DNA生物合成市公開課金獎(jiǎng)市賽課一等獎(jiǎng)?wù)n件

1、DNA復(fù)制All Right Reserved by Liuwanh重慶科技學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院第1頁課程：生物化學(xué)主講：劉萬宏中心法則重點(diǎn)知識(shí)回顧DNA經(jīng)過復(fù)制將遺傳信息由親代傳遞給子代；經(jīng)過轉(zhuǎn)錄和翻譯，將遺傳信息傳遞給蛋白質(zhì)分子，從而決定生物表型。DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯過程就組成了遺傳學(xué)中心法則。第2頁課程：生物化學(xué)主講：劉萬宏DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)重點(diǎn)知識(shí)回顧DNA合成原料是dNTP核苷酸經(jīng)過磷酸3，5-二酯鍵連接DNA中堿基互補(bǔ)配對(duì)第3頁課程：生物化學(xué)主講：劉萬宏DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)重點(diǎn)知識(shí)回顧1.主干鏈反向平行2.側(cè)鏈堿基互補(bǔ)配對(duì)3.立體構(gòu)象雙螺旋第4頁課程：生物化學(xué)主講：劉萬宏問題提出1DNA為

2、何需要復(fù)制？2DNA復(fù)制過程有沒有共性？3DNA復(fù)制過程怎樣？第5頁課程：生物化學(xué)主講：劉萬宏本章內(nèi)容第5節(jié)： DNA損傷與修復(fù) 第4節(jié)：逆轉(zhuǎn)錄和其它復(fù)制方式第3節(jié)：DNA復(fù)制過程第2節(jié)：DNA復(fù)制酶學(xué)第1節(jié)：復(fù)制基本規(guī)律內(nèi)容提要第6頁課程：生物化學(xué)主講：劉萬宏第1節(jié).復(fù)制基本規(guī)律1.1半保留復(fù)制1.1半保留復(fù)制概念半保留復(fù)制（semiconser-vative replication）：DNA在復(fù)制過程中合成新鏈與親代DNA分子堿基次序完全一樣。因?yàn)樽哟鶧NA分子中一條鏈來自親代，另一條鏈?zhǔn)切潞铣桑@種復(fù)制方式稱為半保留復(fù)制。復(fù)制親代DNA子代DNA新合成子鏈第7頁課程：生物化學(xué)主講：劉萬宏

3、第1節(jié).復(fù)制基本規(guī)律1.1半保留復(fù)制半保留復(fù)制試驗(yàn)證據(jù)以15NH4Cl為唯一氮源培養(yǎng)大腸桿菌，使其DNA全部變成15NDNA；Step 1Step 2Step 3Step 4將上述細(xì)菌轉(zhuǎn)入普通培養(yǎng)基（含14NH4Cl）培養(yǎng)；提取各代細(xì)菌中DNA分子；氯化銫密度梯度離心，分析沉降區(qū)域密度。米西爾遜-斯塔爾試驗(yàn) 第8頁課程：生物化學(xué)主講：劉萬宏第1節(jié).復(fù)制基本規(guī)律1.2復(fù)制子與復(fù)制方向概念復(fù)制子(replicon) ：復(fù)制子是獨(dú)立完成復(fù)制功效單位。習(xí)慣上把兩個(gè)相鄰DNA復(fù)制起始點(diǎn)之間距離（或DNA片段）定為一個(gè)復(fù)制子。單向復(fù)制雙向復(fù)制復(fù)制方向第9頁課程：生物化學(xué)主講：劉萬宏第1節(jié).復(fù)制基本規(guī)律1.

4、3需要引物知識(shí)點(diǎn)參加DNA復(fù)制DNA聚合酶，必須以一段含有3端自由羥基（3-OH）RNA作為引物(primer) ，才能開始聚合子代DNA鏈。RNA引物大小，在原核生物中通常為50-100個(gè)核苷酸，而在真核生物中約為10個(gè)核苷酸。RNA引物堿基次序，與其模板DNA堿基次序相配對(duì)。第10頁課程：生物化學(xué)主講：劉萬宏第1節(jié).復(fù)制基本規(guī)律1.4半不連續(xù)復(fù)制35353535解鏈方向領(lǐng)頭鏈(leading strand)隨從鏈(lagging strand)35第11頁課程：生物化學(xué)主講：劉萬宏第1節(jié).復(fù)制基本規(guī)律1.4半不連續(xù)復(fù)制概念領(lǐng)頭鏈(leading strand）以35方向親代DNA鏈作模板子

5、代鏈在復(fù)制時(shí)基本上是連續(xù)進(jìn)行，其子代鏈聚合方向?yàn)?3，這一條鏈被稱為領(lǐng)頭鏈(leading strand)。隨從鏈(lagging strand)以53方向親代DNA鏈為模板子代鏈在復(fù)制時(shí)則是不連續(xù)，其鏈聚合方向也是53，這條鏈被稱為隨從鏈(lagging strand)。岡崎片段(Okazaki fragment)因?yàn)橛H代DNA雙鏈在復(fù)制時(shí)是逐步解開，所以，隨從鏈合成也是一段一段。DNA在復(fù)制時(shí)，由隨從鏈所形成一些子代DNA短鏈稱為岡崎片段(Okazaki fragment)。第12頁課程：生物化學(xué)主講：劉萬宏第2節(jié)：DNA復(fù)制酶學(xué)DNA復(fù)制體系 復(fù)制是在酶催化下核苷酸聚合過程,需要各種物質(zhì)

6、共同參加: 底物：dNTP (dATP、dGTP、dCTP、dTTP) ； 模板(template)：解開成單鏈DNA母鏈； 引物(primer)：提供3-OH末端寡核苷酸（RNA分子）； 聚合酶(polymerase)：依賴DNADNA聚合酶，簡寫為DNA-pol 或DDDP； 其它酶和蛋白質(zhì)因子DNA復(fù)制體系第13頁課程：生物化學(xué)主講：劉萬宏第2節(jié)：DNA復(fù)制酶學(xué)1.解旋解鏈酶拓?fù)洚悩?gòu)酶（解超螺旋酶）：解開DNA超螺旋解鏈酶（解螺旋酶）：解開堿基對(duì)之間氫鍵，形成2股單鏈單鏈DNA結(jié)合蛋白：結(jié)合于單股DNA鏈，阻止DNA復(fù)性,預(yù)防單鏈被核酸酶水解（輔助因子，非酶）2.引物酶：合成一小段RNA

7、引物，用于DNA聚合酶延長子鏈3.DNA聚合酶：在5端由RNA（或DNA）前提下，延長DNA子鏈4.DNA連接酶：在隨從鏈合成過程中，將不連續(xù)DNA子鏈片段連接第14頁課程：生物化學(xué)主講：劉萬宏第2節(jié)：DNA復(fù)制酶學(xué)2.1 解旋解鏈酶拓?fù)洚悩?gòu)酶第15頁課程：生物化學(xué)主講：劉萬宏第2節(jié)：DNA復(fù)制酶學(xué)2.1 解旋解鏈酶解鏈酶解螺旋酶(helicase) ，又稱解鏈酶或rep蛋白，利用ATP供能，作用于氫鍵，使DNA雙鏈解開成為兩條單鏈。每解開一對(duì)堿基，需消耗2分子ATP。單鏈DNA結(jié)合蛋白（single strand binding protein, SSB）又稱螺旋反穩(wěn)蛋白（HDP）。這是一些

8、能夠與單鏈DNA結(jié)合蛋白質(zhì)因子。其作用為： 使解開雙螺旋后DNA單鏈能夠穩(wěn)定存在，即穩(wěn)定單鏈DNA，便于以其為模板復(fù)制子代DNA； 保護(hù)單鏈DNA，防止核酸酶降解。SSB第16頁課程：生物化學(xué)主講：劉萬宏第2節(jié)：DNA復(fù)制酶學(xué)2.2 引物酶引物酶引物酶(primerase)本質(zhì)上是一個(gè)依賴DNARNA聚合酶（DDRP），該酶以DNA為模板，聚合一段RNA短鏈引物(primer)，以提供自由3-OH，使子代DNA鏈能夠開始聚合。第17頁課程：生物化學(xué)主講：劉萬宏第2節(jié)：DNA復(fù)制酶學(xué)2.3 DNA聚合酶DNA聚合酶當(dāng)前發(fā)覺DNA聚合酶有三種，分別命名為DNA聚合酶（pol ），DNA聚合酶（po

9、l ），DNA聚合酶（pol ），這三種酶都屬于含有各種酶活性多功效酶。參加DNA復(fù)制主要是pol 和pol 。第18頁課程：生物化學(xué)主講：劉萬宏第2節(jié)：DNA復(fù)制酶學(xué)2.3 DNA聚合酶pol Ipol 為含有三種酶活性單一肽鏈大分子蛋白質(zhì)，可被特異蛋白酶水解為兩個(gè)片段，其中大片段保留了兩種酶活性,即53聚合酶和35外切酶活性，通常被稱為Klenow fragment。323個(gè)氨基酸小片段53核酸外切酶活性大片段/Klenow 片段 604個(gè)氨基酸木瓜蛋白酶N 端C 端DNA-pol DNA聚合酶活性 35核酸外切酶活性第19頁課程：生物化學(xué)主講：劉萬宏第2節(jié)：DNA復(fù)制酶學(xué)2.3 DNA聚

10、合酶pol IIDNA-pol II基因發(fā)生突變，細(xì)菌依然能存活。 它參加DNA損傷應(yīng)急狀態(tài)修復(fù)。 pol IIIpol 由十種亞基組成不對(duì)稱異源二聚體結(jié)構(gòu)，其中亞基含有53聚合酶活性，含有復(fù)制DNA功效； 亞基含有35外切酶活性，與DNA復(fù)制校正功效相關(guān);亞基是起到滑動(dòng)夾鉗(Sliding clamp)作用，預(yù)防聚合酶在單鏈模板上滑行過程中脫落。功效：是原核生物復(fù)制延長中真正起催化作用酶。 第20頁課程：生物化學(xué)主講：劉萬宏第2節(jié)：DNA復(fù)制酶學(xué)2.3 DNA聚合酶真核細(xì)胞DNA聚合酶種類第21頁課程：生物化學(xué)主講：劉萬宏第2節(jié)：DNA復(fù)制酶學(xué)2.4 DNA連接酶DNA連接酶在復(fù)制中起最終接

11、合缺口作用。在DNA修復(fù)、重組及剪接中也起縫合缺口作用。是基因工程主要工具酶之一。DNA連接酶催化條件 需一段DNA片段含有3-OH，而另一段DNA片段含有5-Pi基； 未封閉缺口位于雙鏈DNA中，其中有一條鏈?zhǔn)峭暾?需要消耗能量第22頁課程：生物化學(xué)主講：劉萬宏第2節(jié)：DNA復(fù)制酶學(xué)DNA復(fù)制酶學(xué)總結(jié)DNA復(fù)制酶學(xué)總結(jié)第23頁課程：生物化學(xué)主講：劉萬宏第3節(jié)：DNA復(fù)制過程（原核）3.1 復(fù)制過程靜態(tài)描述1.復(fù)制起始1）DNA解旋、解鏈、形成復(fù)制叉：拓?fù)洚悩?gòu)酶、解鏈酶及單鏈DNA結(jié)合蛋白；2）RNA引物合成：依賴于單鏈模板，由引物酶催化合成一小段RNA引物； 3）特點(diǎn)：原核環(huán)形DNA通常只有一個(gè)起點(diǎn)，雙向復(fù)制；真核線性DNA含有多個(gè)起點(diǎn)，形成多個(gè)復(fù)制叉2.復(fù)制延長1）子鏈延長：引物合成后，有pol(真核為DNA或)催化，在引物3-OH末端逐一添加與模板鏈對(duì)應(yīng)互補(bǔ)脫氧核苷三磷酸。2）半不連續(xù)合成：a.領(lǐng)頭鏈：鏈延長方向與解鏈方向相同，連續(xù)合成；b.隨從鏈：鏈延長方向與解鏈方向相反，為不連續(xù)合成（產(chǎn)生岡崎片段）3.復(fù)制終止1）水解