病理技術(shù)在醫(yī)學(xué)科研中的應(yīng)用

1、病理技術(shù)在醫(yī)學(xué)科研中的應(yīng)用病理學(xué)科是一門(mén)基礎(chǔ)與臨床之間起著橋梁作用的重要學(xué)科,病理研究方法在技術(shù)工作上又 TOC o 1-5 h z 是多方面的 ,有尸體解剖,大體標(biāo)本的制作,制片（石臘切片,冰凍切片,半薄切片,超薄切片等）,組織化學(xué)方法,免疫酶標(biāo)技術(shù),熒光技術(shù),攝影技術(shù)等.作為實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員大量的工作是病理制片技術(shù), 即常規(guī)病理切片,特殊染色,以供教學(xué),科研,臨床活檢診斷之用 .第一章病理技術(shù)的應(yīng)用范圍幫助臨床查明死因（原因不明的死亡）手術(shù)后病變標(biāo)本,以明確診斷（臨床活檢）提供教學(xué),科研的資料第一節(jié) 組織制片的概述組織制片技術(shù)的應(yīng)用 ,從 1665年由 HOOk 發(fā)現(xiàn)細(xì)胞開(kāi)始 ,已有 300多

2、年的歷史.最早應(yīng)用冰凍切片 ; 隨后又進(jìn)一步利用石蠟的硬度,以石蠟包埋組織,制成石臘切片;后來(lái)又利用明膠,火棉膠 ,碳蠟和塑料等物質(zhì)的韌性,以其包埋組織而制作切片.組織制片技術(shù)隨著生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的發(fā)展而發(fā)展.切片染色方法可以顯示不同細(xì)胞和組織形態(tài), 以及細(xì)胞和組織中某些化學(xué)成分含量的變化.因此 ,組織制片技術(shù)是教學(xué),醫(yī)學(xué)和科研中不可缺少的一個(gè)組成部分.第二節(jié) 制片的種類(lèi)1,組織切片法任何組織切片必須依靠切片機(jī)將組織切成薄片（厚度以小山計(jì)），再進(jìn)行染色而得到結(jié)果.在切成薄片以前必須設(shè)法使組織內(nèi)部滲入足夠的支持物質(zhì),使組織保持一定的硬度,然后使用切片機(jī)進(jìn)行切片.滲透到組織中的支持劑（物質(zhì)）有多種,如

3、石臘,明膠,火棉膠和塑料等.冰凍組織切片法是直接利用快速冷凍法進(jìn)行切片 .2,組織非切片法不用切片機(jī),不經(jīng)過(guò)切片手續(xù)而制成組織切片的方法,包括整體封藏法,浮片法 ,壓碎法和組織直接印片法.這些方法操作簡(jiǎn)單而快,可根據(jù)制片的需要進(jìn)行選擇使用.第三節(jié) 制片方法的程序組織切片法制作過(guò)程中的各種操作1,取材與固定取材是根據(jù)實(shí)驗(yàn)的目的和要求及病變程度而合理取得組織材料.固定是用化學(xué)藥品把組織原來(lái)的結(jié)構(gòu)保存下來(lái),以便觀察研究之用 , 固定劑同時(shí)具有硬化細(xì)胞組織的作用 ,使制片便于進(jìn)行 .2,洗滌與脫水 TOC o 1-5 h z 洗滌是把滲入組織中的固定劑洗去,防止染色中的結(jié)晶產(chǎn)生.脫水是驅(qū)除組織中的水分

4、,以利于透明和浸蠟 .3,透明與浸蠟（透蠟）脫水后的組織中水分已被透明可代替,而有利于浸蠟.浸蠟的目的是使組織有一定的硬度而有利于切片和細(xì)胞組織保持一定的生活時(shí)狀態(tài).4,包埋與切片用石蠟和其他包埋劑將組織包繞一定的形狀以便于切片 .將包埋好的組織塊用切片機(jī)切成一定的厚度（以小山計(jì)）.5,貼片（展片,撈片）和染色 TOC o 1-5 h z 將已切妥的切片在溫水中展平整后用載玻片貼上,稍晾趕后再烤片.染色可使細(xì)胞和組織被染上不同的顏色而產(chǎn)生一定的折射率,便于顯微鏡觀察.6,封 片切片染色后用膠類(lèi)物質(zhì)將其封固,以利于長(zhǎng)期保存.二 , 組織切片的主要程序.標(biāo)本切開(kāi)或取厚塊-組織固定一固定后處理一（石

5、臘切片法）脫水一透明-浸蠟一包埋一 切片一粘片一脫蠟-各級(jí)乙醇-水洗-常規(guī)染色或特殊染色-脫水-透明一樹(shù)膠封片.標(biāo)本切開(kāi)或取厚塊一組織固定（冰凍切片法）-冰凍切片-粘片一乙醇固定及水洗一常規(guī) 染色一脫水-透明一樹(shù)膠封片.第二章固定 ,固定液和取材第一節(jié) 組織固定方法在制作組織切片的過(guò)程中 ,首先將組織充分固定后才能進(jìn)行制片 ,尤其對(duì)石蠟切片 ,這是不可少的重要步驟 .1,固定的意義就是使要觀察的組織構(gòu)造盡量接近于它生前的正常狀態(tài).2,組織固定的目的1） 迅速防止組織 , 細(xì)胞的死后變化,防止自溶與腐敗,以保持組織和細(xì)胞與正常生活時(shí)的形態(tài)相似 .2）使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì),脂肪,糖 ,酶等各種成分轉(zhuǎn)變

6、成不溶性物質(zhì),以保持它原有的結(jié)構(gòu)與生活時(shí)相仿 .3）使組織中的各種物質(zhì)沉淀和凝固起來(lái),而產(chǎn)生不同的折射率,造成光學(xué)上的差異, 以便染 TOC o 1-5 h z 色后易于鑒別和觀察.固定劑兼有硬化作用 ,使組織硬化增加組織硬義,便于制片.防止細(xì)胞過(guò)度收縮或膨脹而失去其原有形態(tài)結(jié)構(gòu) .6）經(jīng)過(guò)固定的組織,能對(duì)染料產(chǎn)生不同的親和力而著色清晰,便于辯認(rèn).由于固定的目的是在于盡量使組織和細(xì)胞保持與生活時(shí)相仿的成分和形態(tài).因此 , 固定的組織愈新鮮愈好, 固定組織時(shí) ,應(yīng)使用足量的固定液,其固定液的量一般不少于組織塊總體積的 4 倍以上 .3,固定劑的性質(zhì) TOC o 1-5 h z 為了能夠達(dá)到固定的

7、目的 ,必須具備以下的性質(zhì):迅速滲入組織而固定原生質(zhì),使短期解剖的組織形態(tài)不至于有較大變化 .固定液有相當(dāng)?shù)臐B透力,對(duì)組織各部分的滲透力相等,可使組織內(nèi)外完全固定.3）使組織細(xì)胞中不至于因固定引起人為的改變.4）在凝固原生質(zhì)以后,增加細(xì)胞對(duì)于各種穿透的抵抗力 ,不至于因以后的處理而使固定后的原生質(zhì)變形.5）盡可能避免使組織膨脹或收縮 .6）能使細(xì)胞內(nèi)的成分（蛋白質(zhì)） 凝固或沉淀下來(lái).7）增加細(xì)胞內(nèi)含物的折光程度,易于鑒別.增加媒染作用和染色能力.8）使組織變硬,適于制片,但又不使材料太堅(jiān)硬而松脆 .9）使組織充分固定,便于保存.第二節(jié) 介紹幾種常見(jiàn)固定液固定劑有簡(jiǎn)單固定劑（液）和混合固定劑兩類(lèi)

8、.作為較好的固定液,首先有強(qiáng)滲透力 ,能迅速地滲入組織內(nèi)部 ;其次不會(huì)使組織過(guò)渡收縮或膨脹,并能使組織內(nèi)易觀察的成分得以凝固為不溶性物質(zhì);最后能使組織達(dá)到一定硬度,獲得較佳的折光率和對(duì)某些染料具有較強(qiáng)的親和力 .一 ,簡(jiǎn)單（單純） 固定液1,甲醛 （Formeldehyde）甲醛（福爾馬林）為一種無(wú)色氣體,溶于水成為甲醛水溶液, 甲醛是一種還原劑,極易揮發(fā)旦有強(qiáng)烈刺激性氣味.在平時(shí)常用的甲醛濃度為10%,這是指以10ml 甲醛加入 90ml 的水配成的 ,此液實(shí)際上只有4%的甲醛.甲醛水溶液滲透力強(qiáng) , 固定均勻 ,對(duì)組織收縮較少 .但經(jīng)乙醇脫水時(shí)收縮很大,它能使組織硬化并增加組織的彈性. 固

9、定厚度適當(dāng)?shù)慕M織,較為適宜. 因早醛為非沉淀性固定劑,它不能使白蛋的及抗蛋白沉淀;但可與蛋白質(zhì)化合,對(duì)脂肪,神經(jīng),及髓鞘的固定很好,也可固定高爾基體,線粒體 ,又是復(fù)糖的保存劑,使肝糖元變?yōu)槲⒓?xì)的顆粒團(tuán).使用甲醛固定的陳舊組織,以多血的贓器如脾,肝等 ,較易發(fā)生黑色或棕黑色的沉淀,稱(chēng)甲醛色素 .2,乙醇 (Ethyl alcohol)乙醇為無(wú)色液體,可以水在任何比例下混合.它是一種還原劑,很易被氧化為乙醛,在變?yōu)榇?TOC o 1-5 h z 酸,所以不能與鉻酸,重鉻酸鉀,鋨酸等氧化劑混合.用于固定時(shí)以 80% 95%的濃度為好,它具有固定硬化脫水等多種作用.高濃度乙醇固定的組織硬化顯著,組織

10、在高濃度乙醇中留置過(guò)久,易變脆 ,也使組織收縮明顯 ,均可縮小原組織體積的 20%.因 70%乙醇可較久的保存組織.另外 ,乙醇其滲透力較弱,能沉淀白蛋白,球蛋白和核蛋白.因此,乙醇除固定作用外,還具有硬化和脫水作用 ,所以它在制片過(guò)程中用途很大.3,醋酸 (Acetic acid)醋酸又名乙酸,是帶有刺激味的無(wú)色液體,因在室溫15時(shí)常結(jié)成冰狀 冰醋酸 .特性 :(1)在 15時(shí)成冰狀結(jié)晶,有刺激性味,可溶水 ,乙醇一般配成5%作為混合固定液.(2)醋酸只能沉淀核蛋白,對(duì)染色質(zhì), 固定較好 ,對(duì)白蛋白,球蛋白,固定不佳.對(duì)脂肪,糖元不能固定.(3)醋酸能使組織膨脹,因此 ,可抵償因乙醇,升汞

11、,甲醛等固定液引起的組織收縮和硬化,故常配成混合固定液.(4)醋酸穿透速度最快,米粒大的組織在單純醋酸固定液中 1 2h 即可.5%醋酸的pH 值在2弋戲匕時(shí)可停止細(xì)菌和酶的活動(dòng)，可防止組織自溶變性.4,氯化汞 (Mercury bichloride)氯化汞俗稱(chēng)升汞.為白色粉末或針狀結(jié)晶,有劇毒,必須嚴(yán)格保管及注意使用 .通常用其飽和水溶液,在室溫的水中飽和度為5%7%.特性 :（1）能沉淀蛋白質(zhì),它不能固定脂肪,類(lèi)脂和糖類(lèi).（2）穿透力較弱 ,單獨(dú)使用可使組織收縮.因此,多與醋酸和鉻鹽（重鉻酸鉀）配成混合固定液組織宜薄而小 2 3 毫米,固定6 18h.（3）升汞混合液固定的組織對(duì)于細(xì)胞的結(jié)

12、構(gòu),特別是核的細(xì)微結(jié)構(gòu),顯示由為清晰.（4）經(jīng)升汞固定的組織易產(chǎn)生汞鹽的沉著 （為棕黑色結(jié)晶 ）易損害切片刀 ,因此染色前必須脫汞.5,苦味酸 （Picric acid）苦味酸是一種黃色結(jié)晶 , 是一種相當(dāng)強(qiáng)的酸. 它在水中的溶解度隨室溫而變化 , 約在0.91.2%,在空氣中能自燃,在密閉器中能劇裂爆炸.為使用安全起見(jiàn),常制成飽和水溶液貯藏保存 .特性 : TOC o 1-5 h z 1）能沉淀蛋白質(zhì),但對(duì)脂肪和類(lèi)脂無(wú)固定作用.2）穿透力很慢,細(xì)胞收縮顯著,但不會(huì)使組織硬化 .3）有軟化皮膚的作用,配制的Bouin 氏液對(duì)頭皮及全身皮膚制片效果甚好 .4）苦味酸固定的組織,固定時(shí)間太久會(huì)影響

13、HE 染色 （苦味酸對(duì)堿性染料不易著色）.5）苦味酸酒精飽和液為糖元較好的沉淀劑.6,丙酮丙酮又名醋酮或本酮,極易揮發(fā),易燃的無(wú)色液體,能與水,醇,氯仿,醚及多種溶液混合.特性 :1）它可以作固定劑,又可作脫水劑 ,穿透速度快,可使蛋白質(zhì)沉淀凝固,2毫米以下的組織固定半小時(shí)至 1 小時(shí)即可 .2）可引起組織較強(qiáng)的收縮使之變硬,對(duì)核固定不佳.3）對(duì)某些酶的固定很好,如堿性磷酸酶,酸性磷酸酶等.4）丙酮一般多與氯化汞,甲醛混合液使用,先用低濃度丙酮再經(jīng)高濃度丙酮固定以減少組織收縮和過(guò)度硬化 .7,重鉻酸鉀1）為橙紅色結(jié)晶,有毒 ,是強(qiáng)氧化劑 ,不能與酒精等還原劑混合,常配成0.5%水溶液固定組織.

14、2）重鉻酸鉀單獨(dú)固定組織不能沉淀蛋白質(zhì),但加入冰醋酸轉(zhuǎn)變?yōu)殂t酸,（即酸化重鉻酸鉀）,可使蛋白質(zhì)凝固沉淀.3）重絡(luò)酸鉀與甲醛混合（臨用時(shí)配過(guò)久失效）為未酸化的重鉻酸鉀固定劑,是固定線粒體,高爾基復(fù)合體和嗜鉻細(xì)胞等優(yōu)良固定劑 ,若配成 Eenker 氏液 ,能很好的固定細(xì)胞質(zhì),胞核及染色體 .4）重鉻酸鉀穿透速度快,固定組織收縮很小,但經(jīng)酒精脫水時(shí)都有明顯收縮.經(jīng)重絡(luò)酸鉀固定的組織必須流水充分洗滌（612h）,否則影響染色.5）經(jīng)重鉻酸鉀固定的組織 ,對(duì)酸性染料,如伊紅染色良好,但對(duì)堿性料染,如蘇木素較差,若加 TOC o 1-5 h z 入升汞及醋酸等,則對(duì)細(xì)胞核染色極佳.以上敘述了幾種單純固定

15、液的性質(zhì)和用途,它們各有其優(yōu)缺點(diǎn),但單獨(dú)使用的不多 ,而混合固定液的應(yīng)用更為廣泛.單獨(dú)固定液如重鉻酸鉀等單獨(dú)應(yīng)用效果不好 ,若與其他固定劑混合就可以成為優(yōu)良的固定液.二,介紹幾種常用的混合固定液1,乙醇 甲醛液 （AF 液）配制:95%或無(wú)水乙醇90ml加入40%并裝甲醛10ml為常用固定液，取材后立即入此固定液. 此液兼有脫水作用，用于固定肥大細(xì)胞和糖元較好，米粒大小固定46h,大塊組織1224h, 固定后不經(jīng)水洗,直接放入95%酒精開(kāi)始脫水.2,AAF 液配制：純酒精85ml+醋酸5ml+甲醛10ml3,Zenker 氏液配制:重銘酸鉀2.5g+升汞5g+蒸儲(chǔ)水100ml加溫溶解，冷卻過(guò)濾

16、，貯于棕色瓶?jī)?nèi)，成為貯存液.用時(shí)取此液臨 95ml 再加入冰醋酸5ml 即成 .Zenker 氏液為組織學(xué) ,細(xì)胞學(xué),病理學(xué)常用的固定液,多用于固定一般組織,能使細(xì)胞核和細(xì)胞漿染色較為清晰，固定時(shí)間1224h然后沖洗24h,切片脫臘后需脫汞（浸入5%碘酒精10）,脫碘（5%硫代硫酸鈉）一流水洗.4,Bouin 氏液配制苦味酸飽和液75ml+甲醛25ml+冰醋酸5ml此液滲透快,組織收縮小,固定均勻,此液為常用固定液.它對(duì)肝,皮膚 ,胰臟特染效果好,但此液固定過(guò)久對(duì)堿性染料的著色有影響 .5,Garnay 氏液配制純酒精60ml+氯仿30ml+醋酸10ml為細(xì)胞極好的固定液，對(duì)淋巴組織及腺體固定

17、很好，米粒大的組織固定12h,也適宜RNA,DNA及糧元的固定.6,甲醛 生理鹽水配制甲醛10ml+生理鹽水90ml PH值為7此固定液是應(yīng)用最廣的一種，它可以保護(hù)脂類(lèi)和細(xì)胞核.在作酸性染色時(shí)，入V-G,或三重染色之前，還可以再使用第2次固定.第三章洗滌 ,脫水 ,透明 ,浸蠟和包埋 ,切片第一節(jié) 組織洗滌一,洗滌的目的組織在固定后一定要把滲透到里面的固定液洗去,然后再進(jìn)行下一步過(guò)程.為防止組織中留有較多的固定液而影響脫水劑,甚至可在組織中發(fā)生沉淀物或結(jié)晶而影響觀察,特別是對(duì)陳舊性標(biāo)本更應(yīng)注意流水沖洗,盡可能減少組織中的酸性程度和甲醛色素.對(duì)混合性固定液 ,更應(yīng)及時(shí)洗滌,有利于脫水直至切片和染

18、色.二,洗滌的方法.固定劑以水配制者用流水沖洗,可使組織中的固定液隨時(shí)溢出和隨時(shí)洗去.常用的固定劑是甲醛液（10 %甲醛水液 ）,尸檢組織 ,大動(dòng)物組織沖洗時(shí)間為 24h 左右 ,小動(dòng)物組織沖洗時(shí)間為 2-10h 左右 . 固定劑含乙醇者 乙醇或乙醇混合液固定液者 ,一般不要求沖洗,如需沖洗必需采用與固 TOC o 1-5 h z 定劑中的乙醇濃度相近的乙醇沖洗,不可用水沖洗,也不應(yīng)用濃度相差很大的乙醇沖洗,溶液以除去之.三,特殊固定液洗滌法.重銘酸鉀 用重銘酸鉀固定的組織可用流水沖洗12-24h,或用亞硫酸，或用1 %含水氯溶液進(jìn)行洗滌.苦味酸含苦味酸固定的組織,可用50 %或 70 %乙醇

19、浸洗.氯化汞用氯化汞固定的組織內(nèi)常有一種沉淀物生成,呈棱形或不規(guī)則或略圓的塊狀物 ,棱形物被認(rèn)為氯化亞汞,不規(guī)則物可能是金屬汞,此種結(jié)晶必需洗去,否則會(huì)使組織發(fā)脆,或染色不良 .第二節(jié)組織脫水一,脫水的目的和原則組織經(jīng)固定和水洗后 ,會(huì)有大量水分,而水與苯根本不相融合,所以組織在透明前必須經(jīng)過(guò)脫水這一環(huán)節(jié).就是說(shuō)用某些溶劑逐步將組織塊吸收的水分置換出來(lái), 以利于透明劑和石 TOC o 1-5 h z 蠟或火綿膠的滲入,這一過(guò)程叫脫水.尸檢及活檢有條件時(shí),將組織分別進(jìn)行脫水,如腦 ,胰腺 ,肌肉,胸腺或淋巴結(jié),肝,脾等組織 .因?yàn)槊撍畷r(shí)間差異性較大,最好是單獨(dú)處理.動(dòng)物組織 應(yīng)區(qū)分動(dòng)物大,小,如

20、狗組織接近新生兒組織,大白鼠和小白鼠也有差異,前者需時(shí)稍長(zhǎng) ,后者則較短.脫水時(shí)間與脫水劑的關(guān)系 脫水劑的 新舊 （純度 ）影響脫水時(shí)間,必須靈活掌握.穿刺組織 如腎穿刺,徑胃鏡取得組織等,因組織塊很小,常規(guī)用擦鏡紙包裹,防止丟失 .二,脫水劑的種類(lèi)和效果.非石蠟溶劑的脫水劑 如乙醇和丙酮等,其組織在脫水后必須再經(jīng)二甲苯透明才能浸蠟.脫水兼石蠟溶劑的脫水劑 如正丁醇等組織在脫水后即可直接浸蠟,不比經(jīng)過(guò)中間溶劑如二甲苯之類(lèi)的試劑 .脫水種類(lèi)可根據(jù)須要選擇,目前在病理診斷和實(shí)驗(yàn)性動(dòng)物研究中 ,較多地采用乙醇脫水,二甲苯透明和石蠟浸透組織.脫水方法甚多 ,最重要的是不應(yīng)驟然進(jìn)行,不能操之過(guò)急,否則可

21、引起組織強(qiáng)烈收縮,或使組織發(fā)生變形,而得不到滿意切片.三,常用脫水劑的使用方法1,乙醇 （Alcohol 酒精 ）沸點(diǎn)78.4 ,為最常用的脫水劑 .脫水能力強(qiáng) ,并能使組織硬化,能較好地與二甲苯透明劑相溶合 .其缺點(diǎn)是易使組織收縮,變脆.導(dǎo)致這些缺點(diǎn)是因?yàn)榻M織在高濃度乙醇（無(wú)水乙醇）中停留時(shí)間較長(zhǎng) ,或者加溫脫水的溫度過(guò)高.在日常中一般脫水從70%乙醇（人體組織從75%）開(kāi)始 ,由低向高的梯度脫水.一般的脫水順序是：75% ,95%，95%，無(wú)水乙醇，無(wú)水乙醇.只有脫水充分才能在透明劑中透明 .2,丙酮 (Acetone)沸點(diǎn)為56 .脫水作用比乙醇強(qiáng),但是對(duì)組織切的收縮較大,而價(jià)格較高 ,

22、故一般少用于組織的脫水 ,主要用于快速脫水或固定兼脫水.脫水時(shí)間 1 3h.3,正丁醇 (N-Butyl-alcohol)為無(wú)色液體，沸點(diǎn)100118C,微溶于水，在100ml水中能溶8.3g,故脫水能力較弱，但能與水,乙醇及石臘混合,故這種脫水的組織塊,可直接浸蠟包埋.這種脫水劑兼透明劑的最大優(yōu)點(diǎn)是很少引起組織塊的收縮及變脆 .第三節(jié) 組織透明一,透明的目的在制片過(guò)程中有兩次透明,第一次是脫水以后組織塊的透明,第二次透明是染色以后切片 TOC o 1-5 h z 的透明.組織塊透明的目的是便于透蠟包埋,切片透明的月的就是有利光線的透過(guò),便于顯微鏡下的觀察.組織塊在浸蠟前 ,必須通過(guò)透明以便使

23、石蠟浸入組織內(nèi) ,起充分支持硬化組織塊的作用 ,以便完整切片 .通常根據(jù)透明時(shí)間與肉眼觀察相結(jié)合判斷透明程度.二,常用透明劑的種類(lèi)和使用方法最常用透明劑的種類(lèi)較多 ,但使用最多的是二甲苯.1,二甲苯易揮發(fā),無(wú)色透明液體,長(zhǎng)期接觸對(duì)呼吸粘膜有刺激作用.透明能力強(qiáng),易使組織收縮,變脆 ,故組織塊在二甲苯中宜久留,特別對(duì)小動(dòng)物組織材料必須嚴(yán)格控制好.2,甲苯性質(zhì)雖同二早苯,但透明較慢,時(shí)間比二甲苯長(zhǎng)一倍多,也易變脆.有時(shí)用以代替二甲苯.苯的用途與二甲苯相似,對(duì)組織有較小收縮,是較好的透明劑.但也易揮發(fā),易燃.吸入苯能引起中毒,可以較小使用.4,氯仿即三氯甲烷.其透明能力比二甲苯及苯差，透明時(shí)間長(zhǎng)達(dá)2

24、4h.不易使組織變脆，能溶于醇，醍,苯等,微溶于水,極易揮發(fā) .多用于大塊組織的透明 .5,香柏油對(duì)組織收縮及硬化程度比任何透明劑小 ,但透明時(shí)間長(zhǎng),小塊組織至少 12h 以上 ,缺點(diǎn)它不能溶解石臘,透明以后還需二甲苯補(bǔ)充透明.6,松節(jié)油 ,汽油可作脫水,又可透明,但需用優(yōu)質(zhì)（無(wú)雜質(zhì)）的工業(yè)汽油也不行,在條件困難時(shí)可試用 .第四節(jié),組織浸蠟（透蠟 ）浸蠟的目的和方法組織經(jīng)過(guò)脫水,透明后要用石蠟,火棉膠,碳蠟等支持劑透入內(nèi)部,使其變硬并將組織包埋進(jìn)去以利于切片和觀察,這個(gè)過(guò)程稱(chēng)為 透入 （浸蠟） 或包埋.以石蠟切片的透入即 （浸蠟 ） 為例,其目的就是除去組織中透明劑（如二甲苯等）而代之以石臘,

25、并滲入組織內(nèi)部,把軟組織變?yōu)檫m當(dāng)硬度的蠟塊,以便切成薄片 .浸蠟的方法是將組織經(jīng)過(guò)二甲苯透明以后,并立即投入到液體石蠟中去.在浸蠟時(shí)組織必須經(jīng)過(guò)數(shù)次純石蠟（石蠟I , n ,m）,這樣可以使石蠟中剩余的透明劑完全除盡，以免影響切片質(zhì)量 .浸蠟劑的種類(lèi) TOC o 1-5 h z 1,石蠟 石蠟有高熔點(diǎn)和低熔點(diǎn)之分,一般普遍應(yīng)用熔點(diǎn)為56以上的石蠟.低熔點(diǎn)在54以下,用于酶的顯示和保存抗原活性.石蠟分軟蠟 （52 54）,硬蠟 （56 58）,蜂蠟60 .,氣溫低時(shí)用軟蠟.2,火棉膠 目前使用火棉膠透入組織較少 ,用于染色前的覆蓋液較多 .3,碳蠟4,明膠第五節(jié) 組織包埋石蠟是動(dòng)物植物,人體組織

26、制片技術(shù)中極重要且應(yīng)用最廣的包埋劑.包埋蠟須在溫箱內(nèi)經(jīng)多次熔化沉淀后的干凈蠟 ,包埋較為理想 ,其包埋蠟熔點(diǎn)為56 58.石蠟包埋的注意點(diǎn) :(1)動(dòng)作要迅速:特別是冬天,在有多塊組織要包埋時(shí),蠟很快會(huì)凝固,就包埋不成 . TOC o 1-5 h z (2)切而向下埋:組織包埋要平整或按要求包埋.(3)包埋的鑷子必須加溫 ,鑷子溫度又不能太高,否則會(huì)燒壞組織.(4)包埋后待蠟塊冷卻后再放入冷水中 ,不能太快,否則變形有氣泡.(5)包埋時(shí)組織不能重疊擠壓,否則切片不全會(huì)影響診斷.(6)包埋用的蠟一般為工業(yè)蠟,氣候炎熱可用熔點(diǎn)高石蠟(60 )第六節(jié)組織脫水透明和浸蠟時(shí)間各種組織的脫水透明和浸蠟時(shí)間

27、表 3-1 尸體解剖組織脫水,透明和浸蠟時(shí)間表時(shí)間長(zhǎng)短均可5 10h5 10h5 10h2 5h2 5h30 min30 min-1h30 min-1h1-2h1-2h2-4h75%乙醇85%乙醇95 %乙醇95 %乙醇無(wú)水乙醇無(wú)水乙醇無(wú)水乙醇二甲苯二甲苯二甲苯石蠟 56 58石蠟 56 58石蠟 56 5815678910111213時(shí)間分配項(xiàng)目程序表 3-2 動(dòng)物 （鼠）組織脫水,透明和浸蠟時(shí)間表時(shí)間長(zhǎng)短均可2 5h2 5h2 5h20 min30 min30 min15 min10 min1-2h1-2h75%乙醇85%乙醇95 %乙醇95 %乙醇無(wú)水乙醇無(wú)水乙醇無(wú)水乙醇二甲苯二甲苯二甲

28、苯 TOC o 1-5 h z 石蠟56 58石蠟56 58石蠟56 58時(shí)間分配項(xiàng)目程序表 3-3 外檢組織脫水 ,透明和浸蠟時(shí)間表時(shí)間長(zhǎng)短均可1 2h1 2h1 2h1 2h2h2h1h2h1-2h1-2h2h4h85%乙醇95%乙醇95 %乙醇95 %乙醇無(wú)水乙醇無(wú)水乙醇無(wú)水乙醇二甲苯二甲苯二甲苯石蠟 56 58石蠟 56 58石蠟 56 581234567891011時(shí)間分配項(xiàng)目程序第七節(jié) 組織切片一,石蠟切片法1,切片前的準(zhǔn)備工作石蠟切片是以石蠟作為組織的支持媒介作用.應(yīng)先將包埋的每塊組織周?chē)^(guò)多的石蠟切去組織四周留 2mm 的石蠟邊 .在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室中須備以下用品 經(jīng)過(guò)清潔液浸泡過(guò)的

29、載玻片 . 展片盆 ,染色架 ,蛋白甘油 . 大 ,中號(hào)毛筆 ,眼科鑷 （彎）2,切片制作過(guò)程 將預(yù)先冷卻的組織裝在切片機(jī)固定器上 . 切片組織經(jīng)過(guò)粗切 ,待組織充分切完整 ,右手旋動(dòng)切片機(jī)把,切片帶出來(lái)之后,用毛筆輕 TOC o 1-5 h z 輕托起,再用眼科鑷輕攝蠟片,以正面放入展片盆中,待攤平整后撈片. 撈片在載玻片上的二分之一以處. 切片附貼后,放在空氣中稍涼干,即可進(jìn)行烤片 .3,切片的注意事項(xiàng) 凡是陳舊,腐敗或干枯的組織不易制好切片. 固定失時(shí)或固定不當(dāng)?shù)慕M織 , 染色時(shí)常出現(xiàn)核質(zhì)著色較淺,輪廓不清,出現(xiàn)不等的片狀發(fā)白區(qū) . 組織脫水,透明和浸蠟過(guò)渡,會(huì)造成過(guò)硬,變脆,特別是動(dòng)物

30、組織應(yīng)嚴(yán)格控制. 切片出現(xiàn)橫皺紋常多見(jiàn)于組織固定不牢,或切片刀固定不緊. 切片刀不鋒利,切片時(shí)會(huì)自行卷起或皺起,更不能順利地將切片聯(lián)結(jié)成蠟帶.切片刀如有 TOC o 1-5 h z 缺口存在,更易造成切片斷裂,破碎 ,不完整等現(xiàn)象. 組織切片機(jī)各個(gè)零件和螺絲應(yīng)旋緊 ,否則將會(huì)產(chǎn)生震動(dòng),以致切片厚薄不均.二,冰凍切片法冰凍切片在組織學(xué)技術(shù)中應(yīng)用范圍較廣 ,對(duì)病理學(xué)中的臨床手術(shù)的快速診斷其意義更大.冰凍切片多用于新鮮組織,甲醛固定組織和冰箱冷藏組織等.組織塊不經(jīng)任何包埋劑而直接放在制冷臺(tái)上冷卻后再進(jìn)行切片 .三,快速石蠟切片_切片脫蠟?zāi)康囊?徹底脫去切片組織中的石臘,才能使組織細(xì)胞著色,否則成云

31、霧狀,會(huì)防礙染色細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊不清，無(wú)法診斷，脫蠟均用二甲苯冬天需加溫脫蠟10左右，然后浸入95%至70%AC去二甲苯丙水洗,使切片清亮 .總結(jié)組織制片過(guò)程收集標(biāo)本（活檢尸檢，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)一取材固定切塊（1 X 1X0.3肆來(lái)水沖洗（12h）一組織脫水 （75%A乙醇,85%乙醇,95%乙醇I ,95%乙醇H ,100%乙醇I ,100%乙醇H ,低溶度乙醇2 4h, 高濃度乙醇1h）一組織透明（二甲苯30）-蠟（軟,硬蠟,大組織416h）,組織24h,埋 一冷卻修蠟塊一焊蠟塊一切片一貼片一烤片一切片脫蠟一切片染色（常規(guī)HF和特染）.第四章染色一,染色的目的任何冰凍切片 ,石蠟切片等如果不經(jīng)過(guò)染色,

32、在顯微鏡下只能看到細(xì)胞及其它組織成分的輪廓 ,即使由于組織內(nèi)部各種物質(zhì)的折射指數(shù)不同,從光線的明暗上能觀察到一些組織結(jié) TOC o 1-5 h z 構(gòu) ,但也是極其簡(jiǎn)單有限的.遠(yuǎn)不能滿足觀察和借以診斷的目的.染色的目的 ,是將染料配制成溶液,將組織切片浸入染色劑內(nèi) ,經(jīng)過(guò)一定的時(shí)間 ,使組織或細(xì)胞及其他異常的成分被染上不同深淺的顏色,產(chǎn)生不同的折射率,便于在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察 .因此,染色在組織形態(tài)學(xué),特別是病理形態(tài)診斷,科研和教學(xué)工作中,都具有非常重要的意義和實(shí)用價(jià)值.二,_ 染色的原理染色就是染色劑和組織細(xì)胞相結(jié)合的過(guò)程.有關(guān)兩者結(jié)合的原理,不同學(xué)說(shuō) ,尚未完全清楚,而只一般基本認(rèn)為過(guò)程

33、是化學(xué)反應(yīng)和物理現(xiàn)象.一染色的化學(xué)反應(yīng)在組織細(xì)胞內(nèi) ,一般有酸性和堿性區(qū)別 ,酸性物質(zhì)部分能與溶液中的陽(yáng)離子結(jié)合,堿性物質(zhì)部分能與溶液中的陰離子結(jié)合.在細(xì)胞核中 ,特別是核內(nèi)染色質(zhì),一般有酸性物質(zhì)組成 （其中主要有核酸）,故與堿性染料的親和力很強(qiáng) ,易于染色 ,以氧化蘇木素微代表的堿性染料中有染色作用的是陽(yáng)離子.在細(xì)胞漿中則由堿性物質(zhì)組成,所以胞漿與酸性染料有較強(qiáng)的親和 TOC o 1-5 h z 力 ,以伊紅染料為代表的酸性染料中有染色作用的是陰離子.二染色的物理作用毛細(xì)作用及滲透作用 組織有許多小孔 ,染料由滲透作用 進(jìn)入組織,它與組織沒(méi)有牢固的結(jié)合 ,所以是單純的物理作用 ,不能稱(chēng)為直接

34、染色作用.因所謂染色必需是染料留貯于組織內(nèi)與組織有較穩(wěn)固的結(jié)合.吸收或溶液作用 組織吸收染料,作牢固的結(jié)合,組織的著色與溶液顏色相同,但不是和干燥染料的顏色相同 .如復(fù)紅溶液為紅色,所染組織也為紅色,而干燥的復(fù)紅帶綠色.吸附作用 吸附作用是固體物理的特性,它能從周?chē)芤褐形∫恍┘?xì)小的物質(zhì)微粒,這些微?？赡苁侨苡谌芤褐械幕衔?,也可能是只在溶液中單獨(dú)存在的離子,如染液中分散的色素粒子進(jìn)入被染物質(zhì)的間隙內(nèi) ,由于分子的引力作用 ,色素粒子被吸附而染色.三,染色術(shù)語(yǔ)的概念(1)普通染色在組織制片技術(shù)中 ,常規(guī)制片最廣泛應(yīng)用的是蘇木精和伊紅染色,又稱(chēng)為常規(guī)染色 (HE 染色 ).(2)特殊染色特殊

35、染色就是為了顯示特定的組織結(jié)構(gòu)或其他的特殊成分,是常規(guī)染色的必 TOC o 1-5 h z 要補(bǔ)充,也是染色技術(shù)中不可缺少的部分.它在病理診斷中起到輔助作用.(3)單一染色選用一種染料進(jìn)行的染色,如用鐵蘇木素染睪丸生精細(xì)胞等.(4)復(fù)染色用兩種不同性質(zhì)的染料進(jìn)行染色的方法,如用蘇木素和伊紅分別使細(xì)胞核及胞質(zhì)染成兩種顏色.(5)多種染色 選用兩種以上的染料的染色，如Mosson三色染色法(6)進(jìn)行性,退行性染色進(jìn)行性染色又稱(chēng)漸進(jìn)性染色,將組織成分著色自淺至深,當(dāng)達(dá)到所需要的強(qiáng)度時(shí),終止染色 .此種方法稱(chēng)為進(jìn)行性染色.一般所采用的染液溶度較低,染色過(guò)程中應(yīng)該不時(shí)在鏡下觀察進(jìn)行控制 ,這樣才能得到染

36、色強(qiáng)度適中的效果.退行性染色又稱(chēng)退性染色,先將組織濃染過(guò)度,使其超過(guò)所需的程度,然后再用某些溶液脫去多余的染色劑 ,以達(dá)到適當(dāng)?shù)纳疃?并使不應(yīng)著色的組織 ,細(xì)胞的某些成分脫去色度,這個(gè)步驟稱(chēng)為分化.而最終使應(yīng)該著色部分達(dá)到適宜程度.如常規(guī) HE 染色中的蘇木素染核與鹽酸水分化過(guò)程就是退行性染色.四 ,染色與分化劑在退行性染色中,需用某些特定的溶液把附著在組織細(xì)胞上多余的染色劑脫去,從而使目的物與周?chē)M織形成鮮明的對(duì)比,同時(shí)使目的物本身的色澤也深淺適當(dāng).這種選擇地除去多余染色劑的過(guò)程,稱(chēng)為分化,所使用的溶液即為分化劑.分化劑分為三類(lèi). 酸性分化劑 如鹽酸 ,醋酸等,它們能和媒染劑(金屬)相結(jié)合形

37、成可溶性鹽類(lèi),從而打開(kāi)了媒染劑和組織細(xì)胞的結(jié)合,使組織細(xì)胞脫色. 化分化劑 如苦味酸,鉻酸,重鉻酸鉀和過(guò)錳酸鉀等,屬于氧化劑.在染色中經(jīng)過(guò)氧化作用后 ,使染色劑與組織的某種成分的結(jié)合更牢固. 染分化劑 媒染劑能促使組織細(xì)胞和染色劑相結(jié)合.但是將已經(jīng)過(guò)染色的切片再放到媒染劑的溶液中 ,又可使已經(jīng)和組織相結(jié)合的染色劑脫失,這就是媒染劑的另一種功能,稱(chēng)之為媒染分化劑 .五,染色中的注意事項(xiàng) 較多的組織切片染色,是經(jīng)過(guò)固定,脫水 ,透明,包埋,切片 ,脫蠟等步驟以后 ,再進(jìn)行染色;有的是直接冰凍切片后即可染色,這些都是根據(jù)不同的目的要求而進(jìn)行的染色. 染色準(zhǔn)備工作和染色實(shí)驗(yàn)室的設(shè)置,都是做好染色工作的

38、必要條件.各種器皿的清洗要嚴(yán)格,按染色方法中的細(xì)節(jié)去做.染色試劑的配制時(shí)間長(zhǎng)短和存放,一定要按化學(xué)性質(zhì)與組織的著色能力進(jìn)行正確掌握使用 .實(shí)驗(yàn)室常規(guī)設(shè)置要合理,有條件時(shí) ,可應(yīng)有通風(fēng)設(shè)備.實(shí)驗(yàn)臺(tái)和實(shí)驗(yàn)柜,各種器皿和染色所需物品必須齊全,具有一定的條理性,是開(kāi)展染色工作和提 TOC o 1-5 h z 高質(zhì)量的必要條件. 在染色過(guò)程中 ,即要按照書(shū)本的方法去進(jìn)行操作,又要根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行靈活運(yùn)用 .在實(shí)踐中 ,不斷地總結(jié)經(jīng)驗(yàn)和教訓(xùn),才能熟練掌握染色方法和提高實(shí)際工作能力. 由于染色方法較多 ,掌握染色種類(lèi)應(yīng)多一些 ,對(duì)不同的組織選用針對(duì)性較強(qiáng)的方法進(jìn)行染色 ,才能提高染色質(zhì)量.六,染色中的基本原

39、則一,染色前的處理一 脫蠟至水 凡是石蠟切片必須經(jīng)過(guò)二甲苯脫蠟,各級(jí)乙醇至水洗的過(guò)程.（切片脫蠟,二甲苯I,II各510 95溫醇I II各5 f75%JI 5 V 來(lái)洗水沖）二甲苯和各級(jí)乙醇必須保持一定純度,不能混入其他雜質(zhì)成分,而使染色受到影響.二 除去汞鹽沉淀物 對(duì)于用升汞固定或含有升汞混合固定液的切片 , 切片脫臘后需脫汞（浸入5%碘酒精10）,脫碘（5%硫代硫酸鈉）一流水洗一染色.三 脫甲醛色素 甲醛固定組織時(shí)間較長(zhǎng)及溫度較高情況下 ,甲醛易氧化自行分解產(chǎn)生甲酸導(dǎo)致組織成酸性,此時(shí)可能有甲醛色素產(chǎn)生.此種色素?zé)o光澤,不溶于水,乙醇 ,二甲苯等.對(duì)于這種色素可用下列方法除去.1濃氨水1

40、 ml,75%乙醇200 ml.切片脫蠟后置溶液中30或較久一流水洗一染色.2 1%氫氧化鉀1 ml,80%乙醇100 ml.切片脫蠟后置溶液中10 蕊水洗5 -80%醇5 一蒸儲(chǔ)水洗一染色.四 除鉻沉著物 有些組織用含鉻的 Zenker 氏液等固定,致有鉻沉淀物.可應(yīng)用鹽酸乙醇溶液 ,或用5%碘酒和5%硫代硫酸鈉水溶液處理.二,染色后的處理一染色后的脫水 對(duì)于大多數(shù)的切片，染色后必需要經(jīng)過(guò)脫水.95%乙醇I , II各5 -100% 乙醇I J各5 .二 染色后的透明 組織經(jīng)過(guò)脫水核透明后會(huì)產(chǎn)生一定的折射率,為防止空氣中的有色素的細(xì)小顆粒沉淀在組織中的不良影響，需加透明處理以使組織切片清晰.

41、二甲苯1,11各5 透 明.三,_ 染色封固劑組織制片需隨時(shí)檢查和保存,故要有蓋玻片封固 .通常用中性樹(shù)膠,此封固劑質(zhì)量已普遍應(yīng)用.第五章蘇木素 ,伊紅染色的應(yīng)用及其配制,蘇木素染色的應(yīng)用（1）HE 染色在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的組織學(xué),生物學(xué),病理學(xué)及其細(xì)胞檢查中,是必不可少的最基本染色方法 .（2）在病理診斷（活檢 ）,教學(xué) ,科研工作中都被廣泛應(yīng)用,對(duì)細(xì)胞學(xué)的觀察也具有重要價(jià)值.（3）HE 染色主要顯示各種組織正常成份和病變的一般形態(tài)結(jié)構(gòu) ,病理組織學(xué)的基本知識(shí)大部分都是從觀察HE 染色切片中獲得的 .二,HE染液的配制.蘇木素染液蘇木素又稱(chēng)蘇木精,為植物染料,是從蘇木樹(shù)樹(shù)心提煉出來(lái)的天然染料（淡黃

42、褐色粉末）,易溶于酒精 ,甘油 ,加熱可溶于水.蘇木素本身沒(méi)有染色能力,配制時(shí)必須加入含金屬的媒染劑（鉀明礬 ）,才能達(dá)到染色之目的,配制后還需經(jīng)過(guò)氧化成熟產(chǎn)生蘇木紅才能進(jìn)行染色（有自然氧化成熟和人工氧化成熟）.配制法有下列幾種哈瑞氏（harris）蘇木素染液最常應(yīng)用染色時(shí)間為5 10配制蒸餾水 1000ml TOC o 1-5 h z 蘇木素35g碘酸鈉1g鉀明礬5080g水醋酸20ml其優(yōu)點(diǎn)是 : 配后即可應(yīng)用染色力較強(qiáng) .其缺點(diǎn)是 : 極易產(chǎn)生金屬膜沉淀.（2）埃利希（Ehrlich）,蘇木素染液配制無(wú)水乙醇 100ml TOC o 1-5 h z 甘油100ml蘇木精2g鉀明礬2 3g

43、醋酸5 10ml置于陽(yáng)光下自然氧化 3 個(gè)月左右成熟.其優(yōu)點(diǎn)是 : 染色結(jié)果甚佳,貯存愈久染色愈強(qiáng),而且不需分色.2.伊紅染液蘇木素染色后,需用伊紅染料作對(duì)比染色,伊紅著色深淺不一,如膠元纖維粉紅色,肌纖維深紅色 ,紅血球橙色.這樣細(xì)胞核,細(xì)胞槳著色清晰,鮮明 ,便于鑒別.伊紅常用配制有兩種1）0.5%-1%水溶性伊紅乙醇液 伊紅y 0.5-1g+95%乙醇25ml+蒸儲(chǔ)水75ml+醋酸1一2滴.2）伊紅B 0.5g+80%乙酉I 100ml溶解后用石蠟切片染色程序 切片脫蠟,二甲苯I , II各510f無(wú)水乙醇5-95雙醇I II各5 f75%乙醇5f自來(lái) 洗5水沖一10-蒸儲(chǔ)水洗一染細(xì)胞核

44、（蘇木素）35-自來(lái)水洗一分化（0.5%鹽酸水）一流 水沖307返蘭染細(xì)胞漿（伊紅）1295%乙醇I ,11100%乙醇I , II一二甲苯透明 一封片（中性樹(shù)膠）一貼號(hào).第六章特殊染色一,特殊染色的概念及意義 TOC o 1-5 h z 特殊染色為常規(guī)染色(即蘇木素,伊紅 )的必要補(bǔ)充,又稱(chēng)選擇性染色,只有相對(duì)的特異性,如PAS 陰性反應(yīng)它有糖元.意義 :(1)特染能顯示在常規(guī)染色切片中不明顯的部分,如革蘭氏染色,細(xì)菌染色.(2) 區(qū)別 HE 染色中不能鑒別的組織病變,如 VG 染色區(qū)別膠元纖維和平滑肌.(3)顯示某些常規(guī)染色中不能著色的物質(zhì),如網(wǎng)染才能顯示網(wǎng)狀纖維,常規(guī)HE 染色是染不出來(lái)

45、的 .因此 ,特殊染色也是制片染色中不可缺少的組成部分,它在病理診斷常著輔助作用,也為科研提供依據(jù).二,學(xué)習(xí)特染技術(shù)應(yīng)掌握的重點(diǎn)(注意事項(xiàng) )(1)染色方法的成敗,應(yīng)該在溫度,濃度 ,時(shí)間和PH 值等方面找原因 .(2)注意特染的應(yīng)用范圍,如某種病變應(yīng)用什么方法染色才能達(dá)到目的,一般先在HE 切片所 TOC o 1-5 h z 見(jiàn)的要求去選擇適當(dāng)?shù)奶厝痉椒?一種或多種.(3)必須掌握各種特殊染色的結(jié)果,避免導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)論或嚴(yán)重的誤診,如在網(wǎng)染時(shí)把膠元纖維誤以為網(wǎng)狀纖維.(4)盡量要陽(yáng)性切片作對(duì)照,便于選擇特染方法,并與 HE 切片作對(duì)照 .(5)特染的組織,在其固定,脫水根據(jù)要求選擇.所用的器

46、皿都必須化學(xué)清洗.三,玻璃器皿的清潔在病理實(shí)驗(yàn)室可用的玻璃器皿,都必須經(jīng)過(guò)清洗干凈才能使用,清洗的方法依玻璃器皿的新舊而不同 .1,新購(gòu)玻璃器皿的處理對(duì)于新購(gòu)買(mǎi)的玻璃器皿應(yīng)先用洗衣粉浸泡洗刷,自來(lái)水沖洗后再用1 2%鹽酸水溶液浸泡數(shù)小時(shí)后,用自來(lái)水沖洗干凈,必要時(shí)可用少量蒸餾水洗2 次.2,使用后玻璃器皿的處理每次使用后的玻璃器皿都必須及時(shí)徹底清洗干凈,以供下次實(shí)驗(yàn)之用,如輕視這一步驟,可用的玻璃器皿不夠干凈,則會(huì)影響染色效果 ,甚至導(dǎo)致染色失敗,特別在酶組化和銀離子反應(yīng)操作過(guò)程中更有嚴(yán)格的要求,使用后的玻璃器皿在一般清洗后 ,還要求用硫酸清洗液浸泡.硫酸清洗液配制重鉻酸鉀 80g自來(lái)水100

47、0ml濃硫酸（工業(yè)用） 120m新配制的清潔液為紅褐色,反復(fù)使用一段時(shí)間后,慢慢變成綠色,說(shuō)明清潔液已失敗,不能繼續(xù)使用應(yīng)重新配制 .3,玻璃器皿的清洗方法任何玻璃器皿都必須用自來(lái)水沖洗,然后把殘余藥液或染液洗去 . TOC o 1-5 h z 用毛刷沾洗衣粉擦干凈.自來(lái)水沖洗,蒸餾水洗2 次 .把晾干的器皿輕輕置入清潔液浸泡數(shù)日 .取出器皿,用自來(lái)水把器皿內(nèi)外徹底沖洗干凈,最后用蒸餾水洗2 次.把玻璃器皿倒置于有孔架上自然晾干或溫箱中烤干,最后存放櫥內(nèi)備用.四 ,常用的特染一,膠元纖維染色（V G 染色 ）一 膠元纖維的分部組成成分膠原纖維是結(jié)締組織中的三種纖維之一,分布最為廣泛,含量最多

48、.主要分布于真皮,腱 ,韌帶,骨,透明軟骨,動(dòng)脈 ,腸壁,子宮和基底膜等.膠原纖維具有韌性大,抗拉力強(qiáng)的特點(diǎn) .膠原纖維 TOC o 1-5 h z 單位主要由纖維母細(xì)胞合成.二 膠元纖維染色應(yīng)用膠原纖維染色在病理診斷上主要用于鑒定梭形,纖維形細(xì)胞腫瘤的組織來(lái)源;常常要在纖維,平滑肌和神經(jīng)三者之中作出選擇.還能使用于其他的情況下,如觀察動(dòng)脈硬化的心臟,在H E切片中，心肌內(nèi)散在的小疤痕灶和心肌均被染作紅色，而作膠原纖維染色可將膠原組織和上肌明顯地區(qū)分開(kāi)來(lái).早期肝硬化用膠原纖維染色,也可使小葉之間少量增生的膠原纖維突出地顯示出來(lái).苦味酸 酸性品紅法1. VG 染液試劑配制1%酸性品紅10ml苦味

49、酸飽和液. 90ml此液常分別配制臨用時(shí)加以混合,不能久用.【染色步驟】(1)組織固定于10%早醛液中,常規(guī)脫水包埋.(2)組織切片脫臘至水 .(3)V G 染液 2 5(酸性品紅1:苦味酸飽和液4-6)(4)傾去染液 ,無(wú)水酒精急速脫水,用濾紙吸干.(5)二甲苯透明 ,中性樹(shù)膠封片 .【結(jié)果】膠元纖維呈紅色,肌纖維 ,胞質(zhì)及 紅細(xì)胞黃色.二 , 網(wǎng)狀纖維染色一網(wǎng)狀纖維染色的形態(tài)特點(diǎn)和染色原理網(wǎng)狀纖維是網(wǎng)狀結(jié)締組織內(nèi)的一種纖維.它由網(wǎng)狀細(xì)胞可產(chǎn)生,網(wǎng)狀細(xì)胞是星狀多突的細(xì)胞,核大 ,著色較淺 ,核仁明顯,胞質(zhì)較豐實(shí),胞突彼此連接形成細(xì)胞網(wǎng)架. 網(wǎng)狀纖維細(xì)而有分支，穿行于細(xì)胞體和突之間，共同構(gòu)成網(wǎng)

50、狀支架.這種纖維用H 染色一般不易辨認(rèn).若用銀氨溶液浸染能使纖維變成黑色,故又稱(chēng)嗜銀纖維 .網(wǎng)狀纖維的應(yīng)用比較廣泛,用來(lái)判定病變組織支架的破壞情況,組織 ,臟器網(wǎng)狀支架的存在 TOC o 1-5 h z 與塌陷 ,完整與破壞,網(wǎng)狀纖維的分布及走行,有多少,粗細(xì),疏密或有無(wú)斷裂形態(tài)變化.網(wǎng)狀纖維染色的原理網(wǎng)狀纖維的染色方法很多 ,但是染色原理基本相同 ,有以下方面.(1)氧化氧化的作用是使網(wǎng)狀纖維具有選擇性 ,不經(jīng)氧化的切片 ,網(wǎng)狀纖維均不能較好地顯示出來(lái) ,常用的氧化劑是高錳酸鉀 .(2)漂白一般采用2%草酸,使漂白后無(wú)色.(3)媒染作媒染時(shí)多用2%硫酸鐵氨(俗稱(chēng)鐵明礬).這些試劑可增加網(wǎng)狀纖

51、維對(duì)銀氨液的選擇性 .(4)浸銀也稱(chēng)鍍銀,且不同的銀氨液浸染切片,使銀氨配位化合物與網(wǎng)狀纖維結(jié)合,即帶正電荷的二氨合銀Ag(NHs)+2 被具有嗜銀性物質(zhì)的網(wǎng)狀纖維吸附,時(shí)間從數(shù)稱(chēng)鐘到數(shù)分鐘.(5)還原甲醛液是還原劑,能把與網(wǎng)狀纖維結(jié)合的銀氨配位化合物網(wǎng)狀纖維還原成棕黑色的金屬銀 .二 網(wǎng)狀纖維染色的應(yīng)用 用于顯示和鑒別腫瘤的性質(zhì)和來(lái)源1)顯示和區(qū)分癌與肉瘤來(lái)源于上皮組織的惡性腫瘤(癌 )僅癌巢周?chē)芯W(wǎng)狀纖維包繞,巢內(nèi)癌細(xì)胞之間則沒(méi)有網(wǎng)狀纖維分部 .來(lái)源于間葉組織的惡性腫瘤( 肉瘤),瘤細(xì)胞之間往往可見(jiàn)較多的網(wǎng)狀纖存在.2) 顯示和區(qū)分血管內(nèi)皮瘤與血管外皮瘤惡性血管內(nèi)皮瘤的瘤細(xì)胞主要在嗜銀纖維

52、鞘結(jié)構(gòu)以內(nèi) ,單個(gè)細(xì)胞則嗜銀纖維包繞;惡性血管內(nèi)皮瘤的瘤細(xì)胞均位于小血管之間網(wǎng)狀纖維鞘之外,并有豐富的網(wǎng)狀纖維自小血管壁向外呈放射狀包繞癌細(xì)胞.3)用以鑒別淋巴細(xì)胞肉瘤與網(wǎng)狀細(xì)胞肉瘤等在淋巴細(xì)胞肉瘤中產(chǎn)生的網(wǎng)狀纖維比在正常淋巴結(jié)內(nèi)的網(wǎng)狀纖維鞘為減少 ,網(wǎng)狀纖維在瘤細(xì)胞間自由行走;而網(wǎng)狀細(xì)胞肉瘤的網(wǎng)狀細(xì)胞中會(huì)產(chǎn)生較多的網(wǎng)狀纖維,與網(wǎng)狀細(xì)胞緊密粘連,分布于每個(gè)細(xì)胞之間 . 用于某些腫瘤的診斷根據(jù)染色所顯示的網(wǎng)狀纖維多少,分布及行走特點(diǎn) , 可用于診斷下列腫瘤 .1) 平滑肌肉 細(xì)胞之間見(jiàn)有大量平行分布的網(wǎng)狀纖維.2)纖維肉瘤 可見(jiàn)大量網(wǎng)狀纖維存在,并且密集包繞細(xì)胞.3)滑膜肉瘤 其梭形細(xì)胞也產(chǎn)生網(wǎng)

53、狀纖維,但不如纖維肉瘤多 . 用于觀察和研究癌組織的發(fā)生,發(fā)展及其惡性程度癌組織發(fā)生 ,發(fā)展過(guò)程以及癌組織生長(zhǎng)速度 ,可通過(guò)網(wǎng)染進(jìn)行觀察和研究,如癌巢周?chē)木W(wǎng)狀纖維包囊完整,說(shuō)明癌組織生長(zhǎng)較慢 ,惡性程度低;再如子宮頸鱗狀細(xì)胞癌巢周?chē)W(wǎng)狀纖維分解,說(shuō)明癌組織正在擴(kuò)散,其惡性程度較高. 顯示與觀察基底膜的變化 上皮樣間葉細(xì)胞,間皮或滑膜等,可形成細(xì)胞巢也可產(chǎn)生少量網(wǎng)狀纖維,壓迫周?chē)W(wǎng)狀纖維,但為斷斷續(xù)續(xù)的絕不連成一線,不形成基底膜.顯示與觀察基底膜的存在與否 ,不但能更有效地判斷其上皮來(lái)源,而且有助于區(qū)分不同來(lái)源的上皮腫瘤.如甲狀腺髓樣癌系假濾泡,無(wú)基底膜 ;濾泡癌或正常濾泡有基底膜. 用于壞死

54、組織的結(jié)構(gòu)及類(lèi)型凝固性壞死用 HE 染色往往為一片紅色的無(wú)定形物質(zhì),識(shí)別不出網(wǎng)狀纖維支架的形態(tài)用顯示網(wǎng)狀纖維的特殊染色方法,可觀察到早期凝固性壞死處的網(wǎng)狀纖維支架還保留其特點(diǎn).肺結(jié)核干酪樣壞死結(jié)核用網(wǎng)狀纖維染色后,可以弄清其病變的起源與發(fā)展,并可區(qū)分結(jié)核球的類(lèi)型,即 肺炎型 , 肉芽腫型 , 阻塞空洞型.肺炎型的壞死組織中尚存在肺泡狀排列的網(wǎng)狀纖維; 肉芽腫型為大量雜亂排列的網(wǎng)狀纖維;阻塞空洞型的內(nèi)容物則看不到網(wǎng)狀纖維. 用于顯示和研究肝組織病變 用網(wǎng)狀纖維的染色法,觀察肝臟病變處的網(wǎng)狀支架形態(tài),分布特點(diǎn)及其破壞情況,可以判定和研究其病變性質(zhì),程度及其發(fā)展與轉(zhuǎn)規(guī).三 網(wǎng)狀纖維染色的注意事項(xiàng)用新

55、蒸餾水配制最好用雙蒸水配制 .(2)所用玻璃器材及載玻片均要達(dá)到化學(xué)潔凈程度,必要時(shí)用粘合劑粘連切片,防止脫片現(xiàn)象.(3)對(duì)乙配制好的硝酸銀液和氨銀溶液,要貯存冰箱中保存待用 . TOC o 1-5 h z (4)在染色過(guò)程中 ,用染氨銀染液或硝酸銀液的前后應(yīng)用蒸餾水洗浸.(5)氯化金調(diào)色和硫代硫酸鈉固定的時(shí)間不應(yīng)太長(zhǎng),否則會(huì)引起網(wǎng)狀纖維染色變淡.(6)根據(jù)診斷需要,可進(jìn)行胞核染色和其其他套色纖維增染,使色彩更為艷麗,清晰 .(7)切片脫水后及時(shí)封片,不宜在空氣中停留時(shí)間過(guò)長(zhǎng),以免產(chǎn)生色素顆粒.【 氨銀液的配制】取 10%硝酸銀水溶液5ml 于三角燒瓶?jī)?nèi),一滴一滴地滴加氨水(氫氧化銨),并同時(shí)搖動(dòng)容器,硝酸銀遇到氨水立即產(chǎn)生沉淀,當(dāng)其沉淀物被溶解時(shí)(不能完全溶解也可),再加入3%氫氧化鈉水溶液5mL溶液重新產(chǎn)生沉淀，此時(shí)再滴加氨水.至其沉淀被溶