Rotor Gene售后培訓(xùn)手冊

1、 1、2、3、4、5、培訓(xùn)日程安排Real-timePCR原理及應(yīng)用講座RG3000儀器簡介儀器安裝及使用培訓(xùn)定量PCR演示試驗軟件基本功能綜述及使用培訓(xùn)二、RotorGene3000熒光定量PCR系統(tǒng)介紹CorbettResearch公司是著名的專業(yè)研制和生產(chǎn)生物儀器的廠家，產(chǎn)品主要包括Rotor-Gene離心式實時定量PCR儀、CAS-1200自動加樣系統(tǒng)等。公司自成立以來一直致力于定量PCR相關(guān)儀器的研究開發(fā)，將創(chuàng)新技術(shù)與精美工藝相結(jié)合，在儀器的性能、軟件、外觀上不斷改進，推出臨床、科研領(lǐng)域的佼佼者，第一臺勻速離心式實時定量PCR儀一一ROTOR-GENE3000熒光定量PCR系統(tǒng)。1系

2、統(tǒng)技術(shù)參數(shù)技術(shù)指標Rotor-gene3O0OClassic型Rotor-gene3000Advanced型通道數(shù)量4通道，可建立新通道2通道，可建立新通道可升級為4通道的Classic型激發(fā)光源470nm,530nm,585nm,625nm,LED光源470nm,530nm,LED光源檢測濾光片510nm,555nm,610nm,660nm,580nm,610nmhp510nm,555nm,610nmhp可檢測熒光Sybr-GreenI；Fam,Tet,Joe,Vic,HEX,Max,Rox，Temra,Cy3,Cy5，Cy5.5、TexRedSybr-GreenI；Fam,Tet,Joe,

3、Vic,HEX,轉(zhuǎn)速500rpm控溫范圍25-99C平均變溫速率最大可達2.5C/second（管間溫度）最大可達5.0C/second（空氣溫度）溫度均一性+/-0.01C控溫準確度+/-0.5C控溫精確度+/-0.1C樣品量36x0.2mL標準PCR反應(yīng)管72x0.1mL四聯(lián)反應(yīng)管尺寸380mm(W)x480mm(D)x315mm(H)電源200-240Vac3Amps(50/60Hz)100-120Vac5AmpsRotor-Gene是一套實時顯示DNA擴增和雜交過程的循環(huán)變溫系統(tǒng)。該裝置能在其36孔轉(zhuǎn)子上容納36個0.2ml的標準離心管。72孔轉(zhuǎn)子配有0.1ml四聯(lián)管。2Rotor-G

4、ene創(chuàng)新的系統(tǒng)結(jié)構(gòu)獨特的離心式設(shè)計最佳的溫度均一性反應(yīng)轉(zhuǎn)子始終都處于低速勻速轉(zhuǎn)動中，保證各樣孔相對位置的完全一致。從而排除因樣孔相對位置差異和反應(yīng)模塊邊緣效應(yīng)引起的溫度不均一性。高效的熱力學(xué)結(jié)構(gòu)無需平衡時間升溫時，頂部金屬加熱器加熱封閉的反應(yīng)艙空氣，降溫時，底部強力排風(fēng)扇迅速排出熱空氣，同時打開頂部氣孔，達到快速空氣交換。開放式轉(zhuǎn)子設(shè)計，保證快速的熱交換，相比其它定量PCR系統(tǒng)，運行速度更高。Awgh即edE匕網(wǎng)IHl才ISpeedac-wEf巧妙的光學(xué)設(shè)計無需ROX內(nèi)參及光學(xué)補償優(yōu)化的獨立的LED激發(fā)光源，保證最小的光譜交叉，離心式的模塊保證每個樣孔受到適合所有定量PCR標記方法：如Syb

5、rGreen,Taqman,MB,FRET,QuenchedFRET,Ampliflour等。開放的試劑系統(tǒng)：無需特定的酶和試劑，使用絕大部分廠家提供的酶和反應(yīng)體系。無需內(nèi)參和特殊反應(yīng)容器：固定的光程和最小的光學(xué)交叉，無需內(nèi)參校正系統(tǒng)；PCR管壁檢測，普通PCR管即可滿足要求。其它專利技術(shù)光學(xué)變性技術(shù)：有助延長酶活性，同時縮短反應(yīng)時間。自動溫度校正：足不出戶，便可對溫度進行自動校正。三、系統(tǒng)安裝與維護1.安裝條件1位置要求：穩(wěn)定水平的操作平臺放置設(shè)備，遠離熱源，避免陽光直射2空間及載重要求：RG3000主機：320cm（長）x480cm（寬）x315cm（高）3重量：17Kg（此外，還需要有放

6、置配套電腦的空間及載重）4.溫度要求：15-35C5電源：90-250VAC6其它：通用插頭接線板2.維護用戶唯一需要做的維護措施是保持透鏡清潔，避免灰塵積累。建議在不使用Rotor-Gene時，蓋子要蓋好以免灰塵落進加熱腔中。反應(yīng)艙側(cè)壁上有透鏡，發(fā)出的光經(jīng)過該透鏡。透鏡應(yīng)避免灰塵，但是如果樣品管不干凈，或是濕的，則有可能在旋轉(zhuǎn)時將灰塵顆粒、水分甩到透鏡上。在透鏡需要清潔時，可將轉(zhuǎn)輪拆下，只要擰松上面的螺帽即可，然后用酒精棉球擦洗（建議由工程師進行），用戶也可以自己用吸耳球?qū)⑼哥R口的灰塵吹出。四、培訓(xùn)所需試劑、儀器及耗材1.試劑1.HBVDNA試劑盒標準品2.Sybr-GreenI演示試劑盒裝

7、機演示時選用其中一種實驗試劑完成實驗。2.儀器及耗材1)臺式離心機2)震蕩混勻器移液器4)0.2mlPCR反應(yīng)管，1.5mlEP管，Tip頭(進口)，乳膠手套等以上物品請用戶提前準備妥當(dāng)，我公司培訓(xùn)人員將使用以上物品進行儀器使用的培訓(xùn)工作。如不具備請及時與培訓(xùn)技術(shù)人員聯(lián)系。五、實驗操作流程實驗?zāi)康模候炞C機器的重復(fù)性、擴增線性及了解機器和軟件的使用及其特點。熒光定量PCR反應(yīng)操作流程（以市售HBV病毒檢測試劑盒為例）：開機，根據(jù)試劑盒條件設(shè)置好PCR反應(yīng)條件配置PCR反應(yīng)混合液實驗設(shè)計體系為：4個濃度梯度稀釋的標準品，1-2組上述樣品重復(fù)組，1個陰性對照除演示外，可指導(dǎo)用戶完成一次實驗方法：Ta

8、qman法I在一個管中混合：（20“體系）HBVPCRBuffer（含探針及引物）Nx15plTaq酶Nx0.2pl（為了防止分液后最后一個管液體不足，為實際PCR體系數(shù)加一。做四個標準品，一個陰性對照,其中一個標準品設(shè)置兩組重復(fù)組，茨個樣品，則2為8）混合液混勻，離心（去除氣泡），向每個PCR反應(yīng)管中分裝15pl。II每管加等量DNA樣品或陰性對照（ddHQ）5ul*，混勻，離心，立即置于RG3000熒光定量PCR儀，進行PCR擴增反應(yīng)。*其中四個管依次加經(jīng)梯度稀釋的標準品（使用前混勻，離心，其中一個加作為陰性對照III實驗條件StageI：hold95C15minStageII：cycle

9、94C20sec,58C20sec,72C20sec,opticson,repeat40Sybr-Green法反應(yīng)體系：根據(jù)實際試劑盒情況進配制，樣品同上實驗條件StageI：hold95C15minStageII：cycle94C20sec,58C20sec,72C20sec,opticson,repeat40StageIII：melt58-95C六軟件使用培訓(xùn)運行Rotor-Gene之前請閱讀以下注意事項：保證樣品放滿36孔或72孔，不足時用空管填滿。保證軟件設(shè)置不在虛擬機狀態(tài)。從vFile進入vsetup可以檢查軟件的狀態(tài)設(shè)置。運行程序前，保證Rotor-Gene處于“READY”狀態(tài)。

10、盡量使用進口的0.2mlPCR管（0.1ml為CorbettResearch公司專配），如使用國產(chǎn)PCR管，一定要使用平頭管蓋PCR管，放入轉(zhuǎn)子后加上RG3000專配的壓環(huán)，將旋鈕轉(zhuǎn)緊后才可以做PCR擴增，新版的機器請將壓環(huán)扣緊。用來做填充管的空管如果每次有壓環(huán)壓住可以不更換，但是如果無壓環(huán)壓牢，則需要在2-3次實驗后更換新的PCR管，以免管蓋彈開。以下是關(guān)于配套軟件RotorGene6的簡要操作說明，便于初次操作的研究者能快速掌握。雙擊軟件圖標，進入軟件操作。軟件打開后會自動彈出NewRun”窗口，選擇合適的程序后單擊new后，進入“NewRunWizard”操作，按提示要求對每個窗口進行設(shè)

11、置,單擊Next進入下一頁面，完成反應(yīng)設(shè)置。注意：如果打開RG-3000時未打開PC機或PC機未裝入RG-3000的操作軟件，則機器會發(fā)出蜂鳴聲直到軟件開始運行，蜂鳴聲才停止。設(shè)置一個反應(yīng)的基本步驟：軟件打開以后自動彈出“NewRun”窗口（見下圖）。選擇了合適的程序以后，按vNew鍵。VctLua.HuickStartidvarosdFeiformLastRunGVBAGreen(R)lDualLatdedProbeQuenchedFRETDbWConcantraiionMeasurementHybiidizdtionCancelRotarGereDenniK.i:OpenAIemplate

12、InfincilheiFolder.Het1疔howthi5creenwhenRator-Eenepens選擇所用的轉(zhuǎn)子類型：36孔或72孑L,并確認沒有使用圓蓋的PCR管。然后單擊Next進入下一步。填入操作者的姓名以及反應(yīng)的備注信息（這兩項可不填）,并鍵入反應(yīng)體積。按Next進入下一步驟。4.選擇“EditProf進入呈序設(shè)置。TcmpcralurePiofie:ThistoKdiEq脈hripondn-nentiritheEaidFarhep口nanitefixhovelMltmixj&aa陽i曲8ilemIdihdpiYaucai日虻cJickanacmtiDbaKIdcfiEplah

13、eipEtcMlil$avaidlezritlrigs.FAM/E-ytcTUnnJOE53JmFIQXSffirm匚丙GSnm5kjpWiz：3rdSluiceD日lecloiGain510rfn555m61LinnEEDhpEdtQaii.RemoYB4.1在EditProfile窗口中，通過lnsertafter.,Insertbefore.,Remove鍵增加或刪除反應(yīng)步驟。要更改每個步驟的內(nèi)容，則先選定該步驟，再對各步驟的溫度，時間設(shè)置進行更改。Insertbefore：允許在選定的項目之前插入一個步驟，比如在循環(huán)體之前加入一個保溫過程Insertafter:允許在選定的項目之后插入

14、一個步驟，比如加入一個熔解曲線Remove:從列表中去除不要的步驟Denature:設(shè)置變性溫度和時間Cycling：設(shè)置循環(huán)體Melt:設(shè)置起止溫度及每一個溫度的持續(xù)時間在設(shè)置“Cycling”內(nèi)容時，窗口如下；該步除對反應(yīng)時間，溫度進行設(shè)置，還需要設(shè)定在哪步讀取熒光，單擊“AcquiringtoCyclingA”或“NotAcquiring”按鈕會彈出“Acquisition”對話框，用v,和vv鍵在兩個窗口中移動通道，所有列在右邊的通道都是機器運行時要采集信號的通道。按0K鍵確認結(jié)束對話。如果在這個循環(huán)步驟不采集熒光，則點擊DontAcquire鍵。通過+,按鈕可以增加或減少Cyclin

15、g中的步驟，每個Cycling最多可設(shè)置5步。點擊“OK回到上一界面。完成以上設(shè)置以后，按vOK鍵結(jié)束“EditProfile”編輯。2d二Thermuiltak已73campleltThegrphbeloKiiqxEehts：theruntabeperloiTred:anFAMJSjjbrED慶Qfoil5汨說NormalG口ed訊耽itPrilu廠LcojFerqeTawchckr/iHC-占guii畑io色Thia匚yrlenpMts：如|linrffs).匚itkm口“cftbtstepbdwjtomtdlvt-dtpi+crtoAddaidremovestepsHthseeIslnw

16、ii.ali.w.MetInsertteforeRemwcCRkcnacytieDetawiomdrII:4.2選擇Calibrate.,允許對每個通道的Gain值進行調(diào)整。A-ato&|*4|口gHz亡ketpeiGauEUfiftunni?aRJ11ULJUK口HfllivlWWfaAKriF；7HnjcekperfereCUrJifK+in1L?916l?9(I.D?謂屋.IG.MI8Hn.iiptwpeiCIJninoMn16E5J|Mil倍代”1.燈町L|9Hz譏Bard匚WriOMfiIET2HddHt.ttpeiyl1G&比d血已鍛AUrfKviri20912B.73015iti

17、il2|1訃1npi+i-Mpffgc呷i_.|11t&wctIntei&stAUnicrKtin2&G410&hie&IrimmlA心Rea0H旦曲AIJri.noHn30H11bent：JIritTKlA|13Ewafle#兇BUr.riuMri21i52117013207D.213|壯fcnflrJInlwJA14曲甜B(yǎng)UriftOHn21SIdCneollhETtE15Bm?dIrfjwpsi.BUnfcnctin213fl11Geiic4lr-JtflE16ReofIE旦！wtCIJn*.nrMn21272942Q4冏C6.馮托|ISfefiflrJBTFDw衛(wèi)cfIfic(泌匚Wr

18、iOMfi29M16GicnedlrtEnwt匚19Go-dd-IntatitCUrJcwHn2SL417已lri4dL：19H.g士crpferwrrNFCISrJIrJiMJcImdIe旦曲NT匚NfC19Hm腦jca：曰benc-NTC為進行ComparativeDelta-deltaCt分析，需要對樣品進行一些編輯。簡而言之，即將目的基因和看家基因分別編輯在兩頁中(page),并將同一樣品命名成相同名稱。在該實驗中，分別對三個樣品A、B、C進行了分析，其中1-9號管檢測了看家基因，10-18號管檢測了目的基因。bettings:Given匚one.ILNamelupeGroupsGiv

19、enCone|3lec:ej1HousekeeperGene4、UrkrownSTHousekeEperGeneAUnkrownY=!S3HousekeeperGeneAUnknownl1HousekeeperGeneBUrkrawnYes5HousekeeperGeneBUrkno-ynYssmHousekeeperGeneBUrknownYes/HousekeeperGeneCUnknownYsseHousekeeperGeneCUrrnwnYes=1HausfikeeperGene匚LJnkrownYes10GeneofInter已歐AUrkno-ynT3S11GeneofInteret

20、i：AUrkrawnYesI?GeneofInterestAUrknownYss13Geneoflntcrcs：tBUrkrownYes可通過NEW新建一個page，并通過Selected選擇每頁中分析的對像。將兩組基因分別編輯在兩頁中，并將相同的樣品命名成同一名稱后，即為下圖所示：基因有限公司基因有限公司 2liLiIdLt,WUfLI.J-:GindiCoiiQ12345?EditUfM|Ccom-ID葩曲CesKtEdktMdI5H41KeMPflUBTCiJZJBMri:5HniRHrepc6rrrCIJri16CUri1勺Hoir：wpe6?re+JTCIJricncwnW30Gar

21、m匚UrtbOMfi函訂_r-HfllpPage1：看家基因，其中1-9號管通過YES選中，樣品分別命名為A、B、C,其它未選中的樣品可以不進行編輯。Page2：目的基因，其中10-18號管通過YES選中，樣品分別命名為A、B、C,其它未選中的樣品可以不進行編輯。樣品編輯好后就可進行分析工作。通過進入Analysis，分別對pagel和page2進行分析。注意：由于沒有標準品，軟件無法自動給出閾值，需用手動設(shè)定，軟件會提示需手動進行閾值設(shè)定，此時只要點中右側(cè)按扭，在熒光曲線圖中上下拖動光標即可。1310HoJj1?1SEE!餌ELopgC砒叔|IsiXXffLflS4ttLQ5L.匡Slr-f

22、CwrrtIdLirt：FirsL創(chuàng)IwaSbIIldusl.Nwni.FlUETd.Fk切Y吞代甲1jiBM2ny-irhnwholdl(r-3Theshdd-Standardlhv:S-CjT：liEA.FV/SytiT(.匚石j*|應(yīng)QuantitAnalysis-CyclinchEAI|)XQuantitstioRAnalysis-Cysslint血FAI.Ekm尿取6：1befae-rJ*u1ISctil.J-LDL1VSca-LJPagtIjP睛215Bc、BjMnBvDFHareduJAiOn村皿Edislhd?-呂.&換選M了III：寧E88!iSI8HmsekeeDeiEen

23、t匚Ajhw|ode廠Aljha-shrinkKrduyJLn-d-US2SldCims(Rd/|trbefraDdtaCTihw.jarftMkfiNoelFkuio.PQuarit.Eexult9-Cycling;JLFWSjiir(-.NaMane-J-Ct|GrvwiCnr：(Tcf1A1&332AUi4no：in16E9EUrJybMin1G72Xulv-S-ZtL-luLl丄LUBTScill.TrGiven匚昨匚叩|CskCcae(Copk|Mm剛27.59UrkrdMn3L49UriyflKin2T.ULlfkrdMnUrirflMn19319.68UrkrdMn4.4D口如巧

24、剛2?.51UrkrdHnI.7D01CatebMixA.JnveiiRawD曲、_i-H(完成兩頁分析之后，再進入DeltaDeltaCT分析界面，選擇show，此時，軟件的向?qū)Ы缑鏁崾臼褂谜咭徊讲酵瓿稍O(shè)置：elatieQuairt.AjnaJ-ysis衛(wèi)煞衛(wèi)餾.匸I.B.創(chuàng)越代衛(wèi)刪瞪回j|口ZalidaticiriRunPerfurmecl口Geneoflnteres：tQuantit曰tian廠INorm曰liwerQu日ntiteti口n匚日lib舊tuD對in&jAuto-shrinkwindowViewReport|ExportGrid|由上至下，依次完成各項設(shè)置。第一項：Val

25、idationRunPerformed,提示是否已驗證過兩個基因的擴增效率一致，可用該定量方法進行分析。選擇Yes；第二項：GeneofInterestQuantitation，選中Page1或Page2中編輯了目的基因的那一頁;第三項：NormaliserQuantitation，選中Page1或Page2中編輯了看家基因的那一頁；第四項：CalibratorDefined，選中A、B、C三個樣品中用來作為對照組的一個。完成上述四項設(shè)置之后，按ViewReport鍵，軟件就根據(jù)用戶的設(shè)置給出分析結(jié)果，如下圖所示：ThisreportgenersdedbyRnlopGenHReal-TimhA

26、nalysisSoftware6.0(Build27)(CJCnrbeHHssdarch3OCM(RJAIBRigMsReserdEiinfc芟歸電E恨IToSwdRelativeQuant.AnalysisDm怙血帖crRunNameSYBRGreen冋12工&11丟CKM4GAPDH-i-ur2DD5-11-361005:33RunFinish-IHII-HIIS-；：-：-OperalorS33NotesRunOnSoflsireVersion.-i:i-111RunSignatureNdRunSignaturefoundRunfileCDnienlsnotguaranteed:nn-，

27、l；”hi10ExpErimEntInfarrnaflnA19403159G33.44IYesB19.0021E.9432.66-a.s1.50C11.2331B.733-5.56-9.DI514.61ColourReplicaleNameGOICTGOICounlNorm.CTNorm.CounlDeltaCTDellaDeha07口elatkeCone,librator結(jié)果給出三個樣品目的基因和看家基因的平均CT值，以及樣品B、C中目的基因的濃度相對于對照組A的比值。2.雙標準曲線法定量流程（RG3000軟件設(shè)置）1用雙標準曲線法定量時，每次每個基因都需要做目的基因和看家基因的標準曲線，必

28、需有一組穩(wěn)定的標準品。2同一樣品做標準曲線，分別對目的基因和看家基因做標準曲線，分列在兩頁上。P1P2穩(wěn)定的梯度稀釋標準品：梯度稀釋的含目的基因的穩(wěn)定的標準品：梯度稀釋的含看家基因的質(zhì)粒質(zhì)?；騊CR產(chǎn)物，并設(shè)類型為Standard，給出濃度或PCR產(chǎn)物，并設(shè)類型為Standard，給出濃度待檢測樣品：擴增目的基因unknown待檢測樣品：擴增看家基因unknown同一待測樣品命名同一名稱，并設(shè)類型為unknown分別分析P1和P2頁選TwoStandardCurve選項依次填入，并定義對照樣品完成分析公式：基因的濃度由軟件根據(jù)標準曲線直接給出待測樣品目的基因濃度待測樣品看家基因濃度對照組目的基

29、因濃度對照組看家基因濃度雙標準曲線法的特點、注意事項及實際應(yīng)用雙標準曲線法做相對定量分析的最大特點是，應(yīng)用簡便，無需像Delta-deltaCT法那樣對實驗進行嚴格的優(yōu)化。其不足之處是每次實驗都必需對目的基因和看家基因做兩組標準曲線。并且，如果用于做標準曲線的標準品不同于樣品，比如標準品為質(zhì)?；蚣兓腜CR產(chǎn)物，而待測樣品為cDNA，那么標準曲線的擴增效率并不能真實地反映樣品的擴增情況，因此以標準曲線來計算樣品的實際濃度就存在一定誤差。應(yīng)用實例：在該實驗中，樣品管1-6為目的基因的標準曲線，7-12為看家基因的標準曲線，待測樣品A、B、C,其中15-17擴增了樣品的看家基因，18-20擴增了樣

30、品的目的基因。在用雙標準曲線法做相對定量之前，同樣需要對樣品進行一些編輯。方法與Delta-deltaCT法類似，即將所有目的基因編輯在一個page里，所有看家基因編輯在另一個page里，且相同的樣品以同樣名稱命名。編輯完成之后即得：樣品編輯好后就可進行分析工作。進入Analysis，分別對pagel和page2進行分析，如上圖。IDHarelagCmpsGh-enCctic.StiKled|1i5erd5.MYes9Hoj5ci-：iijene35ldkda-d25：d1P510日0iij*rw4SlandarrlI.Sflg11引WbE2S節(jié)iH12Has:亡41G亡床&213沁10Hc4

31、jsri-：rq:eiGene-MT匸Uri：jiwjriYts14CrjihrlInmJ-NTCLlnknmwjNoIBAUfilhteMri伽1GE仙1?CUnJiDViTiYts10CefipnllniRrwiiLInknmwiNo13idG列Hr師同BGentiiHf-JtrMlCUnkfiiMWiU4：IiWAiN-jNo|1i5ei(iallri腫刃1SiandarrlICi.Kflg2JSlncW5.KCYk3Gm*Mimed2占lAKXd2.KC治4Uefifr4llNBfl4-Standardl.25fl訕5Gcfiriollnirrwi?SiandarrlGSTp?EQcn

32、flnj|rij6Slff-rird313g|7Hcii：d:aopaiQanwIUfi：hOr-|NoHou5ekeq:ciGene2UricniMvriPio9Hc4jsri-：niGeneUri：jim-riNo10HsflfcflTOiijflnsi4Unknmwi恥11Huj：AApAIGpha5UhOriNd12HmsM:亡GtftfGUrkiiWiNoiaHwsH：上EpeiGenc-NTEUrjiDhjriNo衛(wèi)dcnEnj|rij-rJTCUnknmwjg15Hcii：d:aopaiQanwAUfi：hOr-|No1GHc:epeiGeneBUriziiOMiNg17Hous

33、BikBpeiGene0UnJiDhJTi陥10白Unkumwig13eLI圖d*iW1W制/IcU4:iii1Page1：看家基因，其中7-12號管為標準曲線，通過YES選中，15-17號管為待測樣品，分別命名為A、B、C,其它未選中的樣品可不以不進行編輯。Page2：目的基因，其中1-6號管為標準曲線，通過YES選中，18-20號管為待測樣品，分別命名為A、B、C,其它未選中的樣品可不以不進行編輯。曰513Oti-M1514I1BfJorm.FCucro.IrestiddcyciaDafiultScaIwLriA-arSizaIa廠AitcrdrnkwndowStardad11H口畑由fi

34、fKlGEMStardad12H口畑由fifKlGEMStardadUnkmwn10D1013iq-w1011103iiyli：i3F?=0EC&32M=-3.7igB-51SCOEfrtferc.EeV1Qnantitaticnfinalysis-CyGliinEF&llOXll102ZorcEnirationCpcfcngAFAMJ勻JPage1jPage2ID-WXllcydrgAFAMWytir陽忙R=0.59B14RPYl99Z30M=-5J&6A-2fl379E1ffcferc1I2因SLapaCorrict囪FirstFlor*Ssttinj騎nsolIntei&stE；Gei%

35、oiInteiwt-N10.CA05.CA02.EtlO16.69p.as18.5313.792Q.K22.7725.7523,ffiStanda-dStanda-dStanda-dStardadStardadStardadUnkrownUnkrownInlEiEsk1Inlcicst2InlciEst3InleiKt4Iflteiwt5MLjardL-arvesRelativeAlLaliciiserin:nat:onConjarallueQumtita.tionSctttarGifHphkn-sJsisEadP?intAjialjiisC3Ti：ULtrL3Tikn-sJEiG1TODsk

36、aDetaCTQuail掃6mI1|Type忙1ICiiveriCm匚匸i11須10X1(11幻劃13S細14.3J1J!15.21氐16.112S.O310.62N口|NamrHau5ct：EEp=iGenStandadHau5ct：EEp=iGenStandadHausEkEEpeiGenStandad13H口畑由fifKlGEMUnkmwnBe3eh1x-CycliziEA-FAM/Sjrfar(-nn-CtGivenCcri匚|匚口p|匚匚匚criizC丐*Lirift-arScaIaSmnidliiirdCurire(2蒙匚)血血電A_FAM/Sybr(_F蠡StnndsirdCuz

37、teCyclingA-FU/Syliir(*X完成分析之后，從Other進入，選擇2StandardCurvesRelativeQuantitation。根據(jù)提示向?qū)б来瓮瓿稍O(shè)置。2SndardCurvesRelativeQuaritionAuto-shrinkwindowViei/vReportExportGridelatiQuant-JkiLalysirlNCiE3屆引StBrdBKl匚UWE匚日lib舊怕IDufin日T依次選中目的基因的page、看家基因的page以及對照組（例，以A為對照組），按ViewReport顯示分析結(jié)果，如圖：HoziusukeeperGene19,2361H

38、ousekeeperGene26,1461Hjiseketperusre32,2731HoisekeeperGsre41.1651HoziijgykeeperGene66171Hd：iu3ekeep已rGeneG03291HjLsykbbptirGrr匕一hT二1A137115,3811ILLIVesP7G411D.927182nqC216,64610.C4Guneulnltrtsl1960410beneo-Interesl24bb410GeneofInterest3239710GsngofIntarest41低10GeneofInterest590710beneo-Inttrtslb2231

39、0GeneofInterest-NTC3510%卩l(xiāng)icateName結(jié)果包括計算所得的各標準品及待測樣品的濃度及CT值，以及樣品B、C的目的基因相對于對照組A的濃度。3.ComparativeQuantitation法定量流程（RG3000軟件設(shè)置）1該方法并不常用，因為必需確定起始樣品的總核酸濃度一致。在芯片驗證時使用較多但同樣也必需有起始濃度一致的核酸樣品。2作為常規(guī)的基因表達調(diào)控研究，建議研究者使用前兩種定量方法。3該方法通過拐點時的循環(huán)數(shù)來進行相對定量比較，重復(fù)性更好。4該方法操作非常簡便，無需做標準曲線及設(shè)置內(nèi)參。使用時，樣品均定義為unknown分析時選用ComparativeQuant