何首烏對缺氧培養(yǎng)心肌細(xì)胞保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究

1、何首烏對缺氧培養(yǎng)心肌細(xì)胞保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究【關(guān)鍵詞】何首烏；,培養(yǎng)心肌細(xì)胞；,缺氧；,超氧化物岐化酶；,丙二醛；,組織化學(xué)摘要：目的觀察何首烏對培養(yǎng)心肌細(xì)胞缺氧性損傷的影響。方法將istar系大鼠乳鼠心肌細(xì)胞原代單層培養(yǎng)5d，建立“缺氧損傷模型，通過生化檢測及組織化學(xué)等方法，研究何首烏對缺氧培養(yǎng)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組及對照組心肌細(xì)胞PAS反響和琥珀酸脫氫酶(SDH)活性明顯增強(qiáng)而酸性磷酸酶AP活性減弱；實(shí)驗(yàn)組及對照組超氧化物歧化酶SD活性較模型對照組增強(qiáng)而丙二醛DA含量明顯降低P0.01。結(jié)論何首烏對缺氧心肌細(xì)胞具有良好的保護(hù)作用。關(guān)鍵詞：何首烏；培養(yǎng)心肌細(xì)胞；缺氧；超氧化物岐化酶；丙

2、二醛；組織化學(xué)ExperientalStudynthePrtetiveEffetsfFleeeflerRtttheAnxiulturedardiausleellsAbstrat：bjetiveTinvestigatetheprtetiveeffetsandehanisfFleeeflerRtttheulturedanxidanifiatinardiausleells.ethdsTheardiausleellsfistarsuklingratsereulturedfr5days,andasananxisetupinjureddeltinvestigatetheprtetiveeffetsfFle

3、eeflerRtntheulturedanxidanifiatinardiausleellsbyeansfbiheialtesting,histheistryandsn.ResultsInthenralgrup,PASreatinfardiausleellsandtheativityfSDHinreasedhiletheativityfAPdereased;paredtthenralgrup,theativityfSDasstrngintheellsfthedelntrlgrupandthententfDAinreasedsignifiantly(P0.01).nlusinTheresults

4、prvethatFleeeflerRtpssessesverygdprtetiveandanti-xidatineffetsttheanxiardiaell.Keyrds：FleeeflerRt；ulturedardiausleell；Anxia；SD；DA；Histheistry何首烏又稱首烏、赤首烏，是蓼科植物何首烏PlygnuultiflruThunb.的枯燥塊根，其化學(xué)成分主要有卵磷脂、羥基蒽醌類化合物主要為大黃素、大黃酚、大黃酸等葡萄糖苷、二苯乙烯苷類及微量元素鈣、鐵、鋅、錳、銅等1。何首烏具有補(bǔ)肝、益腎、養(yǎng)血、祛風(fēng)的作用，主治肝腎陰虧、發(fā)須早白、血虛頭暈、腰膝軟弱、筋骨酸痛、遺精崩

5、帶、久瘧、久立慢性肝炎、痛腫等病癥2。何首烏對在體缺血再灌注心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用3，但其對體外缺氧培養(yǎng)心肌細(xì)胞等方面的研究，國內(nèi)外尚未見報道。本實(shí)驗(yàn)利用培養(yǎng)心肌細(xì)胞模擬心肌缺血再灌注損傷模型，應(yīng)用生化檢測及組織化學(xué)等研究方法，討論了何首烏對培養(yǎng)心肌細(xì)胞缺氧性損傷的保護(hù)作用及其作用機(jī)理，為何首烏的臨床應(yīng)用提供理論根據(jù)。1材料與方法1.1動物istar系大鼠乳鼠，35d齡，50只，由延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物科提供。1.2藥品取何首烏塊根1000g，加蒸餾水2000l浸泡1h。100煮沸2h，過濾。再加蒸餾水2000l煮沸1h，過濾。將兩次過濾液在80水浴下濃縮成浸膏，在70溫箱中烘干、粉碎，備用。1

6、.3試劑人參總皂苷由延邊大學(xué)天然植物制品研究所提供；RPIediu1640培養(yǎng)基為GIB公司產(chǎn)品；胰蛋白酶為DIF公司產(chǎn)品；新生滅活小牛血清為北京華美生物工程公司產(chǎn)品；超氧化物歧化酶SD試劑盒和丙二醛DA試劑盒為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。1.4儀器超凈工作臺為上海凈化設(shè)備廠產(chǎn)品；USA二氧化碳培養(yǎng)箱；日本LYPUS倒置相差顯微鏡；德國ZK15型超低溫離心機(jī)；芬蘭K3型酶標(biāo)儀；SS200型超聲波粉碎機(jī)為山東濟(jì)寧無線電儀器廠產(chǎn)品。1.5方法1.5.1心肌細(xì)胞的原代單層培養(yǎng)心肌細(xì)胞的培養(yǎng)采用姜玉順等4建立的原代單層培養(yǎng)方法。1.5.2培養(yǎng)心肌細(xì)胞缺氧損傷模型的制備將生長良好的培養(yǎng)心肌細(xì)胞的培養(yǎng)基倒

7、掉，以預(yù)先飽和純氮?dú)?9.99%40in的N2飽和缺氧培養(yǎng)基沖洗2次，取N2飽和缺氧培養(yǎng)基3l參加培養(yǎng)瓶中，同時向瓶內(nèi)充氮?dú)?0s以置換瓶內(nèi)空氣，置于37二氧化碳培養(yǎng)箱中，12h后備用。1.5.3分組及處理取生長良好的培養(yǎng)瓶36瓶隨機(jī)分為4組：正常組、模型組、對照組及實(shí)驗(yàn)組。正常組更換正常培養(yǎng)基培養(yǎng)；模型組更換N2飽和缺氧培養(yǎng)基培養(yǎng)；對照組為N2飽和缺氧培養(yǎng)基加0.5g/l人參皂苷共培養(yǎng)；實(shí)驗(yàn)組為N2飽和缺氧培養(yǎng)基加5g/l何首烏提取物共培養(yǎng)。將各組均置于37二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12h。1.5.4生化檢測實(shí)驗(yàn)各組各取6瓶測定SD活性和DA含量。采用黃嘌呤氧化酶法測定SD活性，采用TBA法測定D

8、A含量，SD活性和DA含量的測定嚴(yán)格按照試劑盒操作程序進(jìn)展。1.5.5組織化學(xué)觀察實(shí)驗(yàn)各組各取3瓶做組織化學(xué)染色。取出各組培養(yǎng)瓶內(nèi)的生長細(xì)胞蓋玻片，進(jìn)展PAS反響顯示糖原，用酶組織化學(xué)方法顯示SDH及AP。經(jīng)上述染色后用LYPUS萬能顯微鏡觀察并拍片分析。1.5.6數(shù)據(jù)處理各組數(shù)據(jù)均采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進(jìn)展方差分析。2結(jié)果2.1生化檢測結(jié)果2.1.1何首烏對缺氧培養(yǎng)心肌細(xì)胞SD活性的影響實(shí)驗(yàn)組及對照組心肌細(xì)胞SD活性明顯高于模型組P0.01，說明何首烏能有效進(jìn)步心肌細(xì)胞SD活性，以去除超氧陰離子自由基保護(hù)培養(yǎng)心肌細(xì)胞免受缺氧損傷。結(jié)果見表1。表1何首烏對缺氧培養(yǎng)心肌細(xì)胞SD活性的影響略

9、*與模型組相比擬,P0.012.1.2何首烏對缺氧培養(yǎng)心肌細(xì)胞DA含量的影響模型組心肌細(xì)胞DA含量明顯高于正常組，實(shí)驗(yàn)組及對照組心肌細(xì)胞DA含量明顯低于模型對照組P0.01，說明缺氧可引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，損傷心肌細(xì)胞，但何首烏對心肌細(xì)胞受自由基攻擊有一定的防護(hù)作用。結(jié)果見表2。表2何首烏對缺氧培養(yǎng)心肌細(xì)胞DA含量的影響略*與模型組相比,P0.012.2組織化學(xué)觀察結(jié)果在倒置相差顯微鏡下觀察各組心肌細(xì)胞，正常組的心肌細(xì)胞數(shù)量多，細(xì)胞突起較長，互相交織成簇生長，可見規(guī)律或不規(guī)律性的有力搏動；模型組的心肌細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞突起細(xì)短，細(xì)胞散在分布，搏動次數(shù)明顯減少且微弱無力；實(shí)驗(yàn)組及對照組與模型組

10、相比心肌細(xì)胞數(shù)量明顯增多，細(xì)胞突起較粗長，仍可見成簇生長的心肌細(xì)胞團(tuán)，搏動次數(shù)明顯增多且有力，局部接近正常對照組程度。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.2.2.1何首烏對缺氧培養(yǎng)心肌細(xì)胞糖原含量的影響用PAS法顯示心肌細(xì)胞糖原，正常組心肌細(xì)胞PAS反響強(qiáng)，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)紫紅色的糖原顆粒含量豐富，分布較均勻，糖原顆粒界限較清楚，染色深圖1；模型組心肌細(xì)胞PAS反響明顯減弱，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)糖原含量明顯減少，糖原顆粒分布稀疏，甚至缺失，糖原顆粒界限不清，染色淺圖2；實(shí)驗(yàn)組及對照組心肌細(xì)胞PAS反響均比模型對照組明顯增強(qiáng)，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)糖原顆粒明顯增多，染色較深，但其糖原顆粒分布與正常組相比不是很均勻，界限也較模糊，而且實(shí)驗(yàn)組心肌

11、細(xì)胞比對照組心肌細(xì)胞PAS反響強(qiáng)些圖3。2.2.2何首烏對缺氧培養(yǎng)心肌細(xì)胞SDH活性的影響正常組心肌細(xì)胞SDH活性較強(qiáng)，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)藍(lán)紫色顆粒較多，染色較深圖4；模型組心肌細(xì)胞SDH活性明顯減弱，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)藍(lán)紫色顆粒明顯減少，分布稀疏，染色較淺圖5；實(shí)驗(yàn)組及對照組心肌細(xì)胞SDH活性與模型對照組相比明顯增強(qiáng)，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)藍(lán)紫色顆粒明顯增多，染色較深圖6。2.2.3何首烏對缺氧培養(yǎng)心肌細(xì)胞AP活性的影響正常組心肌細(xì)胞AP活性較弱，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)棕黃色顆粒較少，染色淺圖7；模型組心肌細(xì)胞AP活性明顯增強(qiáng)，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)棕黃色顆粒明顯增多，染色深圖8；實(shí)驗(yàn)組及對照組心肌細(xì)胞AP活性與模型組相比明顯減弱，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)棕黃色顆粒較

12、少，染色較淺圖9。圖1正常組PAS反響200略圖2模型組PAS反響200略圖3實(shí)驗(yàn)組PAS反響200略圖4正常組SDH活性200略圖5模型組SDH活性200略圖6實(shí)驗(yàn)組SDH活性200略圖7正常組AP活性200略圖8模型組AP活性200略圖9實(shí)驗(yàn)組AP活性200略3討論心肌細(xì)胞在缺氧條件下，會出現(xiàn)一系列的變化，包括形態(tài)學(xué)、活動功能、細(xì)胞代謝改變及胞漿酶自細(xì)胞內(nèi)漏出等5。尤其是自由基性質(zhì)活潑，具有極強(qiáng)的氧化反響才能，對人體有很大的危害性。自由基可引發(fā)多價不飽和脂肪酸過氧化而生成過氧化脂質(zhì)LP，其最終產(chǎn)生的丙二醛DA能使蛋白質(zhì)、核酸、脂類發(fā)生交聯(lián)，使生物膜發(fā)生變性，導(dǎo)致細(xì)胞構(gòu)造改變、功能破壞而引起

13、癌癥、衰老及心血管退變性疾病6。SD為直接去除自由基的酶，可阻斷自由基促使產(chǎn)生LP的鏈?zhǔn)椒错?，從而保護(hù)細(xì)胞不受自由基的損害。本實(shí)驗(yàn)生化檢測DA含量及SD活性結(jié)果：模型組心肌細(xì)胞DA含量明顯高于正常組，而SD活性明顯低于正常組，提示體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞在缺氧損傷下自由基增多，脂質(zhì)過氧化作用增強(qiáng)，而SD消耗過多，不能有效去除氧自由基，對抗脂質(zhì)過氧化作用。實(shí)驗(yàn)組心肌細(xì)胞SD活性明顯增高，與模型組相比P0.01；DA含量明顯減少，與模型組相比P0.01，說明何首烏可進(jìn)步心肌細(xì)胞SD的活性，去除自由基，并抑制脂質(zhì)過氧化作用，有研究說明何首烏中的二苯乙烯苷類成分具有較強(qiáng)的體外抗氧化才能和去除活性氧作用，是一種

14、較強(qiáng)的抗氧化劑7。提示何首烏可能是通過去除氧自由基及抗脂質(zhì)過氧化等作用處徑防止缺氧損傷對心肌細(xì)胞的損害。正常情況下，心肌主要靠有氧代謝供能，而缺氧后，能量主要由糖酵解供給，這樣有氧氧化被抑制，糖酵解增強(qiáng)，首先加快了肌糖原的酵解，心肌糖原含量顯著下降。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用PAS法顯示心肌細(xì)胞糖原，正常組心肌細(xì)胞PAS反響強(qiáng)，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)紫紅色的糖原顆粒含量豐富，分布較均勻，糖原顆粒界限較清楚，染色深；模型對照組心肌細(xì)胞PAS反響明顯減弱，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)糖原含量明顯減少，糖原顆粒分布稀疏，甚至缺失，糖原顆粒界限不清，染色淺；實(shí)驗(yàn)組及對照組心肌細(xì)胞PAS反響均比模型組明顯增強(qiáng)，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)糖原顆粒明顯增多，染色較深，但其糖

15、原顆粒分布與正常組相比不是很均勻，界限也較模糊，而且實(shí)驗(yàn)組心肌細(xì)胞比對照組心肌細(xì)胞PAS反響強(qiáng)些。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：何首烏能促進(jìn)糖原合成，抑制糖酵解，從而減少糖原分解，也能一定程度上糾正缺氧心肌細(xì)胞糖酵解過盛所致的細(xì)胞內(nèi)酸中毒。SDH主要存在于細(xì)胞線粒體的內(nèi)膜上，是細(xì)胞線粒體進(jìn)展有氧氧化的系列酶之一8。缺氧使有氧氧化受到抑制，線粒體的功能隨之減退，導(dǎo)致SDH活性降低。本實(shí)驗(yàn)正常組心肌細(xì)胞SDH活性較強(qiáng)，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)藍(lán)紫色顆粒較多，染色較深；模型組心肌細(xì)胞SDH活性明顯減弱，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)藍(lán)紫色顆粒明顯減少，分布稀疏，染色較淺；實(shí)驗(yàn)組及對照組心肌細(xì)胞SDH活性與模型組相比明顯增強(qiáng)，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)藍(lán)紫色顆粒明顯增多

16、，染色較深。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示何首烏可以改善缺氧心肌細(xì)胞的能量代謝，使心肌細(xì)胞處于功能活潑狀態(tài)。AP屬于細(xì)胞內(nèi)溶酶體標(biāo)志酶。本實(shí)驗(yàn)正常組心肌細(xì)胞AP活性較弱，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)棕黃色顆粒較少，染色淺；模型組心肌細(xì)胞AP活性明顯增強(qiáng)，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)棕黃色顆粒明顯增多，染色深；實(shí)驗(yàn)組及對照組心肌細(xì)胞AP活性與模型組相比明顯減弱，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)棕黃色顆粒較少，染色較淺。提示何首烏可以明顯改善溶酶體膜的穩(wěn)定性，保護(hù)心肌細(xì)胞的膜性構(gòu)造，穩(wěn)定細(xì)胞膜。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)研究說明何首烏能抑制心肌細(xì)胞超氧自由基的生成，進(jìn)步去除自由基的才能，減緩心肌細(xì)胞受自由基的攻擊，防止了脂質(zhì)過氧化反響對心肌細(xì)胞的損害，明顯地改善了缺氧對心肌細(xì)胞的損傷，有效地保持了缺氧培養(yǎng)心肌細(xì)胞內(nèi)膜性構(gòu)造的完好性，從而到達(dá)保護(hù)心肌細(xì)胞免受缺氧損傷的目的。參考文獻(xiàn)：1李建北，林茂.何首烏化學(xué)成分的研究J.中草藥，1993，24(3):115.2江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典，上冊.上海：上海人民出版社，1977：1135.3戴友平，唐國華，郭衍坤.何首烏提取液對犬心肌缺血再灌注損傷的預(yù)防作用實(shí)驗(yàn)研究J.中國生物藥物雜志，1998，19(2):7941.4姜玉順，金鶴松，文永植，等.體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞的初步觀察J.延邊醫(yī)學(xué)院學(xué)報，1982，5(2):75.5Delua,TanneSingnallandJhnAB.Biheialrespnsesfya