中科大高級生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)生化部分

1、GI Purification and Characterization實(shí)驗(yàn)須知每次簽到：上午 和 下午 分別簽。參與實(shí)驗(yàn)全程，主要實(shí)驗(yàn)過程不能輪班。若有課程沖突等其他原因，不能參與實(shí)驗(yàn)，要提前請假， 否則按缺課記錄。若有較多時間不能參與實(shí)驗(yàn)，該小組應(yīng)考慮重新安排實(shí)驗(yàn)時間。兩人一組，不要自行合并小組。實(shí)驗(yàn)記錄試劑配方實(shí)驗(yàn)設(shè)計，流程操作重點(diǎn)，注意事項(xiàng)所遇到的問題，實(shí)驗(yàn)結(jié)果忠實(shí)記錄實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備及實(shí)驗(yàn)過程中的：便于尋找問題，改進(jìn)方法，撰寫論文試劑瓶標(biāo)簽標(biāo)簽內(nèi)容： 試劑名稱 濃度 pH值 配制日期 配制人姓名準(zhǔn)備工作 (2人/組)LB培養(yǎng)基0.2甘油: 500ml，pH7.5 滅菌破碎緩沖液： 20ml

2、4C 貯存 STE緩沖液： 50ml 4C 貯存 TEA （pH8.0） 緩沖液: 10ml半胱氨酸鹽酸鹽: （Cys-HCl) 10mlTCA: 15ml 木糖0.2M（Xylose） 10ml 咔唑 10ml70% 硫酸 250ml 4C 貯存 1000ml 培養(yǎng)瓶用三層錫箔紙封口， 實(shí)驗(yàn)流程性質(zhì)鑒定項(xiàng)目：酶活鑒定（I、II、III步樣品）以下性質(zhì)鑒定用初純化的酶（II）酶的熱穩(wěn)定性：at 80C 最適反應(yīng)溫度最適反應(yīng)pH酶動力學(xué)參數(shù)果糖顯色標(biāo)準(zhǔn)曲線蛋白含量測定（ I、II、III步樣品）SDS PAGE鑒定純化效果并測算 分子量（ I、II、III步樣品）純化流程 I 細(xì)胞破碎：粗酶 I

3、I 70C 15min：初純III 脫鹽 DEAE sepharose FF 柱純化注意： 每步純化要記錄總體積 留樣品用于蛋白含量及SDS 電泳 （100ul于EP管中，標(biāo)記后4C 保存 純化過程中需要收集的數(shù)據(jù)純化步驟總蛋白（mg）總酶活(以O(shè)D數(shù)表示比活 （OD數(shù)/mg）純化倍數(shù)得率（）粗酶熱沉淀 初純酶DEAEFF 純化注意： 1. 每步純化要記錄總體積 2. 留樣品用于蛋白含量及SDS 電泳 （取100ul于EP管中，標(biāo)記后20C 保存 ）菌液的培養(yǎng)條件質(zhì)粒：PTKDGI （野生型） KanaR受體菌：K38 AmpRK38（PTKDGI）的培養(yǎng)需要Kana (100ug/ml)和A

4、mp (100ug/ml) 兩種抗生素接種量：0.3/1000（V/V)30C Overnight42C 熱誘導(dǎo)后，37C繼續(xù)培養(yǎng)2-3hrs， 收菌 洗菌 破碎收菌、洗菌將全部培養(yǎng)液分兩次離心后，全部集中于1個離心管中，用STE充分懸?。ㄕ鹗幓驑尨荡颍?。再離心后懸浮于15ml破碎緩沖液（冷）用于破碎。準(zhǔn)備好要破碎的同學(xué)請帶樣品到339 房間用french press 破碎細(xì)胞。帶一個250ml的燒杯，用于冰浴破碎后的樣品。細(xì)胞的超聲波破碎超聲：高頻，震動，能量 功 率：功率大，破碎效果好，產(chǎn)熱高，蛋白變性多 一般原則：間歇超聲，超聲數(shù)秒鐘，停數(shù)秒鐘，循環(huán)多次 超聲的必要條件：冰水浴，保證最佳

5、的冷卻狀態(tài)。 冰水浴液面略高于樣品液面超聲探頭的位置： 位于樣品液面下1cm我們的超聲條件：功率180W, 超聲 2 秒， 間歇 2 秒 循環(huán)次數(shù)：500700次 (視樣品多少調(diào)整） 純超聲時間：10001400秒 （17min)不正確的超聲：探頭接近液面，引起液面劇烈波動，產(chǎn)生大 量泡沫蛋白變性 探頭接近樣品底部，超聲效果差超聲破碎裝置示意圖冰水浴菌液超聲探頭壓力破碎儀破碎條件：不同的細(xì)胞要求壓力不同， 操作儀器要求專門培訓(xùn)，優(yōu)點(diǎn)： 1. 破碎需要的時間短，過程僅數(shù)分鐘（與樣品量相關(guān)）。 2. 破碎的效果優(yōu)于超聲，特別對細(xì)胞壁較厚的如酵母等效果明顯。 3. 樣品變性情況少于超聲法。注意：同樣

6、有產(chǎn)熱現(xiàn)象，需要樣品冰浴破碎原理： 破碎Cell內(nèi)部高壓將細(xì)胞從很細(xì)小的孔中擠出，細(xì)胞從壓力很高的環(huán)境（最高可達(dá)4萬psi）突然釋放到大氣壓環(huán)境，內(nèi)外巨大的壓差使得細(xì)胞破碎。壓力池內(nèi)部示意圖壓力池常用的糖的顯色反應(yīng)：1. 莫氏（Molish）試驗(yàn)糖經(jīng)濃無機(jī)酸脫水產(chǎn)生糠醛或糖醛衍生物，能與酚類反應(yīng)生成紫紅色縮合物。2. 塞氏（Seliwanoff）試驗(yàn)酮糖在濃酸作用下，生成5羥甲基糠醛，后者與間苯二酚作用，呈紅色。咔唑法咔唑與醛糖酸反應(yīng)顯示紅紫色半胱氨酸HCl 、 乙醇咔唑法測酮糖，顯紅紫色。酶活測定中注意事項(xiàng)正確設(shè)置參照反應(yīng)管：用失活的酶。 （先加反應(yīng)終止 液，再加酶液。）準(zhǔn)確計時，并量取各種

7、試劑： 在進(jìn)行一組反應(yīng)時，先設(shè)計各試劑加量及加入時間，并用表格列出。嚴(yán)格按設(shè)計操作，減少人為誤差。分光光度計測量反應(yīng)液的OD560 ： 一次讀數(shù)后，應(yīng)將反應(yīng)液倒回試管中，以備復(fù)查。 數(shù)據(jù)分析無誤后才能丟棄。光吸收OD560讀數(shù)應(yīng)在分光光度計測量的有效范圍內(nèi)（即：讀數(shù)與濃度呈線形關(guān)系） 0.3 OD560 1.5本實(shí)驗(yàn)酶活測定具體注意事項(xiàng)安全：硫酸. 槍頭、試管等嚴(yán)禁亂甩，亂放。防止燒傷安全：愛護(hù)分光光度計，及時擦洗儀器內(nèi)的任何賤出和 外溢， 3. 安全：隨時清理實(shí)驗(yàn)臺面上的溢出及廢紙。4. 比色皿處理：反應(yīng)液有限，不能潤洗，測量時選擇樣品濃度由低到高進(jìn)行。 每個樣品之間將比色皿倒扣在吸水紙上，

8、輕磕即可。5. 反應(yīng)廢液的處理：所有反應(yīng)廢液不得倒入水池，要回收到指定的回收桶中。統(tǒng)一處理。6. 顯色反應(yīng)：加入硫酸后，要充分混勻（震動），然后在冷水或冰水中充分冷卻后，才開始進(jìn)行顯色反應(yīng)（25 C )酶活相對單位以O(shè)D560表示要換算成“絕對”產(chǎn)物量的單位，則要做標(biāo)準(zhǔn)曲線， 如以不同濃度木酮糖進(jìn)行顯色反應(yīng)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線， 再計算各酶反應(yīng)的產(chǎn)物量。粗酶的制備破碎細(xì)胞（15ml），離心，收集上清， 記錄總體積， 留300ul 粗酶樣品于EP管。其余粗酶于70C 加熱 15min，離心（5000rpm 12min） 收集上清，記錄總體積。測粗酶和初純酶的酶活， 注意測酶活的反應(yīng)體系體積全部減半。反應(yīng)

9、條件不變。反應(yīng)用短的試管做，試劑直接加到底部，酶反應(yīng)混勻要輕緩， 顯色反應(yīng)加硫酸后要充分混勻（可震蕩），冷卻后再加咔唑和CysHCl不要忘了空白對照管！對照管各組分與其它反應(yīng)管所含組分應(yīng)相同！酶學(xué)性質(zhì)鑒定時的酶液用量需要根據(jù)各組所制粗酶的酶活，考慮溫度、pH等因素的影響，進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。使一組反應(yīng)的OD560讀數(shù)大約介于1.01.5之間 若因酶液用量大而影響反應(yīng)體積，則需要考慮換用 4X 或 8X 的反應(yīng)緩沖液，GI 酶反應(yīng)最適溫度測定溫度：55，60，65，70，75，80，85，90 C 共八個溫度點(diǎn)。緩沖體系：反應(yīng)液中Mg2終濃度：5mM 磷酸鈉緩沖液：50mM提供試劑：1. 400mM磷

10、酸鈉緩沖液，pH8.0 2. 40mM MgCl2。取用酶量：依據(jù)所測初純酶的活性，因反應(yīng)溫度較高，每反應(yīng)估計用原酶量的2/3或3/5體積。 酶的用量以樣品的相對酶活（OD值）來衡量酶液0.2M木糖63ul 40mM MgCl232ul400mM磷酸緩沖液32ulH2O 250ul例：如果50ul 初純酶的酶活是OD1.0，本次反應(yīng)可用同樣的酶量。若OD0.5，則建議適當(dāng)加大酶量。若OD1.5，應(yīng)適當(dāng)減少酶的用量。 顯色體系減半GI熱穩(wěn)定性測定溫育溫度：80溫育開始取樣時間：0m，10m，20m，30m，40m， 50m，60m，80m，100m，120m。緩沖體系：反應(yīng)液中Mg2終濃度：5m

11、M TrisHCl pH8.0: 20mM提供試劑：1. 1M TrisHCl pH8.0 (室溫調(diào)） 2. 40mM MgCl2取用酶量：因樣品要在80保溫，建議取用酶量應(yīng)使OD值達(dá)到1.8。酶液 40mM MgCl2 1M Tris-HClH2O 2500ul 請按2500ul設(shè)計總體積(酶反應(yīng)溫度依舊為37 ）每個時間點(diǎn)的取樣量為 210ul， 初酶用量依據(jù)各組酶活而調(diào)整。但每組各時間點(diǎn)的取樣量是不變的。降溫至37 后每個反應(yīng)加 65 ul 0.2M 的木糖 顯色體系減半GI最適反應(yīng)pH 測定1.用50mM TEA、10mM MgCl2 buffer, different pH, 共7個

12、點(diǎn).2. 每個pH反應(yīng)設(shè)一個對照。3.反應(yīng)體系： 在60 C預(yù)熱 150ul pH buffer 40ul 0.2M木糖酶(自定）水總體積250ul4. 60 C反應(yīng)10min 后，加 25ul TCA 終止，5. 顯色: 1.5ml +50ul + 50ul酶用量：每個反應(yīng)有1.5OD。GI酶反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)測定動力學(xué)參數(shù)測定反應(yīng)緩沖體系的最終濃度：5mM MgCl2，25mM TEA （pH7.5）提供1. 40mM MgCl2200mM TEA（pH7.5）buffer， 2. 0.4 M 和0.2M和0.1M木糖（各反應(yīng)的木糖濃度以250ul終體積核算），在滿足第5點(diǎn)的前提下，應(yīng)盡可能用

13、低濃度的木糖母液，以減少操作誤差。各木糖濃度準(zhǔn)備一個參照反應(yīng)管。反應(yīng)體系：37 C 反應(yīng)， 反應(yīng)時間5分鐘 (32ul 8x TEA buffer、木糖、水)=95ul 底物-buffer mix 95ul（底物-buffer mix）+ 酶（自定）+水 250ul終止，50ul TCA， 兩人合作保證每管反應(yīng)時間都是同樣的時間長度顯色： 1.5ml 50ul50ul， 安排每管顯色時間有時間差，并在讀OD值時以同樣的時間差進(jìn)行，減少系統(tǒng)誤差。 將相對酶活（OD值）轉(zhuǎn)換為相對絕對的產(chǎn)物生產(chǎn)量：以250ul不同濃度的果糖代替木酮糖進(jìn)行顯色反應(yīng)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。提供的果糖母液：0.2 M分別稀釋呈終濃

14、度為：20mM，5mM，1mM，0.5mM，0.1mM，0.05mM, 0mM柱層析前要做的準(zhǔn)備工作保留300ul樣品以備用于蛋白含量測定及SDS電泳。上柱樣品的脫鹽：a. 透析，b. 過柱。過柱脫鹽：多選用Sephadex G-25/G-50. 宜在脫鹽后馬上上層析柱。配制不含PMSF的低鹽洗脫液（500ml）和高鹽洗脫液（統(tǒng)一配制100ml/組），過濾全部溶液，于4 C 保存。實(shí)驗(yàn)室提供：1M Tris-HCl buffer , pH7.5PMSF 100mMAspects needs to be considered when choosing gel 凝膠類別選擇：陰/陽, 強(qiáng)/中/弱

15、, 離子型， 不溶性母體粒度與形狀：粗、中、細(xì)， 流速與分離效率交聯(lián)度： 高交聯(lián)度分離小分子 低交聯(lián)度大分子交換容量：可結(jié)合樣品的位點(diǎn)數(shù) 穩(wěn)定性：適用的pH值范圍膠粒的耐壓范圍： 柱長， 流速，正確選擇離子交換劑鹽離子競爭洗脫pH梯度改變樣品電荷洗脫裝柱及平衡膠：DEAE Sepharose Fast Flow 弱陰離子交換劑。 能夠吸附帶負(fù)電的離子，超聲脫氣柱床體積： 25ml柱床要求無氣泡，無斷層。用0.1M NaCl 100ml (抽濾過）洗柱，流速2ml/min用抽濾過的起始緩沖液平衡柱至： 電導(dǎo)=起始緩沖液電導(dǎo)夾住柱下端，吸去柱上多余液體，準(zhǔn)備上樣 樣品脫鹽裝一個10ml的G-25/

16、50小柱，用抽濾過的低鹽緩沖液洗5個床體積后，將離心后的酶液上小柱脫鹽，收集流出液：取150ul于EP管中保存（20度）其余的用于離子交換柱層析。上樣：將樣品加到柱上，控制流速（0.30.5ml/min），開始監(jiān)測流出液，并用一干凈燒杯收集。待所以樣品完全進(jìn)入膠后，往柱內(nèi)加入低鹽buffer(+PMSF)約1cm柱高后，開始低鹽buffer(+PMSF)洗脫直至洗脫曲線走平。改用梯度洗脫，并收集目標(biāo)峰。梯度洗脫：0.1mol/L0.5mol/L NaCl 梯度洗脫即低鹽buffer ：100ml 高鹽buffer ：100ml 流速： 1 ml/min 開始分布收集收集收集的樣品峰用超濾設(shè)備超濾濃縮后測酶活，測蛋白含量，SDSpage鑒定。1. SDS(12.5%)Total volume : 8ml AP & TEMED *26X loading bufferThree