細胞生物學實驗手冊：正常細胞與腫瘤細胞常規(guī)核型的標本制備

1、實驗十 正常細胞與腫瘤細胞常規(guī)核型的標本制備【實驗目的】 掌握微量全血培養(yǎng)及正常細胞和腫瘤細胞常規(guī)核型的標本制備技術。了解正常及腫瘤細胞核型的一般特征?！緦嶒炗闷贰?一、材料和標本 健康人的外周血、培養(yǎng)的HeLa細胞和HL60細胞。 二、器材和儀器 超凈臺、煤氣燈、乳膠管、火柴、鑷子、廢液缸、離心機、水浴箱、定時鐘、天平、離心管(10m1)、乳頭吸管、顯微鏡、載玻片、平皿等。無菌器材有培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、注射器(5ml、lml)、注射針頭(7號、 號)、刻度移液管(5ml、2ml、lml)、吸管等。 三、試劑 1640培養(yǎng)液、500單位ml的肝素溶液、10gml的秋水仙素溶液、0.25胰蛋白酶一0

2、.02EDTA混合消化液,O5mgml的PHA溶液、0.075molL的KCl溶液，甲醇、冰醋酸、Giemsa原液、磷酸緩沖液(pH6.8)、生理鹽水等?！緦嶒瀮?nèi)容】 一、微量全血培養(yǎng) (一)原理 人體外周血中淋巴細胞是成熟的免疫細胞，正常情況下處于G。期不再增殖。PHA(Phytohemagglutinin，植物血凝素)是人和其它動物淋巴細胞的有絲分裂刺激劑，它能使處于G0期的淋巴細胞轉化為淋巴母細胞，進入細胞周期開始旺盛的有絲分裂。 人體微量全血培養(yǎng)是一種簡單的淋巴細胞培養(yǎng)方法。此法采血量少、操作簡便，在 PHA作用下進行短期培養(yǎng)即可獲豐富的、有絲分裂活躍的淋巴母細胞，適于制備核型標本。各

3、種因素的效應(如病毒、電離輻射、化學藥劑等)也可在淋巴細胞的培養(yǎng)條件下進行觀察，從而進行多種在體內(nèi)無法進行的研究。因此它是細胞生物學及其它學科研究中的一種有效的方法。 (二)操作 1打開超凈臺紫外燈2030分鐘。洗手、換潔凈白大衣后進入操作室。啟動超凈臺，點燃煤氣燈。用75酒精棉球擦洗手、各種試劑瓶及操作臺面，然后將培養(yǎng)液及肝素、秋水仙素、PHA等所需溶液移入超凈臺。 2在超凈臺內(nèi)將每個培養(yǎng)瓶裝入5ml培養(yǎng)液及0.2ml PHA溶液，封好備用。 3用5ml注射器，7號針頭，先吸取少許肝素濕潤針筒，然后從肘靜脈抽血l2ml。每個培養(yǎng)瓶接種全血O2ml左右輕輕搖動使血和培養(yǎng)液混勻。 4在培養(yǎng)瓶上標

4、記好供血者姓名、性別、采血日期等，放入培養(yǎng)箱中37培養(yǎng)。每天輕輕震蕩培養(yǎng)瓶二、三次，防止血球沉積并保證血細胞與培養(yǎng)液充分接觸，促進細胞生長繁殖。 二、人淋巴細胞染色體標本制備 (一)原理 在淋巴母細胞分裂高峰時加入秋水仙素，破壞細胞紡錘體的形成，使細胞停止在分裂中期。然后收集細胞，低滲處理，使細胞脹大，染色體伸展。接著進行固定并除去中期分裂相中殘存的蛋白質，使染色體清晰且分散良好。再結合離心技術去掉紅細胞碎片，然后采用空氣干燥法制片獲得中期染色體標本。 (二)操作 1微量全血細胞培養(yǎng)至68小時左右，用1ml注射器 號針頭向每個5ml培養(yǎng)瓶內(nèi)加2滴秋水仙素溶液，搖勻后繼續(xù)培養(yǎng)3小時，此項操作不需

5、要嚴格無菌。 2按時終止培養(yǎng)，用吸管溫和吹打成細胞懸液后，移至10ml離心管中。用天平平衡后以1000rpm離心8分鐘，棄大部上清，剩0.5ml。再吹打成細胞懸液，加入預熱37的 0.075molL的KCL溶液9ml，置37水浴中低滲處理30分鐘(這期間配制3:1甲醇一冰醋酸固定液)。 3.向離心管中加入1ml固定液預固定。平衡后以1000rpm離心8分鐘，同樣剩 0.5ml上清。 4輕輕將細胞吹成懸液，加56ml固定液，室溫下固定30分鐘。然后離心，棄上清，重復固定一次。再離心，留0.10.2ml上清，吹打成細胞懸液。 5吸取12滴懸液，在距載片約15cm高度滴于預冷的干凈載玻片上，迅速對準

6、細胞吹氣促進染色體分散。斜放載玻片，在空氣中晾干(此期間配制Giemsa染液，Giemsa原液和磷酸緩沖液1:10)。 6將標本面朝下放在染色槽中，加入染液染10分鐘，自來水沖洗，晾干后觀察。 (三)結果 低倍鏡下，制片質量較好的標本上可看到有較多的分裂相，染色體之間分散良好，互不重疊。 油鏡下觀察可見每一條染色體都含有兩條染色單體，兩條單體由著絲粒相結。分區(qū)計數(shù)染色體數(shù)目并判定性別，或拍照后進行核型分析。 三、腫瘤細胞的染色體標本制備 (一)原理 利用腫瘤細胞無限繁殖的特點，掌握其體外生長動態(tài)，取處于對數(shù)生長期的細胞便可獲得豐富的分裂相。腫瘤細胞染色體異常包括兩個方面： 1結構異常 即在腫瘤

7、細胞常出現(xiàn)的染色體畸變，包括雙著絲點染色體、環(huán)狀染色體、斷裂的染色體、染色體裂隙及微小體等。 2數(shù)目異常 由于腫瘤細胞分裂失去應有的調控，可出現(xiàn)亞二倍體、超二倍體和多一倍體數(shù)目異常現(xiàn)象。 腫瘤細胞染色體制備技術在細胞生物學、醫(yī)學遺傳學的基礎研究和臨床診斷、愈后觀察等方面均有廣泛用途。 (二)操作 l以1.6 105個ml細胞濃度將FL60細胞接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，48小時后以終濃度為0.04gml的秋水仙素處理2.5小時，移入10ml離心管。其余步驟與淋巴細胞染色體制備相同。 2.將長成單層的HeLa細胞按1:2傳代進行培養(yǎng)，36小時后用終濃度為0.04gml的秋水仙素處理3小時。按時終止培養(yǎng)，用0

8、.25胰蛋白酶一0.02EDTA混合消化液處理單層細胞，待細胞收縮變圓時，棄去消化液。加入少許低滲液將細胞從瓶壁洗脫，移入10ml離心管，加入預熱37的低滲液至5 6ml，在37處理25分鐘。以下步驟同淋巴細胞染色體核型制備。 (三)結果 計數(shù)HeLa細胞和HL60細胞的染色體數(shù)并尋找是否有畸變的染色體。附：人體染色體常規(guī)核型的分析 一、人體染色體的觀察 取制備較好的染色體玻片標本，先在低倍鏡下觀察。在標本中選擇一個染色體之間分散較好，互不重疊的中期分裂相，置于視野中央，然后換油鏡仔細觀察。每個染色體都含有兩條染色單體，兩單體連接處為著絲粒。計數(shù)時要把分散的染色體劃分為幾個區(qū)域以免計數(shù)重復或遺

9、漏，然后計數(shù)并判定性別。 二、核型分析的方法 人體染色體常規(guī)核型的分析，在今天的染色體研究水平上作為染色體結構異常的疾病診斷已經(jīng)失去意義，但對染色體數(shù)目異常仍具有診斷上的價值，尤其是起著分析其它幾種顯帶核型的橋梁作用。通過常規(guī)核型的分析必須掌握三點：(一)會分組、(二)了解各組染色體的基本形態(tài)特征、(三)會計數(shù)數(shù)目和鑒定性別。人體染色體的常規(guī)核型即按照Denver會議(1960年)提出的染色體命名和分類標準，將人類體細胞的46條染色體按大小、著絲點的位置分成七組(A、B、C、D、E、F、G、)23對的排列。七組染色體的基本形態(tài)特征及分析順序是： A組是七組染色體中最大的一組，首先找出它。A組包

10、括三對，即第13號6條染色體，第1號為最大、是中央著絲點，長臂近側有次縊痕；第2號第二大、著絲點略偏離中央；第3號為三大，是中央著絲點。 接著確定B組：B組二對即第45號4條染色體，較大，均為亞中著絲點，兩者不易區(qū)分開。 第三確定D組和G組：D組三對即第1315號6條染色體，中等大小均為近端著絲點，短臂末端有隨體。G組二對即第2122號4條染色體，是最小的一組，均為近端著絲點，短臂末端有隨體，長臂常呈分叉狀，21號稍小于22號。Y染色體被隸屬于該組，短臂無隨體，一般較2l、22號大點。 第四確定F組：F組二對即第1920號4條染色體，染色體比G組稍大、均為中央著絲點。染色體分組形態(tài)特征表 第五確定E組：E組三對即第1618號6條染色體，較小，第16號是中央著絲點，17、18號是亞中著絲點。 余者為C組：C組七對即第612號14條染色體，按大小順序依次排列，均是亞中著絲點；X染色體被隸屬該組，大小居67號之間，是亞中著絲點。 上述人的常規(guī)核型中，122號為常染色體，男女共有，另一對為性染色體，決定