上清液取代第一抗體，其他步驟不變的免疫染色試劑對照。結(jié)果應(yīng)是陰性或陽性著色明顯減弱（吸收不全時）。 對照的種類及其選用目的 第40